血紅素氧合酶-1在姜黃素抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用

鐘 毅,賴文巖,劉挺榕,郭志剛

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科,廣州 510515)

血紅素氧合酶-1在姜黃素抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用

鐘 毅,賴文巖,劉挺榕,郭志剛△

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科,廣州 510515)

目的觀察姜黃素對氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響,并探討血紅素氧合酶-1(HO-1)在姜黃素抑制血管平滑肌細胞增殖中的作用及機制?方法 體外分離培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞并行免疫組化鑒定,以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細胞增殖率?逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測HO-1mRNA水平,蛋白免疫印跡法(Western blot)分別檢測HO-1及增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達水平?結(jié)果Ox-LDL呈濃度依賴性(0～150μg/mL)地誘導(dǎo)VSMC增殖,達到200μg/mL具有細胞毒性;姜黃素呈濃度依賴性(40?80μmol/L)地抑制 Ox-LDL(100μg/mL)所誘導(dǎo)的VSMC增殖,HO-1抑制劑鋅原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)可明顯減弱此抑制效應(yīng);姜黃素可誘導(dǎo)VSMC上調(diào)HO-1mRNA和蛋白表達;姜黃素可減弱Ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖細胞核抗原的高表達,此效應(yīng)可被HO-1抑制劑ZnPPⅨ抑制?結(jié)論姜黃素通過降低HO-1介導(dǎo)的PCNA表達,進而抑制Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌增殖?

姜黃素;氧合酶類;脂蛋白類,LDL

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生機制十分復(fù)雜,目前研究表明氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)及血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要病理基礎(chǔ)[1]?姜黃素是從姜黃?郁金?莪術(shù)等植物中提取的一種生物多酚化合物,研究顯示姜黃素具有抗炎?抗氧化?促細胞凋亡和抑制細胞增殖等藥理作用,這些作用可有效拮抗AS的發(fā)生與發(fā)展?血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血紅素降解的起始酶和限速酶,發(fā)揮著抗炎?抗氧化?抑制細胞凋亡和改善組織微循環(huán)作用,動物研究已經(jīng)證明過表達HO-1可以明顯延緩AS進展[2],但是姜黃素抗AS的相關(guān)機制還不甚清楚?本研究旨在于細胞水平探討姜黃素對Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖的影響及其相關(guān)機制,為其藥理作用提供理論基礎(chǔ)?

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基?胎牛血清?胰蛋白酶購自美國Gibico公司;姜黃素?鋅原卟啉Ⅸ(zine protoporphyrinⅨ,Zn-PPⅨ)購自Sigma公司;Ox-LDL購于北京普博斯生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑均購自美國Invitrogen公司;一抗?二抗均購于美國Santa Cruz公司;SD大鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;其余實驗相關(guān)產(chǎn)品購自碧云天生物技術(shù)公司?

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與實驗分組按常規(guī)組織貼塊方法[3]原代培養(yǎng)并傳代,取用第3～8代細胞?免疫組化法鑒定血管平滑肌細胞?血管平滑肌細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃?5%CO2下培養(yǎng)?實驗分組:(1)正常對照組:不加任何處理;(2)不同終濃度 Ox-LDL刺激組(0?50?100?150?200?250μg/mL);(3)不同終濃度姜黃素組(0?20?40?80μmol/L);(4)不同終濃度姜黃素組(0?20?40?80μmol/L)+Ox-LDL(100μg/mL)組;(5)Ox-LDL(100μg/mL)+姜黃素組;(6)姜黃素+ZnPPⅨ+Ox-LDL(100μg/mL)組?

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測 HO-1mRNA 按 Trizol試劑盒說明提取總RNA?取細胞RNA 1μL根據(jù)試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進行PCR擴增?HO-1:上游5′GGGTGACAGAAGAGGCTAAGACC 3′,下 游 5′ AGATTCTCCCCTGCAGAG AGAAG 3′?擴增條件:94℃ 變性30s,56℃退火30s,72℃ 延伸45s,循環(huán)30次?電泳條帶采用凝膠成像系統(tǒng)分析?

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法比色測定VSMC增殖率 VSMC接種96孔培養(yǎng)板中(每孔1×104個細胞)孵育24h,換無血清DMEM培養(yǎng)基24h后棄培養(yǎng)液,按實驗分組加入藥物?20h后加入5mg/mL MTT 10μL,孵育4h,終止反應(yīng)?棄孔內(nèi)培養(yǎng)液上清液加二甲基亞砜100μL,選擇492nm自動酶標光度計測定各孔吸光度值?細胞增殖率計算公式:細胞增殖率(cell viability)= 處理孔A492/對照孔 A492×100%?

1.2.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測 HO-1及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表達水平 收集細胞并加入細胞裂解液裂解細胞,離心收集上清液,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測蛋白濃度?蛋白(30μg)經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDSPAGE)分離后轉(zhuǎn)移至聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜?5%牛血清清蛋白室溫封閉4h,加入一抗4℃過夜?二抗室溫孵育2h,最后顯像?

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)均采用±s表示,采用單因素方差分析,總體有差異兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法?采用SPSS13.0軟件進行分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血管平滑肌細胞鑒定 培養(yǎng)的第3代細胞經(jīng)免疫細胞化學(xué)檢測,特異性的α-actin在免疫細胞化學(xué)染色后,胞漿著色,呈陽性反應(yīng),在鏡下可見胞漿內(nèi)大量棕色?與細胞長軸平行的纖維細絲,即平滑肌α肌動蛋白,見封3圖1?

2.2 Ox-LDL對誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響 Ox-LDL呈濃度依賴性(0～150μg/mL)地誘導(dǎo) VSMC增殖,但是當達到200μg/mL刺激組時,細胞數(shù)目減少,提示到達此濃度可能具備細胞毒性?各個濃度刺激組與空白對照組相比,細胞增殖顯著,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),見圖2?

2.3 姜黃素對Ox-LDL刺激的VSMCs增殖的影響 不同終濃度的姜黃素(40?80μmol/L)可明顯抑制 Ox-LDL(100μg/mL)誘導(dǎo)的細胞增殖效應(yīng),且呈濃度依賴性;姜黃素(40?80 μmol/L)+Ox-LDL組與 Ox-LDL單獨作用組相比,細胞增殖率顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),見圖3?

圖2 Ox-LDL對誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響

2.4 HO-1抑制劑ZnPPⅨ對姜黃素抑制Ox-LDL所誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響 給予HO-1抑制劑ZnPPⅨ預(yù)處理細胞后,姜黃素抑制Ox-LDL所誘導(dǎo)的VSMCs增殖效應(yīng)減弱;姜黃素+ZnPPⅨ+Ox-LDL組與姜黃素+Ox-LDL組相比,細胞增殖率增加明顯(P0.05),見圖4?

2.5 姜黃素對VSMC的HO-1表達的影響 不同濃度姜黃素組干預(yù)VSMC的HO-1mRNA和蛋白表達水平明顯高于空白對照組,實驗重復(fù)3次,見封4圖5?

2.6 姜黃素對Ox-LDL刺激VSMC的PCNA表達的影響

相比較于空白對照組,Ox-LDL可明顯增強PCNA的表達;而姜黃素+Ox-LDL組與Ox-LDL組單獨作用比較,可明顯抑制PCNA的表達;在加入HO-1抑制劑ZnPPⅨ后,姜黃素+Ox-LDL組的抑制PCNA表達效應(yīng)可被減弱,實驗重復(fù)3次,見封4圖6?

圖3 姜黃素對 Ox-LDL(100μg/mL)所誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響

圖4 ZnPPⅨ對姜黃素抑制Ox-LDL所誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響

3 討 論

平滑肌細胞增殖是AS斑塊形成過程中的重要環(huán)節(jié),大量研究表明動脈血管壁增厚至斑塊形成是AS病變的主要病理特征?Ox-LDL促進AS形成的作用已被大量的研究所證實?目前認為AS形成初期步驟是LDL進入內(nèi)皮損傷部位的血管壁,氧化?誘導(dǎo)多種趨化因子,并激活單核細胞分泌不同的生長因子和細胞因子,刺激平滑肌細胞遷移?增殖?因此,Ox-LDL在AS中起到關(guān)鍵作用?

HO-1是血紅素降解的起始酶和限速酶,HO-1通過降解血紅素產(chǎn)生一氧化碳(carbon monoxide,CO)?膽綠素和鐵離子?膽綠素進一步經(jīng)膽綠素還原酶作用生成膽紅素,而鐵離子能誘導(dǎo)鐵蛋白的合成[4]?HO-1的這些終產(chǎn)物具有抗炎?抗氧化?抗凋亡和抗血栓的作用;另外,CO和膽色素通過影響血管平滑肌細胞?內(nèi)皮細胞?內(nèi)皮祖細胞和粒細胞的增殖?遷移和黏附保護受損動脈血管內(nèi)平衡[5]?姜黃素是中藥姜黃的主要成分,其抗炎?抗氧化?抗腫瘤?抗血栓以及心血管的保護作用已經(jīng)被證實[6]?目前已經(jīng)有研究表明姜黃素具有抗細胞增殖的作用,但是具體機制還不甚清楚[7-8]?根據(jù)其眾多藥理作用與HO-1保護作用相似,姜黃素的相關(guān)保護作用是否經(jīng)過HO-1介導(dǎo)值得研究?

本研究結(jié)果顯示,Ox-LDL在一定濃度范圍內(nèi)濃度依賴性地誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖,當超過一定濃度,具備細胞毒性?此實驗發(fā)現(xiàn)與Chang等[9]的研究結(jié)果相類似,說明了Ox-LDL對血管平滑肌細胞增殖影響的特點,其機制可能是通過激活Ras/Raf/MEK/MAPK通路促進細胞有絲分裂[10]?與之類似,Schwer等[11]也發(fā)現(xiàn)姜黃素 HO-1介導(dǎo)抑制胰腺星狀細胞的增殖由阻遏ERK1/2磷酸化的機制實現(xiàn)?同時,本組也發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖,并且此抑制效應(yīng)可被HO-1的抑制劑ZnPPⅨ部分阻斷?這提示HO-1很可能參與了姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖的保護效應(yīng)?同樣,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在球囊損傷的大鼠模型中,HO-1介導(dǎo)NO抑制大鼠血管平滑肌增殖,從而顯著地抑制了內(nèi)膜增生[12]?為了進一步證實此發(fā)現(xiàn),本組觀察了姜黃素對血管平滑肌細胞HO-1mRNA和蛋白表達的影響,發(fā)現(xiàn)姜黃素可顯著地上調(diào)血管平滑肌細胞HO-1mRNA和蛋白表達?綜上所得出的實驗結(jié)果,提示姜黃素抗Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖的作用經(jīng)過HO-1介導(dǎo)?

PCNA又稱周期蛋白,是一種與細胞增殖周期有關(guān)的核內(nèi)糖蛋白,是DNA復(fù)制的必需成分,其表達與細胞增殖活性有關(guān),是使細胞由靜息期進入S期的關(guān)鍵蛋白[13],已成為評價細胞增殖狀態(tài)的一項客觀指標?本組研究發(fā)現(xiàn)HO-1抑制劑上調(diào)姜黃素抑制Ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖細胞核抗原高表達,提示HO-1介導(dǎo)的抑制增殖的效應(yīng)可能部分通過抑制PCNA表達實現(xiàn)?另外研究發(fā)現(xiàn)HO-1的抗增殖效應(yīng)通過上調(diào)細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子P21[14],P21是細胞周期素蛋白cdk-2抑制蛋白,cdk-2亦是細胞周期G1和S期調(diào)節(jié)關(guān)鍵?Liu等[15]以含HO-1基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠主動脈平滑肌細胞,被轉(zhuǎn)染的大鼠主動脈平滑肌細胞以劑量依賴方式表達HO-1mRNA?HO-1蛋白和提高酶的活性,刺激促凋亡基因p53表達,促進VSMCs凋亡而抑制血清刺激的VSMCs增殖?

綜上所述,姜黃素顯著地抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠VSMC增殖,其機制是由HO-1介導(dǎo)的PCNA表達下調(diào)實現(xiàn)的?這為進一步研究姜黃素防治AS提供了一定的理論依據(jù)?

[1] Lusis AJ.Atherosclerosis[J].Nature,2000,407(6801):233-241.

[2] Li Q,Guo Y,Ou Q,et al.Gene transfer of inducible nitric oxide synthase affords cardioprotection by upregulating heme oxygenase-1via a nuclear factor-{kappa}B-dependent pathway[J].Circulation,2009,120(13):1222-1230.

[3] Owens GK,Loeb A,Gordon D,et al.Expression of smooth muscle-specific alpha-isoactin in cultured vascular smooth muscle cells:relationship between growth and cytodifferentia-tion[J].J Cell Biol,1986,102(2):343-352.

[4] Durante W.Protective role of heme oxygenase-1against inflammation in atherosclerosis[J].Front Biosci,2011,17:2372-2388.

[5] Durante W.Targeting heme oxygenase-1in vascular disease[J].Curr Drug Targets,2010,11(12):1504-1516.

[6] Goel A,Kunnumakkara AB,Aggarwal BB.Curcumin as“Curecumin”:from kitchen to clinic[J].Biochem Pharmacol,2008,75(4):787-809.

[7] Huang HC,Jan TR,Yeh SF.Inhibitory effect of curcumin,an anti-inflammatory agent,on vascular smooth muscle cell proliferation[J].Eur J Pharmacol,1992,221(2/3):381-384.

[8] Qin L,Yang YB,Tuo QH,et al.Effects and underlying mechanisms of curcumin on the proliferation of vascular smooth muscle cells induced by Chol:MbetaCD[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,379(2):277-282.

[9] Chang WC,Yu YM,Chiang SY,et al.Ellagic acid suppresses oxidised low-density lipoprotein-induced aortic smooth muscle cell proliferation:studies on the activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2and proliferating cell nuclear antigen expression[J].Br J Nutr,2008,99(4):709-714.

[10]Yang CM,Chien CS,Hsiao LD,et al.Mitogenic effect of oxidized low-density lipoprotein on vascular smooth muscle cells mediated by activation of Ras/Raf/MEK/MAPK pathway[J].Br J Pharmacol,2001,132(7):1531-1541.

[11]Schwer CI,Guerrero AM,Humar M,et al.Heme oxygenase-1inhibits the proliferation of pancreatic stellate cells by repression of the extracellular signal-regulated kinase1/2pathway[J].J Pharmacol Exp Ther,2008,327(3):863-871.

[12]Cerrito MG,Scagliarini A,Froio A,et al.Heme oxygenase-1inhibition prevents intimal hyperplasia enhancing nitric oxide-dependent apoptosis of vascular smooth muscle cells[J].Biol Pharm Bull,2011,34(8):1204-1214.

[13]Morris GF,Mathews MB.Regulation of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle[J].J Biol Chem,1989,264(23):13856-13864.

[14]Notoya M,Nishimura H,Woo JT,et al.Curcumin inhibits the proliferation and mineralization of cultured osteoblasts[J].Eur J Pharmacol,2006,534(1-3):55-62.

[15]Liu XM,Chapman GB,Wang H,et al.Adenovirus-mediated heme oxygenase-1gene expression stimulates apoptosis in vascular smooth muscle cells[J].Circulation,2002,105(1):79-84.

Role of heme oxygenase-1 on curcumin inhibiting rat vascular smooth muscle cells proliferation induced by oxidized low density lipoprotein

,,,
(,,,,510515,)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of curcumin on oxidized(Ox)-low density lipoprotein(LDL)-induced rat vascular smooth muscle cells proliferation and to explore the role of heme oxygenase-1in this process.MethodsThe cultured aortic smooth muscle cells isolated from male Sprague-Dawley rats were verified by immunohistochemistry.The cell viability was assayed by MTT,and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)was performed to determine the level of HO-1mRNA.In addition,HO-1and PCNA expression were analyzed by Western blotting.ResultsThe Ox-LDL remarkably stimulated VSMCs proliferation in a concentration-dependent manner(0-150μg/ml),however,the doses that exceeded 200mg/ml had a cytotoxic effect.Curcumin also attenuated the VSMCs proliferation effect of Ox-LDL in a concentration-dependent manner(40,80μM),the inhibitory effect was blocked by a HO-1inhibitor(zine protoporphyrinⅨ,ZnPPⅨ).Curcumin significantly upregulated HO-1mRNA and protein expression in a concentration-dependent manner.Furthermore,ZnPPⅨblocked the inhibitory effect of curcumin on Ox-LDL-induced PCNA expression.ConclusionCurcumin inhibits Ox-LDL-induced rat vascular smooth muscle cells proliferation via HO-1-mediated down-regulation of PCNA expression.

curcumin;oxygenases;lipoproteins,LDL

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.018

A

1671-8348(2012)16-1609-03

△ 通訊作者,Tel:(020)61641508;E-mail:guozhigang126@126.com?

2011-09-11

2011-12-22)

?基礎(chǔ)研究?