邵建國 羅蕾蕾 陳 琳 吳月平 陳 建 孫源源彭美娣張 建
南通市第三人民醫(yī)院消化科1(226006) 檢驗科2 南通大學護理學院3 如皋市人民醫(yī)院普外科4
腹水按性質(zhì)可分為良性腹水和惡性腹水,明確腹水的性質(zhì)對于疾病治療及其預后判斷具有重要臨床意義。腹水脫落細胞學檢查是目前確診腹水性質(zhì)的金標準,但敏感性較低[1~3]。近年來,多種腹水指標得到廣泛研究,以探討其對腹水性質(zhì)的鑒別診斷意義。本研究選取端粒酶、DNA倍體、腺苷脫氨酶(ADA)、乳酸脫氫酶(LDH)、腫瘤標記物CEA、CA125、CA19-9、CA153、血清-腹水白蛋白梯度(SAAG)九項腹水指標,建立腹水性質(zhì)鑒別診斷的logistic回歸模型并探討其診斷價值。
連續(xù)納入2010年3~12月南通市第三人民醫(yī)院、南通市腫瘤醫(yī)院、如皋市人民醫(yī)院腹水患者103例,綜合實驗室檢查(腹水常規(guī)、腹水腫瘤標記物等)、影像學檢查(B 超、CT、MRI等)、腹水脫落細胞學檢查、臨床評估、手術病理等明確腹水性質(zhì)和病因,其中惡性腹水均經(jīng)腹水脫落細胞學檢查找到癌細胞。惡性腹水組50例,男23例,女27例,年齡45~82 歲,平均(62.9±8.9)歲,其中消化系腫瘤 41例,卵巢癌9例。良性腹水組53例,男28例,女25例,年齡 36~74 歲,平均(60.4±8.2)歲,其中肝硬化48例,結核性腹膜炎3例,腎病綜合征2例。兩組間性別構成、年齡差異無統(tǒng)計學意義。
1.標本采集:常規(guī)腹腔穿刺采集腹水200 mL。取20 mL腹水,1000×g離心20 min,取部分上清即刻行ADA、LDH、白蛋白檢測;另取部分上清-80℃保存,待測端粒酶、CEA、CA125、CA19-9、CA153。取100 mL腹水檸檬酸鈉抗凝,1000×g離心10 min,棄上清,PBS洗滌3次,1000×g離心10 min, 取細胞懸液,調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml,75%乙醇4℃封存,待測DNA倍體。采集腹水當日晨空腹抽取靜脈血3 mL,1000×g 離心 10 min,分離血清,待測白蛋白。
2.端粒酶檢測:按TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA試劑盒(Roche Diagnostics)說明書進行操作,使用Wellscan K-3酶標儀(雷勃公司)于450 nm處讀取A值。
3.DNA倍體分析:使用Beckman-Coulter EPICS XL流式細胞儀(Beckman Coulter,Inc.)。以新鮮分離的健康體檢者外周血淋巴細胞(T、B細胞)DNA熒光信號主峰值作為二倍體細胞DNA含量參考值,應用Multicycle DNA含量與細胞周期分析軟件分析并繪制直方圖。出現(xiàn)與正常人新鮮淋巴細胞DNA所示二倍體細胞主峰完全分離的熒光信號峰(DNA指數(shù)≠1)定義為陽性,提示受檢腹水中含DNA異倍體細胞。
4.ADA、LDH、白蛋白檢測:使用 HITACHI 7170全自動生化分析儀(HITACHI公司)和相應試劑盒(上海復星長征醫(yī)學科學有限公司),按試劑盒說明書進行操作。SAAG為血清與腹水白蛋白含量的差值。
5.CEA、CA125、CA19-9、CA153 檢 測 : 使 用Abbott AxSYM全自動免疫分析儀和相應試劑盒(Abbott Laboratories.),按試劑盒說明書進行操作。
以兩組間差異有統(tǒng)計學意義的腹水指標為自變量(均事先轉(zhuǎn)換為二分類變量),以腹水性質(zhì)為因變量(良性=0,惡性=1)行單因素logistic回歸分析,判斷各單項指標對腹水性質(zhì)的鑒別診斷意義。其中連續(xù)型變量腹水指標應用受試者工作特征(ROC)曲線計算各指標的最適診斷界點(cut-off point),將各指標按各自的最適診斷界點劃分,轉(zhuǎn)換為二分類變量(陰性=0,陽性=1);DNA倍體分析結果根據(jù)是否檢出異倍體轉(zhuǎn)換為二分類變量(陰性=0,陽性=1)。
選取單因素logistic回歸分析顯示有鑒別診斷意義(α=0.10)的腹水指標行多因素logistic逐步向前回歸分析,得到logistic回歸模型并計算出每個病例對應的概率預測值P,根據(jù)P值的ROC曲線確定最適診斷界點及其鑒別診斷腹水性質(zhì)的診斷效率。
惡性腹水組腹水端粒酶、LDH、CEA、CA125、CA19-9、CA153明顯高于良性腹水組,SAAG明顯低于良性腹水組,差異均有統(tǒng)計學意義;兩組間腹水ADA差異無統(tǒng)計學意義(見表1)。
良性腹水組DNA異倍體少見,惡性腹水組可見三倍體、六倍體等異倍體(見圖1),異倍體比例明顯高于良性腹水組,差異有統(tǒng)計學意義(見表1)。腹水DNA異倍體診斷惡性腹水的敏感性為76.0%(38/50),特異性為 79.2%(42/53)。
選取良性腹水組與惡性腹水組間差異有統(tǒng)計學意義的連續(xù)型變量腹水指標,分別繪制ROC曲線,得出相應曲線下面積(AUC),以最靠近左上角的點(敏感性與特異性之和最大)作為最適診斷界點(見表2)。根據(jù)最適診斷界點,將各指標轉(zhuǎn)換為二分類變量。
表1 良、惡性腹水組各項腹水指標比較
表2 連續(xù)型變量腹水指標ROC曲線相關結果
單因素logistic回歸分析顯示,納入分析的各項腹水指標對腹水性質(zhì)均有鑒別診斷意義(見表3),均納入多因素logistic回歸分析。
表3 單因素logistic回歸分析
經(jīng)多因素logistic逐步向前回歸分析,端粒酶(X1)、CEA(X2)、CA153(X3)、SAAG(X4)四項 腹水指標進入 logistic回歸模型(見表4),P=1/[1+e–(–6.320+2.315 X1+2.338 X2+4.246 X3+3.459 X4)](P 為概率預測值,e為自然對數(shù))。
表4 多因素logistic回歸分析
根據(jù)ROC曲線得出概率預測值P的AUC為0.986,最適診斷界點為0.469,敏感性為96.0%,特異性為98.1%(見圖2)。P≥0.469時,預測診斷為惡性腹水;P<0.469時,預測診斷為良性腹水。
良、惡性腹水的鑒別診斷具有重要臨床意義,目前臨床上用于鑒別診斷腹水性質(zhì)的指標眾多,包括腹水常規(guī)、酶學指標、腫瘤標記物、DNA倍體、腹水脫落細胞學檢查等,各項指標均有一定的診斷敏感性和特異性,但尚無任何單項指標兼具敏感性和特異性優(yōu)勢,具體到某個病例,這些指標不一定能呈現(xiàn)出傾向性一致的結果。因此,臨床醫(yī)師一般依據(jù)經(jīng)驗對腹水性質(zhì)作出診斷,此種診斷方式顯然并不客觀。
目前大多數(shù)研究偏向于采用平行試驗或序列試驗證明多項指標聯(lián)合檢測的敏感性或特異性優(yōu)于單項檢測,但這兩種診斷性試驗模式均無法兼顧敏感性和特異性[2,4]。采用多因素logistic回歸分析逐步篩選相關性較好的指標并建立回歸模型,是評估聯(lián)合檢測中各項指標對診斷的貢獻程度和聯(lián)合檢測診斷效率更為合適的方法。應用單因素、多因素logistic回歸分析和ROC曲線,張焜和等[3]從血常規(guī)、血生化、胸/腹水常規(guī)和生化指標以及血清腫瘤標記物中篩選出4項指標建立診斷模型,發(fā)現(xiàn)該模型對胸/腹水性質(zhì)的鑒別診斷有較高價值,敏感性(89.2%)和準確性(85.8%)均高于腹水脫落細胞學檢查(68.6%和81.6%)和染色體檢查(65.1%和82.1%);鄢斌等[5]從胸/腹水和血清白蛋白、LDH、CEA、ADA及其濃度梯度或比值中篩選出3項指標建立診斷模型,鑒別診斷胸/腹水性質(zhì)的敏感性、特異性、準確性分別為87.5%、86.8%、87.0%,大大提高了診斷的科學性和準確性。上述研究結果證實了應用logistic回歸分析建立診斷模型的優(yōu)勢,由此建立的診斷模型尤其適用于臨床。因此,本研究選取端粒酶、DNA 倍體、ADA、LDH、CEA、CA125、CA19-9、CA153、SAAG 九項腹水指標,應用 logistic回歸分析和ROC曲線建立診斷模型并探討其對腹水性質(zhì)的鑒別診斷價值。
正常體細胞(除生殖細胞、造血干細胞)中端粒酶活性受抑,在永生化細胞株和癌細胞中,端粒酶再次激活,研究顯示85%~90%的實體瘤中存在端粒酶活性[6,7],因此端粒酶是一個不受組織器官限制的腫瘤標記物。鄧志華等[8]發(fā)現(xiàn)肝硬化、結核性腹膜炎患者的腹水脫落細胞中均不能檢出端粒酶活性,而癌性腹水端粒酶陽性率為85.29%。楊幼林等[1]發(fā)現(xiàn)良性腹水端粒酶陽性率顯著低于惡性腹水(10%對90%),端粒酶活性診斷惡性腹水的敏感性、特異性、準確性分別為90.0%、90.0%、94.8%。證實腹水端粒酶活性檢測可作為臨床腹水性質(zhì)鑒別診斷的依據(jù)之一。本研究發(fā)現(xiàn)腹水端粒酶診斷惡性腹水的敏感性為84.0%(最適診斷界點:A值0.0915),與國內(nèi)其他研究[1,8]結果相似。
正常體細胞DNA二倍體含量穩(wěn)定,而癌變過程中(癌前病變或癌組織)常伴隨細胞DNA含量異常。惡性胸/腹水有一定數(shù)量的癌細胞分裂象,可有明顯染色體異常,因此出現(xiàn)DNA異倍體細胞峰是診斷惡性腹水的依據(jù)之一。常規(guī)脫落細胞學檢查系根據(jù)細胞形態(tài)學改變作出判斷,有一定的主觀性,而實體瘤細胞DNA含量的變化早于形態(tài)學改變,且為客觀量化指標,故其結果較脫落細胞學檢查更為可靠。本研究中腹水脫落細胞DNA倍體分析診斷惡性腹水的敏感性為76.0%,明顯高于常規(guī)脫落細胞學檢查(45%~68.6%[1~3])。
ADA是一種與機體細胞免疫活性有重要關系的核酸代謝酶。結核桿菌能激活T細胞,故結核性腹水中ADA活性顯著升高,腹水ADA活性可作為結核性腹膜炎的診斷性指標之一。Burgess等[9]發(fā)現(xiàn)ADA診斷結核性腹膜炎的敏感性、特異性分別為94%、92%(最適診斷界點30 U/L)。本研究中結核性腹膜炎病例數(shù)過少(僅3例),良、惡性腹水組間腹水ADA活性差異無統(tǒng)計學意義。
LDH是一種糖酵解酶,細胞損傷時會釋放大量LDH,惡性腫瘤組織破壞嚴重,因此LDH可用于腹水性質(zhì)的鑒別診斷。Sevinc等[10]發(fā)現(xiàn)惡性腹水LDH水平顯著高于良性腹水,腹水LDH診斷惡性腹水的敏感性、特異性分別為96%、76%。然而本研究發(fā)現(xiàn)腹水LDH診斷惡性腹水的敏感性、特異性分別為58.0%、98.1%(最適診斷界點 215.5 U/L),與Sevinc等[10]的研究結果有一定差異。
CEA、CA125、CA19-9、CA153均為腫瘤標記物,當各部位腫瘤轉(zhuǎn)移至腹膜引起惡性腹水時,腹水中相關腫瘤標記物水平明顯升高,可用于惡性腹水的輔助診斷。本研究中惡性腹水組上述腫瘤標記物水平均顯著高于良性腹水組,用于惡性腹水的診斷時,CA153的敏感性、特異性(90.0%、90.6%)相對高于其余3個腫瘤標記物。
SAAG為血清與腹水白蛋白含量的差值,通常SAAG≥11 g/L提示腹水為門靜脈高壓所致(肝硬化常見),而SAAG<11 g/L提示非門靜脈高壓性腹水(如惡性腫瘤、結核性腹膜炎等)。Al-Knawy[11]發(fā)現(xiàn)以SAAG鑒別診斷肝臟疾?。ǚ蔷凭裕┮鸬母顾行詾?1%。本研究中SAAG診斷惡性腹水的敏感性、特異性分別為92.0%、79.2%(最適診斷界點12.45 g/L)。
本研究最初選取的9項腹水指標中,除ADA外,其余8項指標在良、惡性腹水組間差異均有統(tǒng)計學意義。由ROC曲線的AUC可見端粒酶、CEA、CA153、SAAG診斷惡性腹水的準確性相對較高。將各連續(xù)型變量腹水指標根據(jù)最適診斷界點轉(zhuǎn)換為二分類變量,DNA倍體分析結果根據(jù)是否檢出異倍體轉(zhuǎn)換為二分類變量,對各指標行單因素logistic回歸分析,結果顯示8項指標均具有良好的相關性。進一步對這些指標行多因素logistic回歸分析,最終進入logistic回歸模型的指標為腹水端粒酶、CEA、CA153、SAAG。將個體病例這4項指標的檢測結果代入回歸模型,計算出對應于每個病例的概率預測值P,根據(jù)P值的ROC曲線確定其最適診斷界點為0.469,即個體病例P≥0.469時,預測診斷為惡性腹水,P<0.469時,預測診斷為良性腹水。新變量P的AUC為0.986,明顯大于各單項腹水指標(0.761~0.943),表明該診斷模型鑒別診斷腹水性質(zhì)的準確性優(yōu)于各單項指標,敏感性亦明顯高于各單項指標(96.0%對56.0%~92.0%),特異性與單項指標中最高的腹水LDH相同。提示與各單項腹水指標相比,應用本研究建立的多項腹水指標logistic回歸模型鑒別診斷腹水性質(zhì)可提高診斷敏感性和準確性。本研究中腹水脫落細胞DNA倍體未能進入診斷模型,但這并不意味著該指標沒有臨床應用價值,后續(xù)研究擬擴大樣本量進一步明確其是否可納入腹水性質(zhì)鑒別診斷模型。
綜上所述,本研究應用logistic回歸分析和ROC曲線建立了腹水性質(zhì)鑒別診斷的多項腹水指標logistic回歸模型,該診斷模型克服了臨床診斷腹水性質(zhì)的主觀性,使診斷客觀化、標準化,與各單項腹水指標相比,明顯提高了診斷敏感性和準確性。由于本研究樣本量較小,納入的可能引起腹水的疾病種類并不全面。引起惡性腹水的常見實體瘤尚有乳腺癌、肺癌、前列腺癌等,非實體瘤如惡性淋巴瘤等亦可引起惡性腹水,引起良性腹水的疾病尚有胰腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、細菌性腹膜炎、慢性心功能衰竭等,本研究雖未收集到這些疾病引起的腹水病例,但有關文獻[2,3,8,10,12]表明本研究最初選取的腹水指標(除ADA外)對鑒別上述病因引起的腹水仍有一定意義。此外,本研究選取的腹水相關指標亦不多。因此,后續(xù)擬進一步開展大樣本研究,盡可能納入更多病因引起的腹水病例,分析更多與腹水相關的指標,使腹水性質(zhì)鑒別診斷模型趨于完善,以期最終應用于臨床。
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