肌肉增強子因子2對豬肌肉生長抑制素啟動子活性的調(diào)節(jié)

李佳，鄧捷，張軍林，成德，王華巖

西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院 動物生物技術(shù)系，陜西 楊陵 712100

肌肉生長抑制素 (Myostatin，Mstn) 又稱生長分化因子8 (Growth differentiation factor 8，GDF8)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子 ? (Transforming growth factor beta，TGF-?) 超家族，是在骨骼肌中廣泛表達并且功能專一的一種糖蛋白。Mstn基因在發(fā)育早期及成熟期的骨骼肌及乳腺中高表達[1]，在心肌、脂肪組織和肝臟中低表達[2-3]。高表達 Mstn的轉(zhuǎn)基因動物會出現(xiàn)肌肉萎縮的現(xiàn)象[4-5]；在小鼠、牛、人等動物上，抑制Mstn的表達，則會出現(xiàn)骨骼肌明顯增生、肌肉尺寸顯著增加等現(xiàn)象[6-8]。因此，該基因是骨骼肌生長的抑制因子。研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，對提高動物產(chǎn)肉率方面具有重要意義。

相比于 Mstn的基因與蛋白結(jié)構(gòu)和生物學功能，對 Mstn基因轉(zhuǎn)錄和表達的調(diào)控機制研究較少。在小鼠、人類、牛和羊等動物上，只完成對Mstn基因啟動子一些初步的功能預測，發(fā)現(xiàn)啟動子序列上存在糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合元件 (GRE)、肌肉調(diào)控因子結(jié)合元件 (E-box)、叉頭蛋白結(jié)合元件 (FOXO-box) 和肌肉增強子因子2 (MEF2)等因子的結(jié)合位點，它們對 Mstn基因的轉(zhuǎn)錄和表達起到一定的調(diào)控作用[7,9-11]。但是，由于Mstn基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式在不同動物間存在差異，這些調(diào)控元件在不同物種間，對 Mstn啟動子的調(diào)控作用和具體機制還需要繼續(xù)深入研究[10,12]。早期研究表明，MEF2可能通過結(jié)合Mstn啟動子的相關(guān)位點調(diào)節(jié)肌纖維類型相互轉(zhuǎn)換[13]；在心肌細胞內(nèi)，MEF2與 Mstn啟動子的結(jié)合可以抑制心肌細胞增殖[14]。但在骨骼肌中，MEF2怎樣調(diào)控豬 Mstn啟動子活性尚不清楚；如果調(diào)控機制確實存在，還需要進一步確定激活Mstn啟動子的MEF2亞型和具體的結(jié)合位點。

本研究首先通過PCR方法擴增出1 969 kb豬Mstn的啟動子序列，利用生物信息學方法分析出啟動子全序列中所有的MEF2的結(jié)合位點；其次，比較了5個長度不等的啟動子在C2C12細胞中的活性。本實驗還選取含有 MEF2位點的啟動子片段，與MEF2C或MEF2A的表達載體共同轉(zhuǎn)入C2C12細胞，檢測啟動子活性的變化，確定 MEF2的主要結(jié)合位點。最后探討 2個MEF2亞型對Mstn mRNA水平和蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

C2C12細胞系為西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院干細胞中心保存；pGEM-T Easy、pGL3-Basic、pCMV-Renilla、Dual Luciferase Reporter Assay、System kit、KpnⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、質(zhì)粒提取試劑盒購自 Promega公司；T4 DNA連接酶購自 TaKaRa公司；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自 Invitrogen公司；RevertAidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit和Taq DNA聚合酶購自MBI公司；兔抗鼠Mstn抗體購自Abcam公司；兔抗鼠 b-actin抗體購自Sigma公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體購自SantaCruz公司；BCA Protein Assay Kit、ECL Western Blotting Substrate購自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 Mstn基因啟動子片段的克隆

按照Promega基因組提取試劑盒說明書，常規(guī)提取八眉豬肌肉組織基因組 DNA，檢測核酸濃度及純度。根據(jù)Mstn啟動子5′端序列 (GenBank Accession No. AY208121)，設(shè)計帶有酶切位點KpnⅠ和 XhoⅠ的啟動子上下游引物并擴增啟動子片段為1 969 bp。PCR采用25 μL體系，反應條件: 95 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃45 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物連接在pGEM-T Easy克隆載體上，經(jīng)測序驗證后克隆到pEGFP-1和pGL3-Basic表達載體中，分別命名為 pE2.0和 pL2.0。以 PCR產(chǎn)物為模板，分別設(shè)計帶有酶切位點 KpnⅠ和XhoⅠ的上下游引物，擴增852 bp、466 bp、218 bp和 137 bp的啟動子片段，測序后克隆到pGL3-Basic表達載體中，分別命名為 pL0.8、pL0.4、pL0.2和pL0.1。引物序列見表1。

1.2.2 MEF2A和MEF2C真核表達載體的構(gòu)建

PCR引物根據(jù)GenBank中豬MEF2A的序列設(shè)計，帶有XhoⅠ和EcoRⅠ或SalⅠ的酶切位點，上下游引物序列見表1。按照常規(guī)RT-PCR方法從C2C12細胞中獲取cDNA。按上述PCR條件擴增MEF2A及MEF2C片段。經(jīng)測序驗證后，將兩個片段克隆到pEGFP-C1表達載體中，分別命名為pE-MEF2A和pE-MEF2C。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染

C2C12成肌細胞 (Myoblast)，NIH3T3細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，實驗時取對數(shù)生長期細胞。C2C12肌管細胞 (Myotube) 是將C2C12細胞培養(yǎng)在含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)液中24 h后獲得。按照Lipofectine 2000使用說明，首先將pE2.0啟動子分別轉(zhuǎn)入C2C12成肌細胞和3T3細胞，轉(zhuǎn)染后30 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。其次，將 C2C12成肌細胞或肌管細胞按2.4×104/孔接種于48孔培養(yǎng)板中，待細胞完全貼壁覆蓋率至 50%~60%時，將 pL2.0、pL0.8、pL0.4、pL0.2或pL0.1啟動子熒光報告載體 500 ng和 pCMV-Renilla表達載體 (內(nèi)參) 50 ng共同轉(zhuǎn)入細胞，30 h后收集細胞并進行熒光素酶活性檢測。最后，將上述熒光報告載體分別同MEF2A或MEF2C表達載體 (4 μg) 共同轉(zhuǎn)入成肌細胞或肌管細胞，48 h后檢測熒光素酶活性。每種質(zhì)粒做3次獨立實驗，每次3個復孔。

1.2.4 實時熒光定量PCR

轉(zhuǎn)染MEF2A或MEF2C表達載體60 h后，Trizol提取細胞總RNA，按照RevertAidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit相關(guān)說明進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并設(shè)計qMstn和qGAPDH (內(nèi)參) 引物。熒光定量PCR反應體系如下：2×SYBR Green Mix 10 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各 0.5 μL (10 pmol/L)，模板cDNA 1 μL，去離子水7 μL，共20 μL。每個樣本設(shè)3個重復，另設(shè)不加模板對照組 (以等體積的去離子水替代)。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 10 s，56 ℃退火階段收集熒光信號。實時熒光定量PCR引物序列見表1。

1.2.5 Western blotting檢測

轉(zhuǎn)染后 72 h收集細胞，采用細胞裂解液(Promega公司) 提取總蛋白。將蛋白樣品與等量的2×上樣緩沖液混合，100 ℃變性5 min，冰上完全冷卻后上樣，進行 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。恒壓80 V轉(zhuǎn)PVDF膜4 h，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h后，1:500稀釋的Mstn抗體作用于4 ℃搖床過夜，或以1:2 000稀釋的β-actin抗體室溫作用1 h，PBST洗膜3次后，將膜與1:5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后，加入ECL化學發(fā)光試劑，室溫孵育5 min，暗室曝光，顯影定影。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準偏差表示，并經(jīng)雙尾t-test檢驗差異是否具有統(tǒng)計學意義。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬Mstn啟動子的構(gòu)建及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子位點分析

從豬的基因組DNA克隆了1 969 bp的Mstn基因啟動子片段，并通過生物信息學分析豬Mstn啟動子上潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點 (圖 1A)。在Mstn的5'端側(cè)翼50 bp以內(nèi)存在2個獨立的TATA框；在-71 bp到-66 bp存在1個CAAT框；整個啟動子包括 16個 E-box，它的識別位點為CANNTG 序列，可以結(jié)合成肌分化抗原(MyoD)，生肌調(diào)節(jié)因子5 (MYF5)和生肌調(diào)節(jié)因子 6 (MYF6)等參與肌肉生長發(fā)育調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子。該啟動子上還包括3個潛在的MEF2結(jié)合位點 (TA(A/T)4TA)，一個近端的位點位于-189 bp到-206 bp (MEF2-1)；兩個遠端的位點分別位于-441 bp到-449 bp (MEF2-2)，-620 bp到-628 bp (MEF2-3)。

2.2 豬Mstn啟動子在C2C12及NIH 3T3細胞中的活性

首先，將pE2.0啟動子缺失報告載體分別轉(zhuǎn)入C2C12細胞和3T3細胞，30 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞。結(jié)果顯示，部分C2C12細胞表達綠色熒光而 3T3細胞沒有熒光蛋白的表達(圖1B)。這一結(jié)果證實了Mstn啟動子在肌細胞中表達的特異性。然后，將5個不同長度的啟動子片段分別轉(zhuǎn)入C2C12成肌細胞和肌管細胞中，觀察這些啟動子的活性。在成肌細胞中，轉(zhuǎn)入不同的 Mstn啟動子后，熒光素酶水平是轉(zhuǎn)入pGL3-Basic對照載體細胞的20~60倍，進一步證實該啟動子在肌細胞中充分激活 (圖2)。研究檢測的5個啟動子，它們的活性在成肌細胞中比在肌管細胞中要高2~3倍 (圖2)，這可能是因為成肌細胞中高表達一系列限制肌肉分化發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，對Mstn啟動子發(fā)揮了一定的協(xié)同激活作用。

圖1 豬Mstn啟動子的序列分析及啟動子缺失載體pE2.0在C2C12細胞和NIH 3T3細胞中的激活Fig. 1 Sequence analysis of porcine Mstn promoter and the activation of promoter-less vector pE2.0 in C2C12 cells and NIH 3T3 cells. (A) The 1 969 bp porcine Mstn promoter was analyzed by MatInspector software. 16 E-Boxes were indicated by black box. (B) C2C12 (a and b) and NIH 3T3 cells (c and d) were transfected with pE2.0 constructs. a and c are fluorescent images; b and d are phase-contrast images. Scale bars=10 mm.

圖2 不同片段豬Mstn啟動子在成肌細胞及肌管細胞的活性檢測Fig. 2 Luciferase activity of five constructs with different sized Mstn promoter in myoblasts and myotubes.

基于熒光素酶檢測的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)在1 969 bp Mstn基因啟動子片段中，包含了5個活性調(diào)控區(qū)域，包括 3個活性上調(diào)區(qū) (1 bp至-137 bp、-137 bp至-218 bp、-218 bp至-466 bp和-466 bp到-852 bp) 和 1個活性下調(diào)區(qū)域(-852 bp至-1 969 bp)。其中，在第一個區(qū)域，結(jié)果顯示僅 137 bp的啟動子片段 (pL0.1) 足以激活啟動子活性 (該片段活性是對照載體的 15倍)。在-137 bp至-218 bp區(qū)域和-466 bp至-852 bp區(qū)域，熒光素酶活性顯著增加。在成肌細胞和肌管細胞中，報告載體pL0.2的活性分別是pL0.1的2倍和4倍，表明在-137 bp到-218 bp這一區(qū)域有重要的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子參與 Mstn啟動子活性調(diào)節(jié)。從-218 bp至-466 bp，啟動子活性沒有明顯改變，提示這一區(qū)域可能不是 Mstn啟動子的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)。

2.3 MEF2對豬Mstn啟動子活性的影響

在 C2C12細胞上，進一步探討了轉(zhuǎn)錄因子MEF2對豬 Mstn啟動子活性的調(diào)控。分別將MEF2A和 MEF2C兩個亞型的表達載體與不同的啟動子片段共同轉(zhuǎn)染成肌細胞或肌管細胞，60 h后檢測熒光素酶活性。分析發(fā)現(xiàn)，在高表達MEF2C基因后，含有MEF2結(jié)合位點的啟動子片段 (pL2.0、pL0.8、pL0.4和pL0.2) 活性明顯增強，不含有 MEF2結(jié)合位點的啟動子片段(pL0.1) 活性沒有顯著變化 (圖3A、B)。其中，含有MEF2-1位點的pL0.2活性變化最為明顯：在成肌細胞和肌管細胞，啟動子活性分別升高了6倍和5倍。含有全部3個MEF2位點的pL2.0和pL0.8，在加入MEF2C表達載體后，活性也顯著上升了2~3倍；含有MEF2-1和MEF2-2位點的pL0.4片段，其活性的增加只有pL0.2片段的50%。該結(jié)果表明，不同的MEF2結(jié)合位點對MEF2C的易感性不同，以近端的MEF2-1位點最為敏感，是MEF2C調(diào)節(jié)Mstn啟動子活性的重要位點。而高表達MEF2A基因后，各啟動子活性沒有明顯變化，說明MEF2A亞型可能在調(diào)控豬Mstn啟動子活性方面作用較為薄弱。

圖3 MEF2A和MEF2C對不同片段的豬Mstn啟動子活性的影響Fig. 3 Luciferase activity of different porcine Mstn promoter fragment response to MEF2A or MEF2C overepression in myoblasts and myotubes.

2.4 MEF2對豬Mstn轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的調(diào)控

將MEF2A和MEF2C的表達載體分別轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞和肌管細胞，檢測Mstn的mRNA水平和蛋白水平的變化。結(jié)果顯示，在成肌細胞中，轉(zhuǎn)入MEF2C后，Mstn的mRNA水平只升高了約0.5倍，蛋白水平也變化不明顯 (圖4A)；在肌管細胞中，mRNA水平升高了4~5倍，而且蛋白水平也有顯著上調(diào) (圖 4B)。與前面的結(jié)果相似，轉(zhuǎn)入MEF2A表達載體后，在兩種細胞中，Mstn的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平都沒有明顯改變(圖 4A、4B)。以上結(jié)果提示，在肌肉發(fā)育過程中，特別是在分化為肌管細胞的過程中，MEF2C可能通過調(diào)節(jié) Mstn啟動子活性從而增加其mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯。

圖4 轉(zhuǎn)染pC-MEF2A或pC-MEF2C后Mstn的mRNA水平和蛋白水平Fig. 4 Mstn mRNA and protein level after transfection of pC-MEF2A or pC-MEF2C in myoblasts and myotubes.

3 討論

在本研究中，我們首先構(gòu)建了豬 Mstn啟動子，并把它克隆到啟動子缺失載體pEGFP-1中。pE2.0啟動子導入非肌肉細胞后，豬Mstn啟動子不表達。該結(jié)果證實 Mstn啟動子的在肌肉細胞內(nèi)特異性表達。這與以前在人和羊上Mstn啟動子的報道一致[15]。

然后，我們發(fā)現(xiàn) MEF2C的表達對豬 Mstn啟動子活性有顯著上調(diào)的作用。MEF2 (MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D) 是成肌細胞分化為肌肉特異性基因的轉(zhuǎn)錄因子[16]。在成年小鼠，MEF2C的表達僅限于骨骼肌、腦和脾；而MEF2A、MEF2B和MEF2D則廣泛表達于身體各個組織[17-18]。已有的報道發(fā)現(xiàn)，MEF2廣泛存在于肌肉細胞中，是最早被稱為具有肌肉特性的DNA結(jié)合活性因子，可與大多數(shù)肌肉特定基因，特別是堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白家族成員 (Basic helix-loop-helix protein，BHLH protein) 的啟動子或增強子直接結(jié)合，激活骨骼肌相關(guān)基因的活性[19]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，MEF2可以與一些負調(diào)控肌肉生長發(fā)育基因的啟動子相結(jié)合并增強該啟動子的活性，例如 Mstn[13]和 TRIM72[20]。在豬Mstn基因啟動子上，MEF2C結(jié)合位點的發(fā)現(xiàn)以及MEF2C增強Mstn轉(zhuǎn)錄活性的證據(jù)表明，該因子可以通過影響Mstn的表達來參與骨骼肌生長和分化的調(diào)節(jié)。此前，有報道證實，MEF2可以通過調(diào)節(jié)Mstn基因的表達改變小鼠骨骼肌肌纖維類型的組成[13]。而在心肌細胞的研究證實，MEF2通過與Mstn的啟動子DNA結(jié)合抑制心肌細胞增殖，并降低心臟重量[14]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)MEF2C是骨骼肌中發(fā)揮該調(diào)控機制的亞型。在成肌細胞中和肌管細胞中，高表達MEF2C后，豬Mstn啟動子活性增加了3~4倍。與此相對應的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平在成肌細胞中只升高了0.5倍左右，實際上不具有真正的生理學意義。該結(jié)果提示，在成肌細胞中，MEF2C還可能激活了其他信號通路，調(diào)控Mstn表達；而在肌管細胞中，mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平升幅程度與啟動子活性的激活程度相似，提示MEF2C可能在肌管發(fā)育期對Mstn的影響更為重要。由于Mstn的作用是限制骨骼肌生長發(fā)育，在肌管細胞內(nèi)，MEF2C激活Mstn啟動子的現(xiàn)象可能是該因子負反饋調(diào)節(jié)抑制肌細胞增生的機制之一[20]。

總之，本研究克隆和分析了豬 Mstn基因啟動子序列，首次發(fā)現(xiàn)了并確定了該序列有 3個MEF2結(jié)合位點。其中，近端的MEF2-1位點最為重要，它是MEF2C在C2C12細胞中上調(diào)Mstn啟動子活性的重要結(jié)合位點。而且，在肌細胞中，MEF2C還可以通過上調(diào)Mstn啟動子活性增強該基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯。本研究結(jié)果提示，MEF2C可以通過激活Mstn調(diào)節(jié)豬肌肉生長和發(fā)育，這將為以后通過調(diào)控 Mstn基因控制動物肌肉產(chǎn)量等方面提供新的理論依據(jù)。

[1] McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-p superfamily member. Nature, 1997, 387(6628): 83?90.

[2] Sharma M, Kambadur R, Matthews KG, et al. Myostatin, a transforming growth factor-β superfamily member, is expressed in heart muscle and is upregulated in cardiomyocytes after infarct. J Cell Physiol, 1999, 180(1): 1?9.

[3] Sundaresan NR, Saxena VK, Singh R, et al. Expression profile of myostatin mRNA during the embryonic organogenesis of domestic chicken (Gallus gallus domesticus). Res Vet Scis, 2008, 85(1): 86?91.

[4] Reisz-Porszasz S, Bhasin S, Artaza JN, et al. Lower skeletal muscle mass in male transgenic mice with muscle-specific overexpression of myostatin. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003, 285(4): E876?E888.

[5] Zhu XY, Topouzis S, Liang LF, et al. Myostatin signaling through Smad2, Smad3 and Smad4 is regulated by the inhibitory Smad7 by a negative feedback mechanism. Cytokine, 2004, 26(6): 262?272.

[6] Grobet L, Martin LJR, Poncelet D, et al. A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nature Genetics, 1997, 17: 71?74.

[7] Seoane J, Le HV, Shen LJ, et al. Integration of Smad and forkhead pathways in the control of neuroepithelial and glioblastoma cell proliferation. Cell, 2004, 117(2): 211?223.

[8] Mosher DS, Quignon P, Bustamante CD, et al. A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and enhances racing performance in heterozygote dogs. PLoS Genetics, 2007, 3(5): e79.

[9] Sandri M, Sandri C, Gilbert A, et al. Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle atrophy. Cell, 2004, 117(3): 399?412.

[10] Spiller MP, Kambadur R, Jeanplong F, et al. The myostatin gene is a downstream target gene of basic helix-loop-helix transcription factor MyoD. Mol Cell Biol, 2002, 22(20): 7066?7082.

[11] Stitt TN, Drujan D, Clarke BA, et al. The IGF-1/PI3K/Akt pathway prevents expression of muscle atrophy-induced ubiquitin ligases by inhibiting FOXO transcription factors. Mol Cell, 2004, 14(3): 395?403.

[12] Du R, An XR, Chen YF, et al. Some motifs were important for myostatin transcriptional regulation in sheep (Ovis aries). J Biochem Mol Biol, 2007, 40(4): 547?553.

[13] Hennebry A, Berry C, Siriett V, et al. Myostatin regulates fiber-type composition of skeletal muscle by regulating MEF2 and MyoD gene expression. Am J Physiol Cell Physiol, 2009, 296(3): C525?C534.

[14] Wang BW, Chang H, Kuan PL, et al. Angiotensin II activates myostatin expression in cultured rat neonatal cardiomyocytes via p38 MAP kinase and myocyte enhance factor 2 pathway. J Endocrinol, 2008, 197(1): 85?93.

[15] Huang ZQ, Chen XL, Chen DW. Myostatin: a novel insight into its role in metabolism, signal pathways, and expression regulation. Cell Signal, 2011, 23(9): 1441?1446.

[16] Bryantsev AL, Baker PW, Lovato TL, et al. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev Biol, 2012, 361(2): 191?207.

[17] Sekiyama Y, Suzuki H, Tsukahara T. Functional gene expression analysis of tissue-specific isoforms of mef2c. Cell Mol Neurobiol, 2012, 32(1): 129?139.

[18] Potthoff MJ, Olson EN. MEF2: a central regulator of diverse developmental programs. Development, 2007, 134(23): 4131?4140.

[19] Olson EN, Perry M, Schulzr RA. Regulation of muscle differentiation by the MEF2 family of MADS box transcription factors. Dev Biol, 1995, 172(1): 2?14.

[20] Jung SY, Ko YG. TRIM72, a novel negative feedback regulator of myogenesis, is transcriptionally activated by the synergism of MyoD (or myogenin) and MEF2. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 396(2): 238?245.