基于AFLP標(biāo)記的野生梅種質(zhì)的鑒定

李慶衛(wèi)，張啟翔，陳俊愉

北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 國家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083

梅 (Prunus mume Sieb. et Zucc.) 是我國原產(chǎn)的傳統(tǒng)名花佳果[1]。野生梅是重要的種質(zhì)資源，其分布廣泛，生境多樣，種群的分化變異情況、不同變種間的親緣關(guān)系沒有得到系統(tǒng)的研究。對其遺傳多樣性、親緣關(guān)系和分類研究是梅育種和種質(zhì)資源保護(hù)中的重要課題[2]。隨著旅游業(yè)快速發(fā)展，野生梅種質(zhì)資源的破壞日益嚴(yán)重，有效保護(hù)野生梅資源是迫不及待的問題。梅的傳統(tǒng)分類主要是依據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行分類，因易受環(huán)境影響，界定標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一[3-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)許多“種”只是“形態(tài)學(xué)種”，實際并不是全面的“生物學(xué)種”。劃分物種的形態(tài)學(xué)依據(jù)是重要的，但不應(yīng)該是唯一的[3]。對野梅的染色體也有人做過研究[5-7]，植物染色體的研究與人類和哺乳動物染色體分帶研究有較大差距。并且其技術(shù)本身仍缺乏相對的穩(wěn)定性[8]；張永春等[9]進(jìn)行了部分野梅、果梅、花梅的同工酶分析，探討了原始與進(jìn)化品種在同工酶譜帶上的差異。同工酶技術(shù)的多態(tài)性檢出率較分子生物學(xué)手段低；在梅種質(zhì)資源鑒別與分類方面應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)，可以提供分子水平上的客觀依據(jù)，并且比傳統(tǒng)的方法更能反映其物種間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)分子標(biāo)記技術(shù)兼有 RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 標(biāo)記技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，還具有快速、靈敏、穩(wěn)定、DNA用量少、多態(tài)性檢出率高、重復(fù)性好的特點，所以AFLP可以用于遺傳多樣性研究、品種鑒定、基因定位及遺傳圖譜構(gòu)建[10-18]。Vos等[15]認(rèn)為Mse I可以高效酶切富含AT的真核生物重復(fù)序列區(qū)域，產(chǎn)生的片段大小適合于 PCR和變性膠的分離。而其他寡切點酶的酶切效果與 EcoRⅠ基本相差不大。MseⅠ-EcoRⅠ比PstⅠ-MseⅠ檢測到的遺傳多樣性范圍要寬一些。明軍等[11]選用MseⅠ-EcoRⅠ內(nèi)切酶，利用銀染法AFLP技術(shù)建立了栽培梅花DNA指紋圖譜，鑒定了167個梅花品種，探討了梅與其部分近緣種間的親緣關(guān)系[19-20]。

本實驗采用熒光擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)，建立了西藏 (30個)、云南 (15個)、四川 (14個)、貴州 (6個) 共計65個野梅AFLP-DNA指紋圖譜，分析了其遺傳多樣性和親緣關(guān)系，鑒別了野梅類型，進(jìn)行了野梅分類，提出了有效進(jìn)行野梅種質(zhì)資源保護(hù)的建議。

1 材料與方法

1.1 材料

抽取西藏通麥、云南大理、四川、貴州等野梅半野梅群落為擬似群體，每個群體選取間隔不低于5倍株高的植株分別取樣，樣品包括西山野梅1 (原變種Prunus mume var. mume)、西山野梅2 (原種Prunus mume)、毛梅 (Prunus mume var. goethartiana Kochne)、厚葉梅 (Prunus mume var pallescens Franch.)、嵩明小梅 (Prunus mume var. microcarpa Makino T.)、曲梗常綠梅 (Prunus mume var. cenrnuus-sempervirens Chen et Li)、曲梗梅 (Prunus mume var. cernua Franch.)、蠟葉梅(Prunus mume var pallidus Bao et Chen)、南大坪桃梅等已記載的野梅類型，同時對采樣點進(jìn)行了GPS定位。實驗材料為從云南洱源的南大坪、西山和寧蒗，四川冕寧、木里、鹽源，西藏通麥，貴州荔波等地調(diào)查野梅時所采的野梅、半野生梅的葉片[21]，新鮮樣品采后迅速裝入牛皮紙信封，室內(nèi)陰干后放入?80 ℃冰箱，備用。65個野梅實驗樣品見表1。

表1 供試野梅樣品Table1 The serial numbers of wild Mei

?

*: no GPS data.

1.2 實驗主要儀器與試劑

臺式離心機(jī) DGL-16；DG-II暗箱式紫外透箱儀；DG-3D大型水平電泳槽；DG-III雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀；Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer，USA)；Sigma 3K18型低溫冷凍離心機(jī)(Sigma，USA)；測序儀ABI PRISM 377 sequence；AFLP試劑盒 (EcoRⅠ/MseⅠ型：北京鼎國生物技術(shù)公司生產(chǎn)并按說明書進(jìn)行)。本實驗所用的內(nèi)切酶組合為：EcoRⅠ-MseⅠ，相應(yīng)的接頭、引物均采用Pieter Vos設(shè)計的相應(yīng)的序列[15]。

1.3 基因組DNA提取、檢測、限制性酶酶切及連接

采用CTAB法提取DNA[20]，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。試驗體系參照文獻(xiàn)[15]和[19]，建立熒光反應(yīng)體系。本實驗選用的內(nèi)切酶組合為：EcoRⅠ-MseⅠ及其相關(guān)引物組合。限制性酶切及連接(20 μL反應(yīng)體系)：在0.5 mL離心管中加入表2中試劑，混勻，37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過夜。

1.4 引物類型的選擇

在AFLP標(biāo)記引物中，3′端選擇性核苷酸數(shù)目的多少決定了AFLP酶位點特異性順序擴(kuò)增產(chǎn)物的多少。EcoRⅠ引物和MseⅠ引物的組成見表3，選擇性擴(kuò)增用3+3引物組合 (表4)。

本實驗采用 EcoRⅠ和 MseⅠ兩種酶雙酶切目的DNA，然后用T4 DNA連接酶，將EcoRⅠ和MseⅠ接頭連接起來，構(gòu)成預(yù)擴(kuò)增模板DNA。

本實驗引物篩選策略是：隨機(jī)選取5個樣品，共篩選引物組合64個，如表4所示，按照5個樣品都擴(kuò)增較好，且多態(tài)性條帶在 10條以上的引物組合，進(jìn)行擴(kuò)大樣品 (10個樣品和30個樣品) 擴(kuò)增，再二次篩選。最后確定8個擴(kuò)增較整齊、多態(tài)性高的引物組合，即表4中標(biāo)記※的組合，作為指紋建立的引物組合。

1.5 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)與選擇性擴(kuò)增

在0.2 mL離心管中按表5建立預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系：(共25 μL反應(yīng)體系)，混勻后離心5 s。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件：變性 94 ℃ 2 min ；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 80 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。

表2 AFLP限制性酶切及連接反應(yīng)體系Table 2 AFLP restriction enzyme digestion and the linking reaction system

表3 EcoRⅠ引物和MseⅠ引物的組成Table 3 The component of primers EcoRⅠand MseⅠ

表4 EcoR I-Mse I及其相關(guān)引物組合Table 4 The primers combinations of EcoR I and Mse I

用TE緩沖液將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物1∶20稀釋，作為選擴(kuò)模板。在0.2 mL離心管中，按表6建立選擴(kuò)增反應(yīng)體系，離心5 s，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR：94 ℃ 2 min ；第一個循環(huán)擴(kuò)增參數(shù)：94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 80 s；以后每個循環(huán)退火溫度遞減0.7 ℃，擴(kuò)增12個循環(huán)；接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23個循環(huán)：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s。

表5 AFLP預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系Table 5 PCR reaction system of AFLP pre-amplification

表6 AFLP選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系Table 6 PCR reaction system of AFLP selective amplification

1.6 電泳與數(shù)據(jù)處理

取1 μL PCR產(chǎn)物加入1 μL內(nèi)標(biāo) (OX 500 Ladder (70~500 bp))，在熒光標(biāo)記ABI 377測序儀上進(jìn)行4%的變型聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用GENESCAN3.1軟件分析，通過Binthere軟件提取樣品的各片段大小的結(jié)果，用NTSYSpc-2.11F軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算 Nei’72距離系數(shù)，用SHAN程序中的 UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并通過 Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試野梅AFLP條帶多態(tài)性結(jié)果與分析

應(yīng)用熒光AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，選用8對引物組合，建立了65個野梅樣品的AFLP-DNA指紋圖譜。以引物組合E-ACA+M-CAT為例，采用熒光AFLP技術(shù)，按照前述實驗方法得到指紋圖(圖1)。8對引物組合共得到1 728條帶，擴(kuò)增出多態(tài)性條帶 1 002條。平均多態(tài)性條帶率為57.98%。從表7可以看出，應(yīng)用AFLP技術(shù)標(biāo)記野梅種質(zhì)資源多態(tài)性是高效率的。

2.2 基于AFLP的野梅種質(zhì)鑒別

引物組合E-ACA+M-CAT分析了65個野梅樣品的DNA譜帶，按照Nei’72距離系數(shù)聚類，結(jié)果見圖2，西藏野梅30個樣品，整體上聚類較好，其中 28個樣品聚成一叢，它們的遺傳距離在0.42以內(nèi)，只有2個較分散，這個聚類結(jié)果反映了西藏野梅基本上是1個居群內(nèi)發(fā)展的，親緣關(guān)系最近，這個結(jié)論與西藏野梅生長在交通極不發(fā)達(dá)的環(huán)境中，和西藏種植業(yè)不發(fā)達(dá)，外來人為因素對梅種質(zhì)的影響較小有關(guān)。四川、云南與貴州野梅的聚類結(jié)果不如西藏野梅集中，表明它們之間有種質(zhì)的滲入，表明它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2中，四川省冕寧野梅1和冕寧野梅2是采自于冕寧縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的厚葉梅，形態(tài)特征相同，親緣關(guān)系較近，在0.24處聚在一起，是合理的。四川木里野梅共選6個樣品，其中木里野梅1、木里野梅 3、木里野梅 4與四川冕寧野梅 1和冕寧野梅2屬于厚葉梅的不同個體，親緣關(guān)系近，主要形態(tài)特征是葉厚、枝刺多，它們在0.27以內(nèi)聚在一起，這個聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)標(biāo)記一致；木里野梅6 (葉常綠) 與云南常綠梅都具有葉常綠的特性，形態(tài)特征近似，二者在0.27處聚在一起，說明他們的親緣關(guān)系較近；木里野梅5 (葉片小而厚、果實小) 在 0.25處與貴州野梅甲乙02 (原變種，葉小而枝短) 聚在一起，說明親緣關(guān)系較近；木里野梅2樹干匍匐狀，與其他木里野梅的距離都較遠(yuǎn)，說明木里野梅遺傳多樣性突出。

表7 不同引物組合在AFLP分析中的效果Table7 Effect of different primer combinations used in AFLP analysis

圖1 引物組合E-ACA+M-CAT的AFLP指紋圖式樣Fig.1 AFLP fingerprint of primer combinations E-ACA/M-CAT. M: marker.

供試的貴州荔波野梅6個樣品的形態(tài)特征差異較大，其中3個在0.31處聚在一起，具體是：貴州小苗樣品系從貴州野生梅 (原種) 的實生苗取樣的，親緣關(guān)系較近，二者在0.24處聚在一起，然后與甲命05 (一年生枝細(xì)、葉倒卵形、花梗長) 在0.31處聚在一起；另外2個貴州野梅分別與木里野梅、瀘沽湖野梅、南大坪野梅聚在一起，說明貴州荔波的遺傳多樣性突出，可能與其外來基因的滲入有關(guān)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)貴州荔波確實有種梅的歷史。

供試的云南洱源野梅樣品主要采集了野梅的不同變種和變型，形態(tài)特征差異顯著，其中嵩明小梅 (采自昆明，其枝條、葉、花、果均較小)與曲梗常綠梅 (為擬定新變種：花梗長、果實小、花復(fù)瓣、葉常綠)、南大坪長梗梅 (花梗長) 三種在0.39處聚在一起；洱源縣西山毛梅 (葉片、果實多毛)、溪登毛梅 (葉片、果實多毛) 在0.3處聚在一起，然后與洱源縣南大坪炒豆梅 (果實小)、二度梅 (葉片、果實多毛)、苦梅 (一年一次花，果實大) 在0.3處聚在一起，親緣關(guān)系較近；南大坪杏梅與瀘沽湖野梅5和瀘沽湖野梅6在0.25處聚在一起，它們與寧蒗野梅在0.31處聚在一起，與南大坪的桃梅在0.39處聚在一起，聚類結(jié)果說明云南洱源野梅的多樣性突出。這可能與云南洱源既是野梅分布中心，也是梅花和果梅的栽培中心有關(guān)，這里的交通相對于西藏和四川要便利很多，因此人們有意的引種和無意識的攜帶果品 (果核被投入野外而萌發(fā)成樹) 都可能導(dǎo)致外來基因的滲入，使本地基因類型更豐富。它們之間的親緣關(guān)系就可能較遠(yuǎn)。

2.3 主要野梅分類

為了使聚類結(jié)果更直觀，將65個野梅樣品中的冕寧厚葉梅1、冕寧厚葉梅2、西藏蠟葉梅、洱源南大坪常綠梅、洱源杏梅、洱源桃梅、西山毛梅、西山野梅、西山野梅原變種、嵩明小梅、曲梗常綠梅 (擬定的新變種)、西藏匍匐梅、木里2 (匍匐梅) 的AFLP 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，按照Nei’72距離系數(shù)進(jìn)行專門聚類，聚類結(jié)果如圖3所示。

圖2 Nei’72遺傳距離系數(shù)對野梅種質(zhì)資源多樣性聚類圖Fig.2 The dendrogram of wild mei of Nei’72 distance coefficient.

圖3 主要野梅Nei’72距離系數(shù)聚類樹Fig.3 Dendrogram of major wild mei based on methods of Nei’72 distance coefficient.

從圖3可以看出，冕寧野梅1和冕寧野梅2兩個樣品為采于冕寧縣兩個不同村莊的厚葉梅個體，二者距離相差0.05，在0.23處聚在一起；常綠梅和西山毛梅是梅的不同變種，兩者在0.27處聚在一起，因此，可以0.26作為一個閾值，距離大于0.26的定為變種或變型。新發(fā)現(xiàn)的擬定新變種——云南曲梗常綠梅與嵩明小梅 (已定變種) 二者在0.3476處聚在一起，大于0.26，結(jié)合形態(tài)特征看，該擬定新變種的主要形態(tài)特征是花梗長，花瓣8~14瓣，花開時葉片宿存，果實較小，與其他野梅變種差異顯著，因此可以將曲梗常綠梅定為一個新變種。

西藏蠟葉梅的葉片兩面均被白粉而呈現(xiàn)蠟白色，其距離系數(shù)為0.37，也大于0.26，可以定為一個變種，西藏匍匐梅之樹干匍匐狀，雖與西藏蠟葉梅兩個樣品的空間距離很近，但是遺傳距離差異0.18，這種差異可能是由控制蠟葉性狀的基因差異形成的。木里野梅2位于四川木里，其樹干具有匍匐性，與西藏匍匐梅的空間距離很遠(yuǎn)，但是二者差異為0.16，可以認(rèn)為是不同起源的匍匐梅，從AFLP標(biāo)記的結(jié)果看，可以將匍匐梅作為一個變種。在Nei’72=0.26處，西山野梅原變種、西山野梅原種、西山毛梅、厚葉梅、南大坪桃梅、嵩明小梅、曲梗常綠梅、蠟葉梅、匍匐梅可區(qū)分出梅的變種或變型，并與形態(tài)分類一致。

3 討論

AFLP標(biāo)記方法已被證實是種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和鑒定的有效工具[11-20]。本研究用熒光AFLP技術(shù)建立了65個野梅樣品的DNA指紋圖譜，按照 Nei’72距離系數(shù)的聚類，結(jié)果表明，AFLP-DNA指紋圖譜可以高效區(qū)分野梅種質(zhì)，驗證支持了形態(tài)學(xué)的鑒別結(jié)論。宋婉[23]用熒光法AFLP研究了 68個棗品種，田清震等[24]對大豆90個品種，明軍[11]對 187個梅花樣品進(jìn)行的AFLP-DNA指紋分析，均全部鑒別了供試樣品，但也都出現(xiàn)了樣品間差異與形態(tài)特征分類不同的情況。所以要完全依據(jù)指紋鑒別野梅種質(zhì)類型，就必須采用標(biāo)準(zhǔn)的野梅樣品，并區(qū)分來源，分別采集樣品，建立指紋圖譜庫，以進(jìn)行比對鑒定。而確定野梅的標(biāo)準(zhǔn)模式類型必須依靠形態(tài)學(xué)方法鑒別。

本研究顯示：西藏通麥野梅主要類型有西藏野梅 (原種)、原變種、匍匐梅和蠟葉梅4個類型，但它們的親緣關(guān)系較近，為居群內(nèi)變異；云南洱源、四川瀘沽湖、以及貴州荔波等地既是野梅分布中心又是果梅的栽培中心，由于人工選擇和外來基因滲入的影響導(dǎo)致聚類較分散，這就更說明了加強(qiáng)野梅種質(zhì)資源保護(hù)的必要性和緊迫性。

雖然從AFLP分子標(biāo)記結(jié)果看，可以將匍匐梅作為一個變種。但是由于干形、株型受多因素影響，而且其遺傳性如何尚有待進(jìn)一步研究，因此建議進(jìn)一步進(jìn)行繁殖栽培對比研究，暫不作新變種處理。

在Nei’72=0.26處，西山野梅1 (原變種)、西山野梅2 (原種)、毛梅、厚葉梅、嵩明小梅、曲梗常綠梅、曲梗梅、蠟葉梅、南大坪桃梅9個梅的變種或變型可區(qū)分出來，證明了AFLP可以用于野梅種質(zhì)的鑒別。

變異類型主要在變種變型方面，群體內(nèi)較小，所選擇育種親本和保護(hù)資源區(qū)分層次。因此，在保護(hù)、利用梅花資源時，需要優(yōu)先篩選和保護(hù)變種、變型的遺傳變異類型，其次，為其群體。建議對主要野梅變種采取就地和異地建立野梅基因庫的方式加以保護(hù)。同時將西藏通麥野梅分布集區(qū)化為野生梅自然保護(hù)區(qū)，將荔波國家級自然保護(hù)區(qū)中自荔波縣洞塘鄉(xiāng)甲命村 (107°58′37″E, 25°17′59″N) 到甲乙村 (107°55′50″E, 25°48′3″N)所在區(qū)域劃分為野梅保護(hù)核心區(qū)加以保護(hù)，由于洱源野梅已經(jīng)處于半野生狀態(tài)，受果梅栽培和人為活動影響很大，應(yīng)對主要變種、變型采取單株重點保護(hù)。

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