釀酒酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)在燃料乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

楊非，曹萌，金怡，楊秀山，田沈

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048

隨著化石能源的日益枯竭，可再生清潔能源生物乙醇的開(kāi)發(fā)和利用受到了人們的廣泛關(guān)注。燃料乙醇可以從蔗糖、淀粉和纖維素生物質(zhì)中獲得，給料的類型決定了發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜程度，方法技術(shù)也從簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)化糖發(fā)酵發(fā)展到利用多種策略來(lái)轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇[1]。在本領(lǐng)域的諸多最新研究趨勢(shì)中，開(kāi)發(fā)具有同步糖化發(fā)酵能力的優(yōu)良酵母菌株是減少乙醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素。近年來(lái)，隨著生物乙醇的生產(chǎn)由第一代向第二代成功過(guò)渡，大量的研究集中在利用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)能夠轉(zhuǎn)化多種生物質(zhì)的生物乙醇生產(chǎn)菌株[2-3]。

酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是一種真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)。其基本原理是將外源靶蛋白基因與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后，信號(hào)肽引導(dǎo)融合蛋白向細(xì)胞外分泌，外源蛋白的展示主要是借助于 GPI錨的作用，GPI錨定蛋白的C端包含疏水多肽，當(dāng)細(xì)胞蛋白被合成，前體蛋白通過(guò)羧基末端的疏水序列錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其余蛋白則位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中。在極短的時(shí)間內(nèi)，疏水序列在轉(zhuǎn)酰氨基酶的作用下ω位點(diǎn)裂開(kāi)同時(shí)被GPI錨置換，并被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w再通過(guò)分泌途徑分泌至細(xì)胞膜外。在蛋白水解酶作用下，分泌信號(hào)序列被切除，細(xì)胞蛋白被磷脂酰肌醇特異性磷脂酶 C從細(xì)胞膜上釋放并以 GPI錨定形式與葡聚糖共價(jià)相連被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞壁外。圖1展示的是通過(guò)α-凝集素系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)目的蛋白到細(xì)胞表面的分泌途徑。酵母表面展示技術(shù)具有表達(dá)偏差小，展示的融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量范圍大，分子數(shù)量多，篩選、純化、活性測(cè)定方便等優(yōu)點(diǎn)。

圖1 基于α-agglutinin的蛋白運(yùn)輸示意圖[4]Fig. 1 Illustration of the general transportation of α-agglutinin to the cell surface[4].

目前，最常見(jiàn)的酵母表面展示系統(tǒng)包括：凝集素展示表達(dá)和絮凝素展示表達(dá)[5]。如圖2所示，α-凝集素展示表達(dá)系統(tǒng) (圖 2A) 是將外源基因與酵母編碼 α-凝集素 C端編碼序列連接后插入質(zhì)粒載體的分泌信號(hào)肽 (Secretion signal，SS) 下游，融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后，信號(hào)肽引導(dǎo)嵌合蛋白向細(xì)胞外分泌，由于融合蛋白C-末端存在含GPI錨定信號(hào) (GPI anchor attachment signal) 的凝集素多肽序列，可將蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁上，從而將蛋白分子展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面；a-凝集素展示系統(tǒng) (圖 2B) 與 α-凝集素展示系統(tǒng)不同的是其具有由二硫鍵連接的Aga1和Aga2兩個(gè)亞基，目的蛋白通過(guò)與Aga2形成融合蛋白，再通過(guò)Aga1末端的GPI結(jié)構(gòu)使目的蛋白表達(dá)于細(xì)胞表面；絮凝素展示表達(dá)系統(tǒng)利用絮凝素基因(flo1p) 與外源基因融合，并將融合蛋白展示表達(dá)在細(xì)胞表面，此系統(tǒng)又包括兩個(gè)子系統(tǒng)：GPI錨定系統(tǒng) (圖2C) 和絮凝結(jié)構(gòu)域 (Flo1p flocculation functional domain) 錨定系統(tǒng) (圖2D)。GPI錨定系統(tǒng)是利用絮凝素 Flo1p的 C末端含有的 GPI結(jié)構(gòu)錨定外源蛋白，此系統(tǒng)與 α-凝集素展示相似；絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)是利用Flo1p的中間絮凝功能結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合，通過(guò)絮凝功能結(jié)構(gòu)域識(shí)別酵母細(xì)胞壁中的甘露聚糖鏈并通過(guò)非共價(jià)作用誘導(dǎo)細(xì)胞粘附、聚集成可逆性絮狀物。進(jìn)而使外源蛋白表達(dá)于酵母細(xì)胞表面。

圖2 酵母表面展示系統(tǒng)：(A) α-凝集素 (B) a-凝集素 (C) Flo1p C末端 (D) Flo1p N末端絮凝功能區(qū)[2,6]Fig. 2 Yeast surface display systems using α-agglutinin (A), a-agglutinin (B), C-terminus region of Flo1p (C), and N-terminus flocculation function domain of Flo1p (D)[2,6].

近年來(lái)，S. cerevisiae細(xì)胞表面展示技術(shù)迅速發(fā)展并在多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用，展現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景?？赏ㄟ^(guò)使外源蛋白固定化于 S. cerevisiae細(xì)胞表面，從而生產(chǎn)微生物細(xì)胞表面蛋白，包括淀粉酶、纖維素酶等在生物乙醇生產(chǎn)中起關(guān)鍵作用的酶蛋白，從而使酵母表面展示技術(shù)在生物乙醇生產(chǎn)應(yīng)用中不斷發(fā)展與完善，本文著重介紹了近年來(lái)酵母細(xì)胞表面工程在生物乙醇菌種開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用與研究進(jìn)展。

1 酵母細(xì)胞表面技術(shù)展示淀粉分解酶

以淀粉類生物質(zhì)為主要成分的蔗糖和糖蜜可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的乙醇生產(chǎn)，然而，以淀粉為原料生產(chǎn)生物乙醇要經(jīng)歷多步反應(yīng)而且生產(chǎn)成本偏高。導(dǎo)致成本偏高的原因主要有兩個(gè)：一是由于S. cerevisiae不能直接利用淀粉類物質(zhì)，因此在發(fā)酵過(guò)程中需要額外添加大量的葡糖淀粉酶(Glucoamylase) 和 α-淀粉酶 (α-Amylase)；二是為獲得較高的乙醇產(chǎn)量，首先要將淀粉在140 ℃~180 ℃的高溫下進(jìn)行糊化，而這也就增加了能耗。為此，大量的研究集中嘗試在 S. cerevisiae細(xì)胞表面展示淀粉分解酶，從而實(shí)現(xiàn)以淀粉類物質(zhì)為底物的大規(guī)模乙醇生產(chǎn)，并取得了一定的成果。

利用細(xì)胞表面展示技術(shù)構(gòu)建能利用淀粉的全細(xì)胞催化劑，可將編碼淀粉酶的外源基因?qū)虢湍讣?xì)胞內(nèi)使其能夠分泌淀粉酶[7]。已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒pGA11帶有編碼米根霉Rhizopus oryzae的葡糖淀粉酶基因，轉(zhuǎn)化子細(xì)胞能夠在以1%可溶性淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng)并產(chǎn)生乙醇，葡糖淀粉酶活力穩(wěn)定至少100 h，而且所表達(dá)的酶，其酶學(xué)性質(zhì)與天然酶相當(dāng)[8]。

Murai等[9]是研究細(xì)胞表面表達(dá)淀粉酶工作的先驅(qū)，他們創(chuàng)造性地通過(guò)在S. cerevisiae細(xì)胞表面展示淀粉酶來(lái)開(kāi)發(fā)重組釀酒酵母的研究策略，構(gòu)建了帶有S. cerevisiae MT8-1的GAPDH啟動(dòng)子及含有信號(hào)肽和glucoamylase/α-凝集素融合基因的載體，glucoamylase來(lái)自于R. oryzae，能有效切割淀粉 α-1,4和 α-1,6糖苷鍵。隨后，Kondo[10]等在具絮凝功能特性的酵母細(xì)胞表面展示了葡糖淀粉酶，他們的工作表明，展示在細(xì)胞表面的葡糖淀粉酶對(duì)酵母的正常生長(zhǎng)及乙醇產(chǎn)生無(wú)任何影響；厭氧發(fā)酵150 h后乙醇濃度達(dá)到20~30 g/L。但Kondo等構(gòu)建的展示葡糖淀粉酶的重組絮凝酵母在發(fā)酵300 h的情況下還能保持較高的乙醇產(chǎn)率 (0.6~0.7 g/(L·h))[10]，同時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中低濃度的葡萄糖對(duì)減少污染也極為有利。展現(xiàn)了在S. cerevisiae細(xì)胞表面展示淀粉酶的優(yōu)越性。

在批式補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中，由于缺少溶解酶——α-淀粉酶，單一展示葡糖淀粉酶的酵母菌株在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)有不溶性淀粉的積累。為克服這一問(wèn)題，Shigechi等[11-14]構(gòu)建了共展示來(lái)自R. oryzae的glucoamylase和來(lái)自嗜熱脂肪芽胞桿菌Bacillus stearothermophilus的α-amylase基因，并以可溶性淀粉為底物，進(jìn)行補(bǔ)料批式發(fā)酵。結(jié)果表明，將淀粉顆粒處理到與酵母細(xì)胞大小相近時(shí)可極大程度地提高乙醇產(chǎn)率，發(fā)酵100 h后乙醇濃度達(dá)到60 g/L，而且共展示葡糖淀粉酶和α-淀粉酶菌株的絮凝能力與只展示葡糖淀粉酶的菌株基本相同，發(fā)酵過(guò)程中酵母絮凝能力并不發(fā)生改變。在后續(xù)的研究中，Shigechi等[14]構(gòu)建了含有葡糖淀粉酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (SBD) 突變子的酵母展示株系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帶有突變子 SBD葡萄淀粉酶的菌株較野生型菌株的淀粉降解能力提高1.4倍。

Shigechi等[13]又利用低溫糊化的淀粉 (80 ℃)取代可溶性淀粉作為唯一碳源進(jìn)行乙醇發(fā)酵，結(jié)果表明：共展示葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的菌株與單展示葡糖淀粉酶的菌株相比，乙醇產(chǎn)率明顯增加，尤其是共展示菌能更快速地產(chǎn)生乙醇且無(wú)延滯期，說(shuō)明隨機(jī)水解淀粉α-1,4糖苷鍵的α-淀粉酶在淀粉水解過(guò)程中起關(guān)鍵作用。比較共展示兩種淀粉酶的菌株在低溫和高溫糊化情況下的發(fā)酵效率，無(wú)論是最大乙醇濃度、乙醇產(chǎn)率還是底物消耗率，兩種發(fā)酵系統(tǒng)都基本相同，乙醇產(chǎn)量為0.5 g/g，相當(dāng)于理論值的97.2%。更好地說(shuō)明了共展示兩種淀粉酶菌株的優(yōu)勢(shì)。

從牛鏈球菌Streptococcus bovis中分離的淀粉酶為生料淀粉的高效水解提供了新的研究思路[15]。Shigechi等[12]分別以α-凝集素和絮凝素為基礎(chǔ)，共展示來(lái)自R. oryzae的葡糖淀粉酶和來(lái)自S. bovis148的α-淀粉酶，并以生料淀粉為底物進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明α-淀粉酶活性依賴于錨定蛋白，而葡糖淀粉酶活性則獨(dú)立于錨定蛋白；對(duì)于α-淀粉酶活性，以絮凝素系統(tǒng)為基礎(chǔ)構(gòu)建的菌株要比以凝集素為基礎(chǔ)構(gòu)建的菌株酶活性高 40倍。目前已經(jīng)報(bào)道了一些α-淀粉酶具有結(jié)合生料淀粉的能力，且降解淀粉的區(qū)域位于C-末端[16]。以 α-凝集素為基礎(chǔ)的共展示菌能以生料淀粉為原料生產(chǎn)乙醇[17-19]。另一方面，基于α-凝集素和絮凝素Flo1p共展示的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶在生料發(fā)酵過(guò)程中不需要額外添加淀粉酶，在發(fā)酵過(guò)程中，淀粉濃度迅速下降，72 h乙醇濃度達(dá)到61.8 g/L，乙醇產(chǎn)量為0.44 g/L，相當(dāng)于理論值的86.5%。

利用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)從最初的單展示葡糖淀粉酶到共展示葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，均取得了較好的成果，為利用淀粉類物質(zhì)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模乙醇生產(chǎn)提供了新的思路。不過(guò)隨著生物乙醇生產(chǎn)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們開(kāi)始著眼于利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇，從而避免了第一代生物乙醇存在的與人爭(zhēng)糧的缺陷。

2 酵母細(xì)胞表面技術(shù)與第二代生物乙醇

由于第一代生物乙醇的生產(chǎn)存在著與人爭(zhēng)糧、與糧爭(zhēng)地的缺陷，發(fā)展第二代生物燃料是人們面對(duì)能源、環(huán)境與糧食問(wèn)題所采取的積極措施。利用豐富廉價(jià)的可再生木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇，是規(guī)?；l(fā)展車用燃料乙醇的基礎(chǔ)。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，占地球總生物量的40%左右，高效、廉價(jià)地利用木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為如燃料乙醇等化工產(chǎn)品，是由石油基向生物基經(jīng)濟(jì)社會(huì)過(guò)渡的基礎(chǔ)。

為此大量的研究開(kāi)始轉(zhuǎn)向展示纖維素分解酶、木糖代謝酶等，從而實(shí)現(xiàn)新的突破與嘗試，為實(shí)現(xiàn)第二代生物燃料的開(kāi)發(fā)與利用提供了一定的理論依據(jù)。

2.1 展示纖維素分解酶

在纖維素乙醇生產(chǎn)經(jīng)歷的糖化步驟形成葡萄糖的過(guò)程中，S. cerevisiae不能直接利用纖維素類物質(zhì)，因此在S. cerevisiae中穩(wěn)定表達(dá)纖維素酶是降低生產(chǎn)成本的有效方法?；讦?凝集素C端構(gòu)建的pCMC11含有來(lái)自棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的內(nèi)切羧甲基纖維素酶 (CMCase) 編碼基因，Murai 等[20]通過(guò)一系列方法證明了cmcase基因成功地錨定在細(xì)胞表面，內(nèi)切羧甲基纖維素酶活性穩(wěn)定至少120 h。當(dāng)pCMC11和含有β-bgl1的載體 (pBG211) 共表達(dá)時(shí)，可以快速地將纖維低聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而顯著地提高了利用纖維素的效率。目前已報(bào)道了很多在S. cerevisiae中表達(dá)多種纖維素酶基因和能夠糖化可溶性纖維寡糖的重組釀酒酵母[21-22]。

Fujita等同樣基于 α-凝集素系統(tǒng)在S. cerevisiae細(xì)胞表面展示來(lái)自絲狀真菌里氏木霉 Trichoderma reesei的內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ的融合蛋白，酵母菌株能明顯提高對(duì)大麥β-葡聚糖的水解能力；隨后，構(gòu)建了共表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ和來(lái)自A. aculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ的酵母株系，這種酵母能在以大麥 β-葡聚糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在50 h內(nèi)將β-葡聚糖發(fā)酵生成乙醇，乙醇產(chǎn)量為0.48 g/g，相當(dāng)于理論值的93.3%，且發(fā)酵培養(yǎng)基中的 β-葡聚糖能在酵母細(xì)胞表面連續(xù)水解為葡萄糖，在胞內(nèi)酶的作用下，立即被利用，轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖肌Ｍ瑫r(shí)，酵母細(xì)胞的酶活測(cè)定結(jié)果和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果表明：共展示菌中內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ和 β-葡糖苷酶Ⅰ分子的數(shù)量大于單展示菌中內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ或 β-葡糖苷酶Ⅰ分子數(shù)的總和[23]。其后，F(xiàn)ujita研究小組[24]將來(lái)自T. reesei的纖維二糖水解酶Ⅱ也增加到展示系統(tǒng)中，從而使酵母細(xì)胞真正具有水解無(wú)定形纖維素能力，同步糖化發(fā)酵生成乙醇，結(jié)果顯示共展示內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ和纖維二糖水解酶Ⅱ的菌株比只展示內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ的菌株對(duì)無(wú)定形纖維素的水解能力高，且主要產(chǎn)物是纖維二糖，單展示纖維二糖水解酶Ⅱ的菌株主要產(chǎn)物是少量的纖維二糖，單展示內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ的菌株主要產(chǎn)物是纖維二糖、纖維三糖，而共展示 β-葡糖苷酶Ⅰ和內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ的菌株無(wú)乙醇產(chǎn)生。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基里，雖然在40 h內(nèi)所有無(wú)定形纖維素不能被完全利用，但其發(fā)酵能力也達(dá)到10 g/L纖維素可產(chǎn)生3 g/L的酒精。即每克碳水化合物可產(chǎn) 0.45 g/g酒精，相當(dāng)于理論值的88.5%，可他們并沒(méi)有報(bào)道在纖維素為唯一碳源的條件下該酵母的發(fā)酵能力。Shuhei等[25]以共展示三種纖維素酶的重組酵母 (內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ、纖維二糖水解酶Ⅱ、β-葡糖苷酶Ⅰ) 和共展示兩種纖維素酶的菌株 (內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ和纖維二糖水解酶Ⅱ) 的發(fā)酵效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明前者的乙醇產(chǎn)量明顯優(yōu)于后者。

姚淑敏等[26]也成功地將來(lái)自裂殖酵母的β-葡糖苷酶Ⅰ以其活性形式展示在S. cerevisiae細(xì)胞表面，誘導(dǎo)表達(dá)后的 β-葡糖苷酶Ⅰ酶活測(cè)定顯示，重組酵母菌株誘導(dǎo)培養(yǎng) 12 h后有酶活，到48 h酶活達(dá)到最高，最適作用的pH為7.0，最適作用溫度為45 ℃。

目前，利用酵母細(xì)胞表面技術(shù)展示纖維素酶，無(wú)論單展示還是共展示，均取得了一定的進(jìn)展，雖然現(xiàn)階段局限于實(shí)驗(yàn)室階段，但相比較而言，在底物利用上已經(jīng)取得了一定的突破。

2.2 展示木糖代謝途徑關(guān)鍵酶

S. cerevisiae是傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)菌株，由于沒(méi)有專一性轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的酶系，不能很好地利用木糖。其中木糖的跨膜運(yùn)輸被認(rèn)為是工程菌利用木糖的障礙之一。S. cerevisiae沒(méi)有專一性木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，木糖運(yùn)輸是由非專一性的已糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成，而此類蛋白對(duì)于木糖的親和力遠(yuǎn)低于葡萄糖[27]。目前也有部分研究集中于展示木糖代謝途徑的關(guān)鍵酶，以填補(bǔ)S. cerevisiae不能利用木糖的缺陷，更好地利用底物生產(chǎn)燃料乙醇，提高底物利用率。Satoshi Katahira等[28]將來(lái)自 T. reesei的木聚糖酶和米曲霉 Aspergillus oryzae的β-木糖苷酶成功地展示在S. cerevisiae細(xì)胞表面，改變了S. cerevisiae的代謝途徑，實(shí)現(xiàn)了酵母直接發(fā)酵來(lái)源于白樺木的木聚糖生產(chǎn)乙醇的工藝。結(jié)果表明這兩個(gè)酶缺一不可，只有在兩者同時(shí)存在的情況下才能將木聚糖轉(zhuǎn)化為木糖。因?yàn)镾. cerevisiae不能直接利用木糖生產(chǎn)酒精，所以要向S. cerevisiae導(dǎo)入來(lái)自畢赤酵母的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶以及 S. cerevisiae本身的木酮糖激酶，它們共同作用再將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5磷酸，從而使S. cerevisiae能利用木糖；該重組酵母經(jīng) 62 h發(fā)酵后產(chǎn)生酒精濃度為7.1 g/L，表明每克碳水化合物可產(chǎn)0.30 g酒精，是理論值的58%。雖然該重組酵母產(chǎn)酒精能力明顯不足，但該實(shí)驗(yàn)為今后開(kāi)發(fā)利用半纖維素指出了一條出路。侯進(jìn)等[29]基于α-凝集素系統(tǒng)，將來(lái)源于嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus的木糖異構(gòu)酶基因xylA，插入到S. cerevisiae蔗糖酶信號(hào)肽序列與α-凝集素的C端編碼序列之間，形成融合表達(dá)框，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pSY-xy222，轉(zhuǎn)化S. cerevisiae H158。含重組質(zhì)粒的菌株H158-SXI木糖異構(gòu)酶活性測(cè)定表明，細(xì)胞壁上酶活測(cè)定值為1.53 U，木糖異構(gòu)酶在S. cerevisiae細(xì)胞壁上得到活性表達(dá)。木糖葡萄糖共發(fā)酵結(jié)果顯示，重組菌株木糖利用率較出發(fā)菌株提高了17.8%。陳璐菲等[30]利用S. cerevisiae表面展示系統(tǒng)，將來(lái)源于C. tropicalis的木糖還原酶基因xyll嵌入帶有 His-Tag的 S. cerevisiaea-凝集素展示載體pICAS-His，構(gòu)建重組質(zhì)粒pICASHis-Ctxyll，并轉(zhuǎn)化宿主菌S. cerevisiae MT8-l，通過(guò)流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)和篩選，得到重組菌株MT8-1/pICAS-His-Ctxyll。將重組酵母用于葡萄糖 (15 g/L) 和木糖 (5 g/L) 的混合糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，重組酵母MT8-1/pICAS-His-Ctxyll細(xì)胞具有良好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶特性，同時(shí)能轉(zhuǎn)化木糖產(chǎn)生木糖醇，將2.5 g/L木糖轉(zhuǎn)化生成2.5 g/L木糖醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)98.7%。

通過(guò)展示木糖代謝途徑關(guān)鍵酶的重組釀酒酵母在發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的過(guò)程中，木糖異構(gòu)酶雖有一定的活性表達(dá)，但利用木糖產(chǎn)乙醇的木糖利用率并沒(méi)有太大的改善，雖然此部分研究工作依舊面臨著很多的問(wèn)題與挑戰(zhàn)，但這些工作為解決S. cerevisiae代謝工程菌株的木糖利用問(wèn)題做出了新的研究與嘗試。

2.3 基于展示技術(shù)的纖維素乙醇統(tǒng)合加工

為了降低生產(chǎn)成本，可以將纖維素糖化和發(fā)酵等幾步反應(yīng)過(guò)程合并在一步反應(yīng)里完成，即統(tǒng)合生物加工 (CBP)。CBP要求某種“超級(jí)”微生物具有既能水解纖維素又能利用水解纖維素產(chǎn)生的糖類發(fā)酵產(chǎn)酒精，可自然界中沒(méi)有哪個(gè)已知微生物能滿足 CBP這樣的要求。改造現(xiàn)有微生物也就成為唯一的選擇[31]。在S. cerevisiae細(xì)胞表面分別表達(dá)T. reesei的兩種編碼纖維二糖水解酶：纖維二糖水解酶Ⅰ和纖維二糖水解酶Ⅱ的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (CBD) 基因，同時(shí)也構(gòu)建了兩個(gè)串聯(lián)排列的CBDI和CBDⅡ融合基因，在細(xì)胞表面表達(dá)兩種CBD。表達(dá)CBDⅠ和CBDⅡ的兩種酵母展示細(xì)胞的CBD具有相似的結(jié)合纖維素的能力，而表達(dá)CBDⅠ和CBDⅡ融合蛋白的酵母細(xì)胞比單表達(dá)CBD的酵母細(xì)胞具有更強(qiáng)的纖維素結(jié)合力。展示酵母細(xì)胞的結(jié)合率主要依賴于展示在細(xì)胞表面的CBD分子多少。有CBD和突變CBD酵母展示細(xì)胞可用于分析CBD與纖維素的結(jié)合機(jī)制。而構(gòu)建共展示CBD和靶酶的酵母細(xì)胞，將可以實(shí)現(xiàn)在纖維素濾器上構(gòu)建連續(xù)的或多步酶反應(yīng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。

纖維小體是近年來(lái)研究的較熱門的一個(gè)話題，根據(jù)細(xì)胞表面展示技術(shù)把纖維小體展示在產(chǎn)酒精微生物表面，在纖維素乙醇的生物轉(zhuǎn)化中具有重要的價(jià)值，纖維小體實(shí)際上是一個(gè)微型而高效的纖維素降解機(jī)器。現(xiàn)在已經(jīng)有學(xué)者提出了通過(guò)人工設(shè)計(jì)并通過(guò)工程手段改造天然纖維小體的新思路[32]。Tsai研究小組[33]利用來(lái)自厭氧菌的纖維素酶構(gòu)建了迷你纖維小體并重組到酵母細(xì)胞中。他們首先選擇熱纖梭菌 Clostridium thermocellum 的內(nèi)切葡聚糖酶和解纖維梭菌Clostridium cellulolyticum的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶構(gòu)建迷你纖維小體，這個(gè)纖維小體仍有水解纖維素的協(xié)調(diào)能力。而一旦將 C. cellulolyticum的內(nèi)切葡聚糖酶換成β-葡糖苷酶，就可使新的纖維小體具有了纖維素酶的三大酶組分，其水解纖維素能力不但得到提高而且還能發(fā)酵產(chǎn)酒精。在以無(wú)定形纖維素 (PASC) 為唯一碳源的培養(yǎng)基里，該酵母發(fā)酵能力為每10 g/L的PASC可產(chǎn)生3.5 g/L的酒精。即每克碳水化合物可產(chǎn)0.49 g酒精，相當(dāng)于理論值的95%。而同樣是以PASC為唯一碳源，Den Haan研究小組[34]因沒(méi)有采用纖維小體形式改造酵母，其效果大打折扣。Den Haan等嘗試將來(lái)自T. reesei的egl1和扣囊復(fù)膜孢酵母 Saccharomycopsis flbuligera的bgl1整合到S. cerevisiae中表達(dá)。雖然都檢測(cè)到有酶活并能利用PASC發(fā)酵生產(chǎn)酒精，但其發(fā)酵酒精的濃度只為 1 g/L。從這兩個(gè)小組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明顯看出纖維小體的優(yōu)勢(shì)。

開(kāi)發(fā)應(yīng)用這種集纖維素水解和發(fā)酵于一身的共展示酵母株系，對(duì)發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。這些實(shí)驗(yàn)證明了利用共展示纖維素降解酶的S. cerevisiae發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的高效性和同步糖化發(fā)酵法的可行性。表1中列出了部分研究中已構(gòu)建的共展示纖維素酶的菌株或質(zhì)粒。

表1 共展示纖維素酶的菌株與質(zhì)粒Table 1 Characteristics of strains and plasmids for codisplaying cellulolytic enzyme

本實(shí)驗(yàn)室一直致力于纖維素乙醇生產(chǎn)菌種的構(gòu)建，并且已經(jīng)成功地構(gòu)建了基于專利菌株S. cerevisiaeY5的共代謝葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母[36]。在以往的研究中，利用野生型工業(yè)菌株S. cerevisiae進(jìn)行纖維素降解酶的展示研究還未見(jiàn)報(bào)道。在前期的工作中，本實(shí)驗(yàn)室利用了野生型二倍體工業(yè)菌株S. cerevisiaeY5，基于a-凝集素構(gòu)建了一個(gè)能夠有效地接受外源基因，并可以在宿主細(xì)胞表面特異性表達(dá)的展示系統(tǒng)，并成功展示了來(lái)自A. aculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ，該展示菌株能夠在以纖維二糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，首次實(shí)現(xiàn)了野生型二倍體菌株為宿主的纖維素酶展示。在今后的研究工作中，我們將來(lái)自絲狀真菌與纖維素降解有關(guān)的酶類展示在酵母表面，并嘗試在野生型二倍體工業(yè)菌株中實(shí)現(xiàn)多種纖維素酶的展示，以期進(jìn)一步闡述纖維素的作用機(jī)理。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的自我固定化，并研究以纖維素為唯一碳源的底物利用情況，對(duì)比展示前后酶的活性變化，通過(guò)消除或減少添加纖維素酶才能完成的糖化步驟，努力實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞催化纖維素乙醇的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，以期大大地降低生物乙醇的生產(chǎn)成本。

3 展望

利用S. cerevisiae細(xì)胞表面技術(shù)展示纖維素降解酶的研究已取得一定的研究成果，該系統(tǒng)已經(jīng)得到成功開(kāi)發(fā)，但是在這一領(lǐng)域里仍有許多亟待解決的問(wèn)題，例如：展示在細(xì)胞表面的纖維素酶的活性與游離酶相比有所下降；成功展示的纖維素酶穩(wěn)定性有待提高；對(duì)于該技術(shù)的研究目前僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，還未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等。今后，此領(lǐng)域的研究還需更多的發(fā)展和完善，包括開(kāi)發(fā)更多的具固定化展示功能的細(xì)胞壁甘露糖蛋白；進(jìn)一步提高現(xiàn)有展示的纖維素酶的穩(wěn)定性、表達(dá)量及活性；建立更多的展示酶篩選技術(shù)；克服生產(chǎn)中擴(kuò)大培養(yǎng)、乙醇抑制等難題。相信隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，該領(lǐng)域必將取得更大的進(jìn)步，以酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)為基礎(chǔ)的纖維素乙醇工業(yè)將更大程度地服務(wù)于人類社會(huì)。

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