膽汁酸對胃癌細(xì)胞株MKN-28生長的影響*

王學(xué)偉 曹 勤

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院消化內(nèi)科(200062)

膽汁反流入胃甚至食管的現(xiàn)象十分常見[1～3]，可造成胃黏膜腸化生、反流性食管炎、Barrett食管甚至食管腺癌等[4～17]。但膽汁反流致胃部疾病的具體機制仍未闡明。本研究以胃癌細(xì)胞株MKN-28為研究對象，體外觀察脂溶性膽汁酸?；鞘懰徕c（taurolithocholate,TLC）和水溶性膽汁酸甘氨鵝脫氧膽酸鈉（glycochenodeoxycholate,GCDC）對其生長的影響，旨在明確不同膽汁酸對胃癌細(xì)胞生長的直接作用。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑與儀器

胃癌細(xì)胞株MKN-28購自上海市消化疾病研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基、牛血清白蛋白購自Gibco公司；TLC、GCDC、DMSO購自Sigma公司；MTT購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。ELIZA MAT 3000全自動比色儀購自DRG公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將處于對數(shù)生長期的MKN-28細(xì)胞置于培養(yǎng)箱（36.5℃、含5%CO2）。細(xì)胞以1500個/孔接種于96孔板，每孔加入100 μL含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入200 μL無血清培養(yǎng)基。TLC 組加入不同濃度 TLC（6 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L和 300 μmol/L）， 連續(xù)培養(yǎng) 6 d；GCDC 組加入 300 μmol/L GCDC，培養(yǎng)24 h。對照組加入等體積無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間相同。

2.MTT測定：每孔加入20 μL MTT溶液，孵育2 h。棄培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，室溫?fù)u晃5 min。 ELIZA Mat-3000全自動比色儀于570 nm處測定吸光度A值，并于630 nm處測定吸光度A值進行校正，以此反應(yīng)細(xì)胞的生長情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計軟件，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

從第 1～6 d，6 μmol/L TLC對 MKN-28細(xì)胞的生長無顯 著 影 響 。 干預(yù)至第 4 d 起 ，60 μmol/L、100 μmol/L 和300 μmol/L TLC均顯示對MKN-28細(xì)胞生長有抑制作用；至第5 d時，抑制作用最顯著。第6 d時，抑制作用稍減弱（見圖 1A～1C，P<0.05）。 進一步比較 100 μmol/L 與 300 μmol/L TCL對MKN-28細(xì)胞生長的抑制作用，結(jié)果示至干預(yù)的第5～6 d，300 μmol/L TCL組MKN-28細(xì)胞生長的抑制程度明顯強于 100 μmol/L 組（見圖 1D，P＜0.05）。 以上結(jié)果表明，TLC對MKN-28細(xì)胞生長的抑制作用與劑量相關(guān)。

300 μmol/L GCDC干預(yù)24 h，GCDC干預(yù)組的吸光度A值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.0469±0.0059對0.0103±0.0014，P＜0.05）。 由此提示 300 μmol/L GCDC 可明顯抑制MKN-28細(xì)胞生長。

討 論

以往研究發(fā)現(xiàn)，胃大部切除術(shù)易致膽汁反流入胃，是引起胃小凹上皮增生的重要原因，亦可能與殘胃癌等的發(fā)生有關(guān)。近年，隨著膽汁反流監(jiān)測技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床，研究[1～3]發(fā)現(xiàn)即使無上消化道手術(shù)史，膽汁反流入胃甚至食管的現(xiàn)象亦十分常見，并可能與胃黏膜腸化生、反流性食管炎、Barrett食管甚至食管腺癌等的發(fā)生有關(guān)[4～17]。因此，膽汁反流不僅是一種術(shù)后并發(fā)癥，且生理狀況下的過度反流，亦可能參與某些胃和食管疾病的發(fā)生和發(fā)展，因此具有潛在致病作用。Dresner等[10]的研究亦支持上述觀點。但目前膽汁反流致胃部疾病的具體機制尚未完全闡明，本研究觀察脂溶性TLC和水溶性GCDC對體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞株MKN-28生長的影響，旨在明確膽汁反流致胃部疾病的可能機制。

脂溶性膽汁酸TLC和水溶性膽汁酸GCDC是膽汁酸家族的兩大重要成分。其中TLC的水溶性較差，在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中的濃度＞25 μmol/L即會析出，為保持其水溶性，本研究以牛血清白蛋白按4∶1的摩爾比配置TLC溶液，按照預(yù)實驗結(jié)果將TLC濃度設(shè)置為6 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L 和 300 μmol/L。 GCDC 的水溶性較好，可直接溶于RPMI-1640無血清培養(yǎng)基。本課題組的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L 和 200 μmol/L GCDC 對 MKN-28 細(xì)胞生長的影響均不顯著，遂將GCDC劑量增至300 μmol/L，結(jié)果示干預(yù)24 h即可明顯抑制MKN-28細(xì)胞生長。

MTT比色法檢測細(xì)胞死亡率的原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積于細(xì)胞內(nèi)，DMSO可溶解此結(jié)晶，通過酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度A值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。因此本研究采用MTT比色法檢測細(xì)胞死亡，結(jié)果示60 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L TLC干預(yù)至第4 d起，可明顯抑制MKN-28細(xì)胞生長。至第5 d時，抑制作用最顯著；第6 d時，抑制作用稍減弱；300 μmol/L TCL干預(yù)第5～6 d時，對MKN-28細(xì)胞生長的抑制作用明顯強于100 μmol/L。GCDC 300 μmol/L干預(yù)24 h亦可顯著抑制MKN-28細(xì)胞生長。由此提示無論是脂溶性還是水溶性膽汁酸，均可在體外直接抑制胃癌細(xì)胞生長。

近年研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。GCDC誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的過程中，F(xiàn)as（CD95）可發(fā)生不依賴配體的寡聚化激活，通過結(jié)合Fas相關(guān)死亡功能體激活凋亡蛋白酶8，激活一系列下游凋亡蛋白酶，包括組織蛋白酶B，使其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核并發(fā)揮蛋白水解酶活性，從而參與細(xì)胞的凋亡[18,19]。推測本研究中GCDC抑制胃癌細(xì)胞生長與其通過CD95途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)，但還需進一步研究證實。

?；鞘懰?3-硫酸（TLCS）是TLC的脂溶性硫酸化產(chǎn)物[20]，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，其機制可能與活性氧產(chǎn)物激活Src激酶家族成員Yes，后者進一步激活JNK和PKC并活化CD95，由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[20～22]。上述研究提示TLC可能通過Yes-JNK/PKC-CD95途徑促進胃癌細(xì)胞凋亡。

體內(nèi)研究[10]提示長期膽汁反流可致胃小凹上皮增生和反流性食管炎鱗狀上皮增生，并可能與腸化生甚至癌變有關(guān)。與此處TLC和GCDC抑制胃癌細(xì)胞生長，促進胃癌細(xì)胞凋亡的作用不符，由此提示長期膽汁反流可能存在間接作用機制，通過克服膽汁酸對胃上皮細(xì)胞生長的直接抑制作用而促進其增生，但目前其中的機制尚不明確，還需進一步研究證實。

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