七氟醚預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心功能障礙的影響*

李健玲， 朱小青， 李學(xué)敏， 李紅梅， 王彥平， 王 媛， 戚仁斌△， 李雅蘭△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院麻醉科，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510632)

七氟醚預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心功能障礙的影響*

李健玲1， 朱小青2， 李學(xué)敏2， 李紅梅2， 王彥平2， 王 媛2， 戚仁斌2△， 李雅蘭1△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院麻醉科，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510632)

目的:觀察七氟醚(Sevo)預(yù)處理對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的心功能障礙的影響并初步探討其作用機(jī)制。方法:40只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(control)、LPS組、Sevo組和Sevo+LPS組。分別用2% Sevo(以純氧為載氣)或純氧預(yù)處理30 min，洗脫10 min后，腹腔注射LPS 18 mg/kg或等量生理鹽水。于腹腔注射后12 h，通過(guò)高分辨小動(dòng)物超聲系統(tǒng)檢測(cè)心功能，結(jié)束后立即采血并處死小鼠，用生化分析儀檢測(cè)血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK－MB)活性;留取小鼠心臟標(biāo)本，制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色后在光學(xué)顯微鏡上觀察各組小鼠心臟的組織結(jié)構(gòu)變化，分別用硝酸還原酶法和比色法檢測(cè)小鼠心肌組織中一氧化氮(NO)的含量和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。結(jié)果:LPS腹腔注射后12 h，超聲檢測(cè)顯示LPS組小鼠左心室舒張末期容積(LVEDV)增大(P＜0.05)，每搏輸出量(SV)、心輸出量(CO)和射血分?jǐn)?shù)(EF)降低(P＜0.05);血清LDH和CKMB水平升高(P＜0.05);病理切片見心肌明顯病變。Sevo+LPS組與LPS組比較，LVEDV減小(P＜0.05)，SV、CO和EF增加(P＜0.05)，LDH和CK－MB水平顯著降低(P＜0.05)，心肌組織的病理?yè)p傷減輕。LPS引起心肌組織中NO含量和iNOS活性升高(P＜0.05)，Sevo對(duì)此有抑制作用(P＜0.05)。結(jié)論:Sevo預(yù)處理減輕LPS引起的心肌損傷和心功能障礙，其機(jī)制可能與其抑制心肌iNOS活性，減少NO的生成有關(guān)。

七氟醚;預(yù)處理;脂多糖類;心肌保護(hù);一氧化氮合酶;一氧化氮

臨床上約有25%～30% 的膿毒癥是由G－菌感染引起的，其細(xì)胞壁的主要成分內(nèi)毒素(endotoxin)或脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，由脂質(zhì)A、核心寡糖和O－特異性側(cè)鏈組成，是膿毒癥性休克的主要致病因子［1］。心功能障礙是膿毒癥休克患者常見的并發(fā)癥之一，有報(bào)道稱心功能障礙的發(fā)生，特別是內(nèi)毒素引起的，可使膿毒癥休克的死亡率從20%增加到70%～90%［2］。因此，改善心臟功能對(duì)于膿毒癥病人的生存具有重要作用。

嚴(yán)重創(chuàng)傷合并感染的患者(如膿毒癥)往往需要手術(shù)治療，所以麻醉劑的選擇對(duì)病人的術(shù)中安全和預(yù)后康復(fù)有重要的影響。美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)2007年發(fā)布的指南中推薦使用鹵族類吸入麻醉藥以保護(hù)心?。?］，七氟醚(sevoflurane，Sevo)是90年代上市的一種新型吸入麻醉劑，具有誘導(dǎo)和蘇醒迅速、術(shù)中維持平穩(wěn)等優(yōu)點(diǎn)，目前在臨床上應(yīng)用廣泛［4］。已有大量的臨床研究證實(shí)，七氟醚對(duì)缺血的心肌有保護(hù)作用，如De Hert等［5］研究發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)中使用七氟醚，可使術(shù)后循環(huán)更穩(wěn)定。我們先前研究［6］采用手術(shù)結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支模型，也證實(shí)七氟醚在缺血再灌注損傷中具有心肌保護(hù)作用。然而，七氟醚對(duì)內(nèi)毒素?fù)p傷的心肌是否也具有保護(hù)作用?如果有保護(hù)作用，是否與在心血管調(diào)節(jié)中有重要作用的一氧化氮(nitric oxide，NO)系統(tǒng)有關(guān)?目前則鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用小鼠LPS腹腔注射復(fù)制內(nèi)毒素血癥模型，觀察七氟醚預(yù)處理對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心功能障礙的影響，并對(duì)其與NO及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的關(guān)系作初步探討。

材料和方法

1 材料

LPS(大腸桿菌O55∶B5)購(gòu)自Sigma，Sevo購(gòu)自Abbott，NO檢測(cè)試劑盒(硝酸還原酶法)、iNOS檢測(cè)試劑盒(比色法)購(gòu)自南京建成生物工程研究所，蛋白定量測(cè)定試劑盒(BCA法)購(gòu)自上海申能博彩生物公司;主要實(shí)驗(yàn)儀器包括 WATO Ex－20呼吸機(jī)(Mindray，中國(guó))，Bx40型光學(xué)顯微鏡(Olympus)，VisualSonies?Vevo770TM高分辨小動(dòng)物超聲系統(tǒng)(Visual Sonics)，7600－020型全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi)，Tecan safire全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Tecan)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠40只，6～8周齡，體重23～25 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2008－0002，自然晝夜周期和自由飲水進(jìn)食條件下分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周，實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度控制在(24± 2)℃，相對(duì)濕度為60%～80%。所有小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(control)、LPS組、Sevo組和七氟醚處理組(Sevo+LPS)。LPS組和control組給予100%純氧30 min，洗脫10 min，分別腹腔注射18 mg/kg LPS(0.2 mL/10 g)和等量生理鹽水(0.2 mL/10 g);Sevo+ LPS組和Sevo組用100%純氧作為載氣給予2%七氟醚預(yù)處理30 min，洗脫10 min，分別腹腔注射LPS和生理鹽水。

2.2 心功能的檢測(cè) 于腹腔注射后12 h，小鼠稱重，用0.67%戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g)腹腔注射麻醉，使小鼠保持適當(dāng)?shù)穆樽頎顟B(tài)，保持自主呼吸，放置于37℃的恒溫墊上，通過(guò)導(dǎo)電膏將小鼠四肢末端與4個(gè)電極相連接并用膠布固定。在小鼠胸前區(qū)涂抹超聲偶合劑，運(yùn)用RMV707B型高頻超聲探頭(探頭頻率設(shè)置為30 MHz，探測(cè)深度為10～15 mm)對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，探頭置于其左胸，實(shí)時(shí)采集胸骨旁左心室短軸M型超聲心動(dòng)圖像。連續(xù)采集10個(gè)心動(dòng)周期的動(dòng)態(tài)圖像，記錄的M超的掃描速度為800 mm/s，儲(chǔ)存圖像后進(jìn)行脫機(jī)分析。利用VisualSonies?Vevo770TM高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)軟件，在所采集圖像上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，測(cè)得各組小鼠心率(heart rate，HR)、每搏輸出量(stroke volume，SV)、心輸出量(cardiac output，CO)、左心室舒張末期容積(left ventricular end－diastolic volume，LVEDV)和射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)。所有數(shù)據(jù)及計(jì)算值均根據(jù)美國(guó)超聲心動(dòng)圖協(xié)會(huì)(ASE)推薦方法，每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，超聲檢查的操作及分析均由專業(yè)人員完成。

2.3 血清心肌酶的測(cè)定 各組小鼠于超聲心功能檢測(cè)完畢后，立即去眼球取血0.8 mL，室溫靜置2 h，5 000 r/min離心15 min，取上清，全自動(dòng)生化儀測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase－MB，CK－MB)含量。

2.4 HE染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu) 各組小鼠采血后立即處死，打開胸腔，分離心臟，取心尖部組織，迅速置入4%甲醛溶液中固定，常規(guī)方法制成石蠟切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察心臟組織結(jié)構(gòu)的改變，并拍攝照片。由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)者在光鏡下觀察組織學(xué)特征后給出病理報(bào)告。

2.5 心肌組織NO含量及iNOS活性的測(cè)定 冷生理鹽水浸洗并輕微擠壓心臟，將心腔殘留的血液排出，然后用濾紙吸干液體。將心臟置于勻漿器中，以1∶10質(zhì)量體積比加入生理鹽水，在冰面上充分勻漿，所得勻漿液4℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清分裝，－20℃保存，BCA法測(cè)定心肌組織勻漿蛋白含量。然后，按試劑盒說(shuō)明書的操作步驟采用硝酸還原酶法檢測(cè)其NO含量(μmol/g protein)，進(jìn)一步采用比色法檢測(cè)iNOS活性(U/g protein)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(珋x±sE)表示，多組間比較用單因素方差分析(One－way ANOVA)，各組方差齊時(shí)，兩兩比較采用LSD法;各組方差不齊時(shí)，兩兩比較用Tamhane＇s T2法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 心功能檢測(cè)結(jié)果

各組小鼠HR無(wú)顯著差異。與對(duì)照組相比，LPS組小鼠LVEDV增大(P＜0.05)，SV、CO和EF顯著降低(P＜0.05)。而Sevo+LPS組與LPS組比較，LVEDV減小(P＜0.05)，SV、CO和EF增加(P＜0.05)，見圖1、表1，提示七氟醚預(yù)處理可使心功能在一定程度上得到改善。

2 血清心肌酶的檢測(cè)結(jié)果

表2顯示，對(duì)照組與Sevo組之間血清LDH和CK－MB水平無(wú)顯著差異(P＞0.05);LPS腹腔注射后12 h，小鼠血清LDH和CK－MB含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);而Sevo+LPS組與LPS組相比，LDH和CK－MB含量顯著下降(P＜0.05)。

Figure 1. Representative M－mode echocardiograms at the papillary muscle level obtained from the mice in various group.圖1 各組小鼠乳頭肌水平M型超聲心動(dòng)圖

表1 各組小鼠心功能Table 1.The cardiac functions of the mice in various groups(x珋±s.n=10)

表2 各組小鼠血清LDH和CK－MB水平Table 2.Serum levels of LDH and CK－MB in various groups (U/L.珋x±s.n=10)

3 心肌組織病理變化

LPS或生理鹽水腹腔注射后12 h，光鏡下觀察結(jié)果見圖2。對(duì)照組和Sevo組心肌纖維組織排列致密整齊、細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、核清晰，細(xì)胞間隙內(nèi)無(wú)滲出和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);LPS組心肌纖維組織排列稀疏紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，且細(xì)胞間隙內(nèi)有明顯的滲出，紅細(xì)胞和白細(xì)胞浸潤(rùn);而Sevo+LPS組心肌纖維組織排列較為整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞間隙內(nèi)無(wú)明顯的滲出，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減少。

4 心肌NO含量和iNOS活性

圖3顯示，對(duì)照組和Sevo組之間心肌NO含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)，在LPS腹腔注射后12 h，心肌NO含量顯著增加(P＜0.05)，七氟醚預(yù)處理組小鼠心肌組織中 NO含量較 LPS組顯著降低(P＜0.05)。圖4顯示，LPS組心肌iNOS活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);七氟醚預(yù)處理組與LPS組相比，iNOS活性則顯著降低(P＜0.05)。

Figure 2. Representative HE sections of hearts from the mice 12 h after LPS or normal saline injection.圖2 LPS或生理鹽水注射后12 h各組小鼠心肌HE染色

Figure 3. Myocardial NO content in various groups.珋x±s.n= 10.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.圖3 各組小鼠心肌組織NO含量

Figure 4. Myocardial iNOS activity in various groups.珋x±s.n= 10.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.圖4 各組小鼠心肌組織iNOS活性

討論

本研究沿用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的成熟和穩(wěn)定動(dòng)物模型［7］，即采用BALB/c小鼠腹腔注射LPS(18 mg/kg)復(fù)制內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型，而后從心功能、心功酶學(xué)、心肌形態(tài)等方面評(píng)價(jià)七氟醚(Sevo)預(yù)處理對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠心功能障礙的影響。實(shí)驗(yàn)采用小動(dòng)物超聲檢測(cè)儀對(duì)小鼠心功能進(jìn)行了無(wú)創(chuàng)檢測(cè)和評(píng)價(jià)，其結(jié)果顯示LPS處理后12 h的小鼠心功能有明顯變化:左心室的SV、CO、EF顯著降低、LVEDV增大，提示LPS攻擊后的小鼠左心室射血功能有所降低，導(dǎo)致LVEDV增大。這一結(jié)果與Li等［8］的研究有相似之處。他們還認(rèn)為在LPS的研究中選擇與前后負(fù)荷相關(guān)的指標(biāo)可以避免得出不恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論。故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果究其原因可能與LPS損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加外周循環(huán)阻力;心臟長(zhǎng)時(shí)間代償最終導(dǎo)致失代償，進(jìn)而導(dǎo)致心功能降低，心臟不能有效泵血，導(dǎo)致血液潴留，進(jìn)而引起LVEDV升高。而Sevo預(yù)處理組左室的SV和CO較正常組雖有所降低，但較LPS組EF有所改善且LVEDV(前負(fù)荷)減小，提示Sevo預(yù)處理可在一定程度上改善心功能，減輕LPS所導(dǎo)致的心功能障礙。此外，LPS處理后12 h的病理結(jié)果顯示:心肌纖維組織排列稀疏紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，且細(xì)胞間隙內(nèi)有明顯的滲出，紅細(xì)胞和白細(xì)胞浸潤(rùn)，提示在LPS的攻擊下心肌細(xì)胞存在損傷和炎癥反應(yīng);而Sevo預(yù)處理組的心肌纖維組織排列較為整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也較為清晰，細(xì)胞間隙未見明顯的滲出且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減少，說(shuō)明Sevo預(yù)處理可以在一定程度上對(duì)抗LPS所導(dǎo)致的心肌損傷。不僅如此，心肌細(xì)胞血清酶學(xué)檢測(cè)的結(jié)果也印證了這一結(jié)果，LPS組小鼠血清的LDH和CK－MB顯著升高，說(shuō)明心肌有損傷;而Sevo預(yù)處理的小鼠血清LDH和CK－MB水平則顯著下降，說(shuō)明心肌損傷有減輕。因此，七氟醚預(yù)處理可在一定程度上對(duì)抗LPS所致的心功能障礙，保護(hù)心肌組織結(jié)構(gòu)，減輕心肌細(xì)胞的損傷。

目前，LPS引起心功能障礙的機(jī)制尚未完全闡明。LPS引起心肌細(xì)胞大量生成NO可能發(fā)揮了重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞中的NOS催化L－精氨酸，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)而生成NO，作為氣體信號(hào)分子，在生理和病理?xiàng)l件下，均具有重要的調(diào)節(jié)血管功能的作用:生理狀態(tài)下，適量的NO水平對(duì)維持血管張力的恒定和調(diào)節(jié)血壓的穩(wěn)定有重要作用，有心血管的保護(hù)作用;而過(guò)量的NO，作為一種炎癥介質(zhì)或反應(yīng)極強(qiáng)的自由基，可直接或間接引起心肌損傷:(1)NO與超氧離子反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝基(ONOO－)，可影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和/或催化活性，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用;(2)NO激活心肌細(xì)胞中鳥苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)磷酸鳥苷環(huán)化產(chǎn)生環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)，繼而激活依賴cGMP的蛋白激酶G(protein kinase G，，PKG)，使心肌肌鈣蛋白I的磷酸化作用加強(qiáng)，肌鈣蛋白C對(duì)Ca2+的親合性下降，同時(shí)減少Ca2+內(nèi)流［9］;(3)過(guò)量的NO可抑制心肌細(xì)胞線粒體呼吸相關(guān)酶，干擾心肌能量代謝［10］等。本實(shí)驗(yàn)中，LPS處理后12 h，小鼠心肌組織NO含量升高，而Sevo預(yù)處理組NO則顯著下降，表明七氟醚預(yù)處理對(duì)抗LPS所致心功能障礙的作用機(jī)制可能與其抑制LPS誘導(dǎo)的心肌NO升高有關(guān)。

我們知道，NO的產(chǎn)生與一氧化氮合酶(NOS)關(guān)系密不可分，NOS可分為結(jié)構(gòu)型(cNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)，cNOS在生理狀態(tài)下合成少量NO，參與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)血管緊張度、調(diào)節(jié)血小板聚集等正常生理調(diào)節(jié)作用;iNOS常被內(nèi)、外毒素和細(xì)胞因子激活，合成大量NO，行使其免疫信使和細(xì)胞毒的作用。在LPS誘導(dǎo)下，心肌細(xì)胞亦可大量表達(dá)iNOS，合成過(guò)量的NO，繼而發(fā)揮損傷作用［11］。有學(xué)者［12－13］分別在腦、腎缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，七氟醚預(yù)處理在缺血再灌注損傷時(shí)可抑制iNOS的激活，抑制海馬組織、腎組織的NO水平升高，發(fā)揮器官保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，LPS處理后12 h，小鼠心肌組織iNOS活性升高，而Sevo預(yù)處理組較LPS組顯著降低。因此，七氟醚預(yù)處理可能通過(guò)抑制iNOS活性、減少NO的產(chǎn)生而發(fā)揮其對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠心肌的保護(hù)作用。

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Effects of sevoflurane preconditioning on myocardial dysfunction in lipopolysaccharide－challenged mice

LI Jian－ling1，ZHU Xiao－qing2，LI Xue－min2，LI Hong－mei2，WANG Yan－ping2，WANG Yuan2，QI Ren－bin2，LI Ya－lan1
(1Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital，2Department of Pathophysiology，Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine of People＇s Republic of China，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E－mail:tyalan@jnu.edu.cn;tqirb@jnu.edu.cn)

AIM:To investigate the effects of sevoflurane(Sevo)preconditioning on myocardial dysfunction in lipopolysaccharide(LPS)－challenged mice.METHODS:Forty male BALB/c mice were randomly allocated to 4 groups: control group，LPS group，Sevo+LPS group and Sevo group.Following pretreatment with or without 2%Sevo for 30 min and washing out for 10 min，all mice

intraperitoneal injection of LPS or normal saline(NS).The mice received an echocardiographic evaluation by a high－resolution in vivo imaging system 12 h after administration of LPS or NS.The mice were then killed and the hearts were removed for histological analysis.Serum levels of lactic dehydrogenase(LDH)，creatine kinase－MB(CK－MB)were measured with an automatic biochemical analyzer.The myocardium was homogenized for detecting the activity of inducible nitric oxide synthase(iNOS)and the content of nitric oxide(NO).RESULTS:Echocardiographic evaluation demonstrated that LPS resulted in an increase in lert ventricular end－diastolic volume and significant decreases in stroke volume，cardiac output and ejection fraction.The alteration of cardiac functions was inhibited by the pretreatment with Sevo.LPS caused significant elevation of LDH and CK－MB in serum samples and severe pathological damage of the hearts.Compared with LPS group，serum levels of LDH and CK－MB were reduced and pathological damage was attenuated in Sevo+LPS group.Sevo preconditioning also significantly attenuated the increases in iNOS and NO induced by LPS.CONCLUSION:Sevo preconditioning protects against myocardial impairment and myocardial dys-function in LPS－challenged mice.Inhibition of iNOS activity and of NO production by Sevo preconditioning may contribute to the beneficial role in the process of cardioprotection during endotoxemia.

Sevoflurane;Preconditioning;Lipopolysaccharides;Cardioprotection;Nitric oxide synthase;Nitric oxide

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2012.08.013

1000－4718(2012)08－1410－05

2012－06－26

2012－07－09

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009B030801032);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.21612446)

△通訊作者李雅蘭Tel:020－38688200;E－mail:tyalan@jnu.edu.cn;戚仁斌Tel:020－85220253;E－mail:tqirb@ jnu.edu.cn