木通皂苷D通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞*

張云輝， 劉成成， 祝愛珍， 陳小宇， 劉革修， 何冬梅， 譚廣銷

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院校門診部，2醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東廣州510632)

木通皂苷D通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞*

張云輝1△， 劉成成2， 祝愛珍2， 陳小宇2， 劉革修2， 何冬梅2， 譚廣銷2

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院校門診部，2醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東廣州510632)

目的:探討木通皂苷D(ASD)是否促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為成骨細(xì)胞及其機制。方法:分離培養(yǎng)大鼠BMSCs;觀察ASD對其向成骨細(xì)胞分化的影響以及p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)抑制劑SB203580和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)抑制劑PD098059的干預(yù)作用;檢測BMSCs分化過程中堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OC)含量;實時熒光定量PCR檢測護骨素(OPG)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)mRNA的表達;Western blotting法檢測p38 MAPK和ERK活性水平。結(jié)果:ASD處理后第9 d，成骨性分化標(biāo)志物OPG mRNA表達量明顯增高，RANKL mRNA的表達量明顯降低，同時顯著提高BMSCs分化為成骨細(xì)胞的ALP活性和OC的表達，而且p38 MAPK和ERK活性也顯著增加。SB203580和PD098059則顯著抑制ASD的成骨作用。結(jié)論:ASD在體外具有促進大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用，這一作用與MAPK途徑的p38 MAPK和ERK蛋白有關(guān)。

木通皂苷D;間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨細(xì)胞;分化;信號通路

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)亦稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone mar-row stromal cells，BMSCs)，主要存在于機體骨髓腔中，具有干細(xì)胞特性，具有多向分化能力［1－3］。其向成骨分化特性是骨組織工程、骨折修復(fù)和骨質(zhì)疏松等研究的理論基礎(chǔ)。木通皂苷D(Akebia saponin D，ASD)是續(xù)斷、木通藥材的主要活性成分，又稱川續(xù)斷皂苷IV，具有明確的藥理活性［4］，主要用于制備防治骨質(zhì)疏松和/或促進骨愈合的藥物。有研究表明，ASD可促進成骨細(xì)胞增殖、分化，提高成骨細(xì)胞的活性和數(shù)量，促進基質(zhì)鈣化、骨痂生長，從而防止骨質(zhì)疏松、促進骨折的愈合［5］。目前研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化，主要通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal－regulated kinase 1/2，ERK1/2)和p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38 MAPK)信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，Runx2則調(diào)節(jié)下游成骨性標(biāo)志物的表達，例如護骨素(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor－kappa B ligand，RANKL)等，促進MSCs的成骨分化［6－9］。本研究觀察ASD是否促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及其對ERK和p38 MAPK活性的影響。

材料和方法

1 材料

4周齡雄性SD大鼠購自中山大學(xué)實驗動物中心;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco;青霉素和鏈霉素購自華北制藥;細(xì)胞裂解液、地塞米松、β－甘油磷酸鈉和DMSO購自Sigma;SB203580和PD098059購自Gibco;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥有限公司;ERK1/2、p－ERK1/2、p38和p－p38抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 按照文獻［9］，取4周齡雄性SD大鼠利用頸椎脫臼法處死，然后用75%乙醇浸泡5 min，在無菌條件下分離出兩側(cè)股骨及脛骨，剔除干凈表面附著的肌肉、筋膜等組織，剪去股骨近端和脛骨遠端，充分暴露骨髓腔，用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，1 000 r/min離心8 min，棄上清，混成細(xì)胞懸液，約2 ×106個細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記為原代P0，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液以去除未貼壁細(xì)胞和各種雜質(zhì)，加入5 mL新鮮完全培養(yǎng)液。此后每隔2～3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，直至細(xì)胞接近80%匯合時進行傳代。此后每隔3～4 d傳代1次。取第4代細(xì)胞進行MSCs鑒定:成骨分化采用茜素紅染色、成脂分化細(xì)胞采用油紅O染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測表面標(biāo)記CD44和CD45。

2.2 ASD對BMSCs成骨分化的影響 取第4代已鑒定的BMSCs為研究對象，根據(jù)不同實驗需要將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入成骨誘導(dǎo)液(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素、10－8mol/L地塞米松、10 mmol/L β－甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸的DMEM低糖培養(yǎng)基)培養(yǎng)。觀察不同濃度的ASD對BMSCs成骨分化的影響:實驗分6組，A組:空白對照組，正常培養(yǎng)MSCs;B組:實驗對照組，成骨誘導(dǎo)分化MSCs;C組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)+ASD(0.1 μmol/L);D組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)+ ASD(1.0 μmol/L);E組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)+ASD(10 μmol/L);F組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)+ASD(1.0 μmol/ L)+SB203580(20 μmol/L)+PD098059(50 μmol/ L)。1.0 μmol/L ASD是根據(jù)預(yù)實驗分析得出的實驗適合濃度。

2.3 ALP活性的測定 取已鑒定的BMSCs，以1× 108/L的密度接種于96孔板，每孔100 μL，設(shè)5個復(fù)孔。各組于成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、6、9和12 d測定ALP活性，檢測時將細(xì)胞洗滌后以0.2%Triton X－100裂解液及反復(fù)凍融法充分裂解，裂解液經(jīng)低溫離心機12 000×g離心10 min，取上清50 μL，按試劑盒說明書進行操作，于酶標(biāo)儀520 nm波長處測定ALP值。ALP活性以mmol·L－1·min－1·(g protein)－1表示。

2.4 采用ELISA法檢測骨鈣素(osteocalcin，OC)的含量 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后每3 d換液1次，每次換液時留取1 mL舊培養(yǎng)液，于－20℃保存，收集第3、6、9和12 d各組的樣品，采用ELISA法檢測骨鈣素的分泌量，以μg/L表示，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

2.5 成骨性分化基因表達 收集第12 d各組的細(xì)胞，用Trizol試劑按照常規(guī)方法抽提總RNA，采用A260/A280比值來確定總RNA的質(zhì)量，并用2%瓊脂糖電泳檢測其完整性。應(yīng)用隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，按常規(guī)方法進行。使用SYBR PremixEx TaqTMReal－time PCR試劑盒配制20 μL PCR反應(yīng)體系，采用實時熒光定量PCR法檢測成骨性基因OPG mRNA、RANKL mRNA表達情況。反應(yīng)條件為:熒光定量PCR 93℃3 min，然后93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個循環(huán)。以目的基因擴增量/內(nèi)參照(β－actin)基因擴增量表示所要檢測基因的表達量。OPG/RANKL mRNA的相對表達量以公式2－ΔCt表示，其中ΔCt=Ct(OPG/ RANKL)－Ct(β－actin)。實時定量PCR引物及探針:OPG:sense strand(5'－3')CGGCACATTGGACATGCTAA;anti－sense strand(5'－3')TCCCGGTAAGCTTTCCATCA;probe(5'－3')FAM－TCACCTTCGAGCAGCTTCGTAGC－TAMRA。RANKL:sense strand(5'－3')CGATGGTGGATGGCTCATG;antisense strand(5'－3')TGAGCAAAAGGCTGAGCTTCA; probe(5'－3')FAM－TTAGATCTGGCCAAGAGGAGCAAGC－TAMRA。β－actin:sense strand(5'－3') GCGCGGCTACAGCTTCA;anti－sense strand(5'－3') TCTCCTTAATGTCACGCACGAT;probe(5'－3')FAM－CACCACGGCCGAGCGGGA－TAMRA。

2.6 Western blotting檢測ERK和p38 MAPK的表達及活性 細(xì)胞處理48h后，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液，4℃裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進行蛋白定量。50 μg總蛋白經(jīng)SDS－PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g/L脫脂牛奶常溫下封閉1 h，用Ⅰ抗ERK1/2(1∶1 000)、p38(1∶1 000)、p－ERK1/2 (1∶1 000)、p－p38(1∶1 000)、β－actin(1∶5 000)分別4℃孵育過夜，用TBST洗3次，每次10 min，加入Ⅱ抗(1∶2 500)孵育1.5 h，再用TBST洗3次，每次10 min。將膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

骨髓細(xì)胞接種24 h后，大部分細(xì)胞仍然懸浮，少量細(xì)胞貼壁生長、呈梭形，細(xì)胞生長緩慢，2～3 d后增殖加快，7 d左右達融合。通過傳代、常規(guī)貼壁法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，第3代細(xì)胞形態(tài)單一，呈梭形，可見集落形成，細(xì)胞增生活躍。第4代細(xì)胞進行成骨成脂分化鑒定顯示可以分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，見圖1;流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44表達率為93.50%，CD45表達率為0.21%。

Figure 1. The BMSCs isolated from rat bone marrow(×200).A:the primary cells;B:the fourth generation cells;C: oil red O staining after adipogenic induction of differentiation;D:alizarin red staining after osteogenic induction of differentiation.圖1 分離培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

2ASD對BMSCs ALP活性影響

常規(guī)成骨誘導(dǎo)分化的細(xì)胞在第3、6、9和12 d均表達ALP，且逐漸增加，其活性與正常MSCs相比差異顯著(P＜0.01);低劑量ASD對細(xì)胞成骨分化則作用不明顯，在第3、6、9和12 d ALP活性與常規(guī)成骨分化相比無顯著差異(P＞0.05);中、高劑量ASD則促進MSCs成骨分化，在第3、6、9和12 d ALP活性與常規(guī)成骨分化相比差異顯著 (P＜0.01)，中、高劑量ASD之間無顯著差異(P＞0.05);p38 MAPK抑制劑 SB203580(20 μmol/L)和 ERK抑制劑PD098059(50 μmol/L)則抑制MSCs成骨分化，第3、6、9和12 d ALP活性與其它成骨分化組相比差異顯著(P＜0.01)。

3 ASD對BMSCs誘導(dǎo)分化過程中OC分泌的影響

A組在第3、6、9和12 d僅有微量OC生成;B組在第3、6、9和12 d OC含量與A組相比差異顯著(P＜0.01);D組在第3、6、9和12 d OC含量明顯增多，與B組相比差異顯著(P＜0.01);F組在第3、6、9、12 d OC含量明顯降低，與B、D組相比差異顯著(P＜0.01)，見圖1。這說明1.0 μmol/L ASD對MSCs成骨分化具有促進作用。

4 ASD對 BMSCs誘導(dǎo)分化過程中 OPG與RANKL表達的影響

正常培養(yǎng)的MSCs幾乎不表達OPG和RANKL mRNA，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞在第9 d表達了一定量的OPG mRNA和RANKL mRNA，兩者比值為1.52±0.45;1.0 μmol/L ASD則可以進一步促進其OPG mRNA的表達，兩者比值增加為3.87±1.20，與實驗對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而SB203580(20 μmol/L)和PD098059(50 μmol/L)則可顯著抑制OPG的表達，兩者比值增加為1.13± 0.32，分別與B、D組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

表1 ASD對BMSCs成骨分化過程中堿性磷酸酶活性的影響Table 1.Effects of Akebia saponin D(ASD)on ALP activity of BMSCs during differentiation to osteoblasts［mmol·L－1·min－1·(g protein)－1.珋x±s.n=5］

表2 ASD對BMSCs成骨分化過程中骨鈣素分泌的影響Table 2.Effects of ASD on osteocalcin secretion of BMSCs cells during differentiation to osteoblasts(μg·L－1.珋x±s.n=5)

5 ASD對BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中ERK和p38 MAPK的影響

成骨誘導(dǎo)分化過程中ASD(1.0 μmol/L)處理的細(xì)胞不僅表達ERK和p38 MAPK水平總量顯著增加，而且p－ERK1/2和p－p38 MAPK也顯著增加。SB203580(20 μmol/L)和PD098059(50 μmol/L)則可顯著抑制p－ERK1/2和p－p38 MAPK水平，見圖3。

討論

BMSCs具有多向分化潛能，能促進間充質(zhì)組織的再生，如:骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)等組織。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，但是在骨髓中，BMSCs占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.1%，含量極低。因此，體外培養(yǎng)獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，已經(jīng)成為骨組織工程等的研究熱點。

骨組織由細(xì)胞和骨基質(zhì)組成。骨質(zhì)疏松癥是一種系統(tǒng)性骨病，主要是由于成骨細(xì)胞形成不足和破骨細(xì)胞吸收亢進所致的骨重建失衡。ALP是主要分布于細(xì)胞膜的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白，一種較為肯定的成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，促進細(xì)胞成熟、鈣化，它的表達和分泌會隨著細(xì)胞的分化而增強，ALP活性越強表明成骨細(xì)胞骨形成的狀況越好。骨鈣素是骨質(zhì)鈣化必需的因子，維持骨組織的正常礦化。ALP和骨鈣素分別是成骨細(xì)胞早期和中期分化的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs用成骨誘導(dǎo)液加1 μmol/L ASD培養(yǎng)，在細(xì)胞分化過程中堿性磷酸酶和骨鈣素合成較對照組增多，說明ASD可促進BMSCs向成骨細(xì)胞分化。研究結(jié)果還顯示，BMSCs在ASD作用后第9 d，堿性磷酸酶和骨鈣素合成最多，說明ASD在細(xì)胞內(nèi)起作用的時間需要9 d左右。

MAPK是一系列絲氨酸/蘇氨酸激酶，是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，包括3個信號途徑蛋白: ERK、c－Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK。它們可激活多種轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控基因表達，在細(xì)胞增殖、分化、運動及凋亡等多種生理過程中起著至關(guān)重要的作用［10－12］。

Figure 2. Effects of ASD on expression of OPG/RANKL during BMSCs differentiation.A:normal control;B:osteogenic differentiation;D osteogenic differentiation+ASD(1.0 μmol/L);F:osteogenic differentiation+ASD(1.0 μmol/L)+SB203580(20 μmol/L)+PD098059(50 μmol/L).珋x±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs A group;##P＜0.01 vs B group;△△P＜0.01 vs D group.圖2 BMSCs分化過程中ASD對BMSCs OPG/RANKL的影響

Suzuki等［13］研究發(fā)現(xiàn)，以MAPK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨細(xì)胞的活化中最為重要，MAPK通路主要參與成骨細(xì)胞的分化，破骨細(xì)胞的形成和凋亡，并且在RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)中具有主要的調(diào)控作用，是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要細(xì)胞信號途徑。

Giner等［14］研究表明，成骨細(xì)胞能分泌OPG和RANKL，具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、發(fā)育的作用，其與破骨細(xì)胞上的RANK形成了一個骨調(diào)節(jié)軸，RANK是RANKL的唯一受體，RANK介導(dǎo)的信號是破骨細(xì)胞分化、活化的一道關(guān)鍵閘門。OPG抑制骨吸收功能通過與RANKL競爭性結(jié)合RANK來實現(xiàn)，其中OPG扮演RANKL的誘餌性受體角色。RANKL與RANK結(jié)合后啟動 RANKL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，OPG則與RANKL競爭性結(jié)合RANK，RANKL/OPG濃度比決定破骨細(xì)胞分化、成熟及功能。因此，RANKL、RANK和OPG形成了一個調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、成熟、功能的軸，這個調(diào)節(jié)軸也是影響破骨細(xì)胞分化、發(fā)育，調(diào)節(jié)其功能唯一的、最終的途徑，在多種骨質(zhì)疏松中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)ASD可以上調(diào) BMSCs OPG mRNA表達，下調(diào)RANKL mRNA表達，使得OPG/ RANKL比值升高;另外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)分化過程中川續(xù)斷皂苷VI(1.0 μmol/L)處理的細(xì)胞表達ERK和p38 MAPK水平總量顯著增加，說明ASD可能通過上調(diào)OPG/RANKL，使得ERK和p38 MAPK通路蛋白增加，進而誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

Figure 3. Effects of ASD on expression of p－ERK1/2 and p－p38 MAPK during BMSCs differentiation.A:normal control;B:osteogenic differentiation;D:osteogenic differentiation+ASD(1.0 μmol/L);F:osteogenic differentiation+ASD(1.0 μmol/ L)+SB203580(20 μmol/L)+PD098059(50 μmol/L).珋x±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs A group;##P＜0.01 vs B group;△△P＜0.01 vs D group.圖3 ASD對BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中ERK和p38 MAPK的影響

本研究提示，ASD可以促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并可以上調(diào)OPG/RANKL，增加ERK和p38 MAPK蛋白表達，對于探討外傷、骨折后利用ASD治療，促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，促進骨愈合的機制具有重要意義。

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Akebia saponin D promotes differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts through MAPK signaling pathways

ZHANG Yun－h(huán)ui1，LIU Cheng－cheng2，ZHU Ai－zhen2，CHEN Xiao－yu2，LIU Gexiu2，HE Dong－mei2，TAN Guang－xiao2
(1Campus Clinic，the First Affiliated Hospital，2Institute of Hematology，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E－mail:z001yh@163.com)

AIM:To explore the role of Akebia saponin D(ASD)in the differentiation of rat bone marrowderived mesenchymal stem cells(BMSCs)into osteoblasts.METHODS:The rat BMSCs were cultured using routine methods.The effects of ASD on the differentiation of MSCs into osteoblasts were observed.The p38 mitogen－activated protein kinase(p38 MAPK)inhibitor SB203580 and extracellular signal－regulated kinase(ERK)inhibitor PD098059 were used to evaluate the mechanisms.The activity of alkaline phosphate(ALP)and content of osteocalcin(OC)were assayed during differentiation.The mRNA expression of osteoprotegerin(OPG)and receptor activator of nuclear factor－κB ligand(RANKL)was determined by real－time fluorescence quantitative PCR.The activity of p38 MAPK and ERK was measured by Western blotting.RESULTS:Six days after treatment with ASD，the mRNA expression of OPG significantly increased，while the mRNA level of RANKL significantly decreased in induced cells.ASD increased the activity of ALP and the content of OC.Moreover，ASD enhanced the activity of both p38 MAPK and ERK，which was inhibited by SB203580 and PD098059.SB203580 and PD098059 also inhibited the positive role of ASD in the differentiation of MSCs into osteoblasts.CONCLUSION:Akebia saponin D significantly enhances differentiation of rat BMSCs into osteoblasts in vitro，which may be mediated by the p38 MAPK and ERK signaling pathways.

Akebia saponin D;Mesenchymal stem cells;Osteoblast;Differentiation;Signaling pathway

R332

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2012.08.021

1000－4718(2012)08－1455－06

2012－04－09

2012－06－13

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30670902)

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