細(xì)胞外低滲誘導(dǎo)大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2容積激活性氯電流和調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮*

劉振鋒， 厲冰雪， 滕雙鳳， 羅 海， 林 娜， 黃維淵， 朱林燕， 王立偉△， 陳麗新△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)系，2藥理學(xué)系，廣東廣州510632)

容積激活性氯通道廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞上，參與細(xì)胞的多種生理和病理過程的調(diào)節(jié)。我們前期在鼻咽癌以及白血病細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，容積敏感性氯通道在細(xì)胞的調(diào)節(jié)性容積回縮(regulatory volume decrease，RVD)過程中起重要作用，并參與了細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等過程［1－4］。近年來(lái)研究顯示，容積激活性氯通道和許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在心肌缺血、心肌肥大、心臟衰竭以及高血壓引起的血管重塑過程中起重要作用［5］。大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株是研究心肌細(xì)胞功能活動(dòng)的常用細(xì)胞株，為心臟的生理病理研究提供了便利，以往有學(xué)者用之探討心肌細(xì)胞鉀離子通道和鈣離子通道的功能活動(dòng)［6－7］，但目前未見該細(xì)胞株是否存在容積激活性氯通道的報(bào)道。本研究探討細(xì)胞外低滲刺激是否可以誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞容積激活性氯電流，研究該細(xì)胞的調(diào)節(jié)性容積回縮過程，這有助于闡明心肌細(xì)胞容積激活性氯通道的功能和調(diào)節(jié)性容積回縮能力，為了解容積激活性氯通道在心臟疾病的發(fā)生與發(fā)展中所起的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株用含10%FBS、1×105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM生長(zhǎng)液(Gibco)常規(guī)培養(yǎng)在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每2 d傳代1次。

2 主要試劑

氯通道阻斷劑他莫昔芬(tamoxifen)、5－硝基－2－(3－苯丙胺)苯甲酸［5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)benzoic acid，NPPB］和ATP均購(gòu)自Sigma。Tamoxifen在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用甲醇新鮮配成 40 mmol/L母液，使用時(shí)用相應(yīng)的灌流液稀釋至終濃度20 μmol/L。NPPB用DMSO配成100 mmol/L儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存在4℃冰箱中，使用時(shí)用相應(yīng)的灌流液稀釋至終濃度 100 μmol/L。ATP用蒸餾水配成 100 mmol/L儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存在－20℃中，實(shí)驗(yàn)終濃度為10 mmol/L。

3 灌流液與電極內(nèi)液

等滲灌流液(isotonic solution，ISO)滲透壓為300 mOsmol/L，含(mmol/L):70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和140 D－mannitol。低滲液(hypotonic solution，HYPO)滲透壓為160 mOsmol/L，除不含甘露醇外，其它成分和濃度與等滲灌流液相同。高滲液(hypertonic solution，HYPER)滲透壓為440 mOsmol/L，含280 D－mannitol，其余成分與等滲灌流液相同。各灌流液分別用Tris液調(diào)pH至7.4。灌流液配制畢后，用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)(Osmomat 030; Gonotec，Germany)檢測(cè)溶液滲透壓。

電極內(nèi)液組成(mmol/L):70 N－methyl－D－glucamine chloride(NMDG －Cl)，1.2 MgCl2，10 HEPES，1 EGTA，140 D－mannitol和2 ATP，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.25。微電極充灌電極內(nèi)液后尖端電阻為(5～10)MΩ。

4 全細(xì)胞膜片鉗

用EPC－7膜片鉗放大器(List Electronic，Germany)記錄H9c2細(xì)胞的全細(xì)胞電流。電流和電壓信號(hào)用CED1401(Cambrige，UK)數(shù)字化(采樣頻率3 kHz)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EPC(CED，Cambridge，UK)軟件分析。

H9c2細(xì)胞用0.125%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，并滴于玻片上，待細(xì)胞貼壁牢固后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。電壓鉗制模式有2種:(1)細(xì)胞被鉗制在0、－40、+40、－80、+80 mV，并不斷反復(fù)循環(huán)，每個(gè)鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s，在每個(gè)鉗制脈沖開始10 ms后取值;(2)鉗制電壓－120 mV～120 mV，步增20 mV，每個(gè)鉗制脈沖波寬300 ms，間隔1 s，在每個(gè)鉗制脈沖開始10 ms后取值。在每個(gè)脈沖開始。先用等滲液灌流細(xì)胞5 min，記錄此時(shí)背景電流，再用低滲液給予細(xì)胞刺激，同時(shí)記錄電流。在電流增大至穩(wěn)定后，改換含不同氯通道阻斷劑的低滲液繼續(xù)灌流，待電流被抑制平穩(wěn)時(shí)計(jì)算電流的抑制率。

阻斷劑對(duì)電流抑制率的計(jì)算公式為:

抑制率(%) = ［(IHYPO－IISO) － (IBLOCKERSIISO)］/(IHYPO－IISO)×100%。其中IHYPO是47%HYPO作用到穩(wěn)定時(shí)電流;IISO是等滲灌流時(shí)電流;IBLOCKERS是47%HYPO加入阻斷劑至作用穩(wěn)定時(shí)電流。

5 細(xì)胞體積測(cè)量

將細(xì)胞消化后制成懸液滴于玻片上，貼壁牢固后置于顯微鏡下拍圖。實(shí)驗(yàn)分為低滲組和NPPB組，低滲組先將細(xì)胞用等滲灌流液灌流10 min，然后更換低滲液繼續(xù)灌流;NPPB組先將細(xì)胞用等滲灌流液適應(yīng)5 min，加入含100 μmol/L NPPB繼續(xù)灌流5 min，然后更換為含等濃度NPPB的低滲液灌流35 min，全程灌流45 min。

實(shí)驗(yàn)完成后用圖像分析軟件(Image－Pro Plus 6.3)測(cè)量細(xì)胞的面積，從而間接測(cè)量細(xì)胞的直徑，再轉(zhuǎn)換成細(xì)胞容積V后，對(duì)細(xì)胞容積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。取細(xì)胞灌流1～5 min的體積均值作為初始體積V0。

細(xì)胞容積V、標(biāo)準(zhǔn)化體積Vst和細(xì)胞RVD能力的計(jì)算公式分別為:

其中，Vmax為細(xì)胞最大時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)化體積，Vend為細(xì)胞在第45 min的標(biāo)準(zhǔn)化體積。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sE)表示，用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)均數(shù)差異顯著性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 細(xì)胞外低滲誘導(dǎo)大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2容積激活性氯電流

采用全細(xì)胞記錄模式記錄H9c2細(xì)胞的跨膜電流。等滲條件下，可以記錄到一基礎(chǔ)電流，該基礎(chǔ)電流微小且穩(wěn)定。在+80 mV和－80 mV電壓鉗制下，其平均電流密度分別為(5.30±0.80)pA/pF和 (－4.82±0.85)pA/pF(n=30)。當(dāng)將等滲液換為低滲液進(jìn)行細(xì)胞灌流時(shí)，跨膜電流迅速增大，最后穩(wěn)定在峰值。平均電流密度分別為(47.77±3.80) pA/pF和(－33.36±2.80)pA/pF(n=30，P＜0.01)，內(nèi)向電流較外向電流為小，表現(xiàn)出外向優(yōu)勢(shì)。其翻轉(zhuǎn)電位是(－9.02±0.61)mV，見圖1A、B。

在鉗制電壓為±120 mV，電壓間距20 mV，鉗制脈沖波寬為300 ms時(shí)，電流并沒有表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性失活和電壓依賴性失活，見圖1C。

2 低滲誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氯電流的容積敏感性

在低滲誘發(fā)的電流達(dá)到峰值并平穩(wěn)后，換用47%高滲液灌流，電流明顯減小。高滲液對(duì)外、內(nèi)向電流的抑制率分別為:(100.17±1.34)%和(98.44 ±1.74)%(n=9，P＜0.01)。這說(shuō)明該電流是具有容積敏感性的，其可被低滲灌流液誘導(dǎo)產(chǎn)生，又可被高滲灌流液抑制，見圖2。圖2A為低滲灌流誘導(dǎo)容積激活性電流的全程圖，圖2B為細(xì)胞平均電流密度與鉗制電壓之間的關(guān)系，圖2C、D分別為該電流在低滲及高滲灌流液作用下的瞬時(shí)電流圖。

Figure 1.Chloride currents activated by hypotonicity in H9c2 cells.A:typical time course of the current activated by hypotonicity.B: current－voltage relationship.±sE.n=30.＊＊P＜0.01 vs ISO.ISO:isotonic control solution;HYPO:hypotonic bath solution.C:typical current traces recorded in hypotonic solution.圖1 低滲激活的H9c2全細(xì)胞氯電流

Figure 2.Inhibition of hypotonicity－activated chloride currents by hypertonic bath solution in H9c2 cells.A:typical time course of the chloride currents induced by hypotonicity and inhibition of the currents by cell shrinkage induced by the hypertonicity.B:current－voltage relationship.±sE.n=9.＊＊P＜0.01 vs HYPO.C:typical current traces recorded in hypotonic solution.D:typical current traces recorded in hypertonic solution.圖2 高滲液抑制低滲激活的氯電流

3 氯通道阻斷劑抑制低滲激活的氯電流

為了進(jìn)一步分析氯通道在低滲刺激誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞電流中的作用，我們觀察了氯通道阻斷劑對(duì)低滲激活的H9c2細(xì)胞氯電流的影響，發(fā)現(xiàn)該電流均可以被tamoxifen、NPPB和ATP這3種氯通道阻斷劑不同程度抑制。

在+80 mV和－80 mV鉗制電壓時(shí)，tamoxifen抑制低滲液激活的氯電流，其對(duì)外內(nèi)向電流的抑制率分別為:(73.96±6.70)%和(76.51±4.64)%(n= 7，P＜0.01)。圖3A、B、C、D分別為tamoxifen抑制低滲激活的氯電流全程圖、電流密度－電壓關(guān)系、低滲及tamoxifen作用下的瞬時(shí)電流圖。

Figure 3.Inhibition of hypotonicity－activated chloride currents by chloride channel blocker tamoxifen in H9c2 cells.A:typical time course of the chloride current induced by hypotonicity and inhibition of the currents by tamoxifen(20 μmol/L).B:current－voltage relationship.±sE.n=7.＊＊P＜0.01 vs HYPO.C:typical current traces recorded in hypotonic solution.D: typical current traces recorded in hypotonic solution containing tamoxifen.圖3 氯通道阻斷劑tamoxifen抑制低滲激活的氯電流

NPPB可以抑制該容積敏感性電流，見圖4。其對(duì)外內(nèi)向電流的抑制率分別為:(81.12±6.11)%和(79.06±7.64)%(n=5，P＜0.01)。圖4A、B、C、D分別為NPPB抑制低滲激活的氯電流全程圖、電流密度－電壓關(guān)系、低滲及NPPB作用下的瞬時(shí)電流圖。

Figure 4.Inhibition of hypotonicity－activated chloride currents by chloride channel blocker NPPB in H9c2 cells.A:typical time course of the chloride currents induced by hypotonicity and inhibition of the currents by NPPB(100 μmol/L).B:currentvoltage relationship.±sE.n=5.＊＊P＜0.01 vs HYPO.C:typical current traces recorded in hypotonic solution.D:typical current traces recorded in hypotonic solution containing NPPB.圖4 氯通道阻斷劑NPPB抑制低滲激活的氯電流

ATP顯著抑制該容積敏感性電流，見圖5。其對(duì)外、內(nèi)向電流的抑制率分別為:(91.94±2.78)%和(40.01±8.80)%(n=6，P＜0.01)，其對(duì)外向電流的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)內(nèi)向電流的抑制作用。圖5A、B、C、D分別為ATP抑制低滲激活的氯電流全程圖、電流密度－電壓曲線、低滲及ATP作用下的瞬時(shí)電流圖。

NPPB和tamoxifen灌流液中分別含有相應(yīng)濃度的DMSO和甲醇，為排除兩者的影響，用0.1%DMSO及0.05%甲醇的47%低滲灌流液分別作用于H9c2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)電流無(wú)明顯改變。

4 低滲誘導(dǎo)心肌細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積回縮及氯通道阻斷劑對(duì)心肌細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積回縮的影響

低滲液在H9c2細(xì)胞中誘發(fā)明顯的RVD。在等滲液灌流下，細(xì)胞容積穩(wěn)定，當(dāng)灌流液從等滲液換為低滲液時(shí)，細(xì)胞迅速增大，在低滲液作用于細(xì)胞5 min時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)細(xì)胞容積增加至(147.82±4.57)%(n =8)，隨后容積逐漸減小，低滲35 min時(shí)細(xì)胞容積減少為(115.55±3.86)%(n=8，P＜0.01)。RVD使細(xì)胞容積回復(fù)(69.73±8.83)%，見圖6A、C。

細(xì)胞在含NPPB的等滲灌流液中輕微脹大。更換含NPPB的低滲液(HYPO+NPPB)繼續(xù)灌流，觀察到細(xì)胞迅速脹大，HYPO+NPPB作用5 min時(shí)細(xì)胞容積為(142.82±4.03)%，與低滲組細(xì)胞容積的最大值(147.82±4.57)%比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后細(xì)胞體積較穩(wěn)定，未見明顯細(xì)胞容積回縮。HYPO+NPPB作用35 min時(shí)，細(xì)胞體積為(149.19±9.06)%(n=8)，與低滲組比較，兩者在45 min時(shí)的體積差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖6B、C。

Figure 6.Chloride channel blocker NPPB inhibited the RVD process in H9c2 cells.ISO:isotonic bath solution;HYPO:hypotonic bath solution;HYPO+NPPB:hypotonic bath solution containing 100 μmol/L NPPB.A:cell images taken in the isotonic solution(ISO)and 47%hypotonic solution for 5 min(HYPO 5 min)and 30 min(HYPO 30 min);B:cell images taken in the isotonic solution containing NPPB(ISO+NPPB)and 47%hypotonic solution containing NPPB for 5 min(HYPO+ NPPB 5 min)and 30 min(HYPO+NPPB 30 min);C:inhibition of RVD by chloride channel blocker NPPB in H9c2 cells.±sE.n=8.＊＊P＜0.01 vs HYPO.圖6 氯通道阻斷劑NPPB抑制H9c2心肌細(xì)胞的調(diào)節(jié)性容積回縮過程

討論

細(xì)胞容積維持相對(duì)穩(wěn)定是細(xì)胞進(jìn)行正常生理活動(dòng)的必要條件。心肌細(xì)胞需有一定的容積調(diào)節(jié)能力，使其在遭受內(nèi)外滲透壓變化時(shí)仍能維持自身容積的相對(duì)穩(wěn)定，氯通道在這一生理調(diào)節(jié)過程中起著重要作用。不僅如此，在某些病理?xiàng)l件下，如心肌缺血、心力衰竭、心律失常等可以記錄到激活的容積激活性氯電流，這說(shuō)明，其在心臟的病理過程中也具有重要意義［8］。心肌缺血時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化磷酸化途徑受抑，ATP生成減少，鈉離子、水以及代謝產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)堆積，造成細(xì)胞內(nèi)高滲，引起心肌細(xì)胞水腫，激活容積激活性氯通道從而產(chǎn)生RVD，可能對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。文獻(xiàn)提示，缺血前處理可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞的RVD能力［9］，缺血預(yù)適應(yīng)可以增加心臟組織對(duì)缺血缺氧的耐受性，對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。預(yù)處理心肌由于缺血缺氧，心肌細(xì)胞發(fā)生腫脹，可以激活心肌細(xì)胞上的容積激活性氯通道，保護(hù)缺血再灌注過程中的心肌細(xì)胞，使得心臟組織在再次缺氧缺血時(shí)避免容積的過度增大［10］。因此，容積激活性氯通道在心肌缺血時(shí)發(fā)揮重要作用，其可能成為心肌缺氧缺血治療藥物的一個(gè)新靶標(biāo)。在肥大心肌也觀察到容積激活性氯電流的激活［5］，這提示，容積激活性氯通道不僅可能參與了心臟的急性損傷過程，其也可能參與了某些心臟慢性疾患的發(fā)生發(fā)展。

本研究中，我們使用H9c2細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察細(xì)胞在低滲刺激誘導(dǎo)的容積激活性氯電流特性和調(diào)節(jié)性容積回縮。結(jié)果表明，灌流低滲液后可觀察到H9c2細(xì)胞容積迅速脹大，并激活一個(gè)具有外向優(yōu)勢(shì)的跨膜電流，由于灌流液與電極內(nèi)液配方不含鉀離子，且由Nernst公式計(jì)算出的鈉離子和鈣離子的平衡電位均大于200 mV，因此可以基本排除電流與這 3種離子的關(guān)系。該電流可被 tamoxifen、NPPB、ATP等多種氯通道阻斷劑抑制，這提示低滲在H9c2細(xì)胞上激活的電流為氯電流。且計(jì)算出的平衡電位較接近氯離子的平衡電位，高滲灌流液可以抑制這個(gè)電流，表明該電流有容積敏感性。該電流不表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依從性失活與電壓依賴性失活，該電流的電生理學(xué)特性和藥理學(xué)特性與我們前已報(bào)道的白血病細(xì)胞及低分化鼻咽癌細(xì)胞容積激活性氯電流的特性相似［11－12］。H9c2細(xì)胞在低滲環(huán)境中發(fā)生脹大，激活容積激活性氯通道，氯離子外流，伴隨水外流，導(dǎo)致細(xì)胞容積減小，即產(chǎn)生調(diào)節(jié)性容積回縮。用氯通道阻斷劑NPPB抑制H9c2細(xì)胞容積激活性氯電流的同時(shí)也抑制了該細(xì)胞RVD過程，表明低滲刺激可以在H9c2細(xì)胞上誘發(fā)RVD，容積激活性氯通道在這一過程中起關(guān)鍵作用。

我們前期研究顯示，許多抗腫瘤藥物作用于細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡時(shí)，能激活氯電流，該電流生理特性與容積激活性氯電流相似，也可以被高滲灌流液完全抑制，具有容積敏感性［13－14］。氯通道阻斷劑能拮抗抗癌藥引起的細(xì)胞凋亡，提示氯通道參與抗腫瘤藥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程［4］?？鼓[瘤藥是否可通過作用于容積敏感性氯通道誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生心臟毒性，仍需進(jìn)一步的深入研究。研究H9c2心肌細(xì)胞的容積敏感性氯通道的特性，有助于闡明氯通道在心肌生理及病理功能活動(dòng)中的作用。

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