噬菌體療法治療大腸埃希菌感染的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景*

劉 平,鄔亭亭,彭 麗,郭述良 綜述,羅永艾審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 400016)

噬菌體療法治療大腸埃希菌感染的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景*

劉 平,鄔亭亭,彭 麗,郭述良 綜述,羅永艾△審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 400016)

細(xì)菌噬菌體;埃希菌屬;治療應(yīng)用

大腸埃希菌(Escherichia coli)是醫(yī)院獲得性感染常見致病菌,在臨床分離的致病菌中僅次于銅綠假單胞菌,排在第2位,主要引起呼吸道?泌尿道?傷口?膽道感染,腹膜炎?敗血癥及腦膜炎等?近年來細(xì)菌流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明,大腸埃希菌耐藥率逐年上升,已成為臨床治療面臨的一大難題[1]?

噬菌體(bacteriophage,phage)是感染細(xì)菌?真菌?放線菌和螺旋體等微生物的病毒的總稱,分布極廣,凡是有細(xì)菌的場所,就可能有相應(yīng)噬菌體的存在?裂解性噬菌體侵入宿主細(xì)胞后,隨即引起宿主細(xì)胞裂解,利用這一特性可以用于治療感染性疾病?自發(fā)現(xiàn)噬菌體以來,研究者就嘗試采用噬菌體治療細(xì)菌性感染?近年來,由于各種耐藥性病原菌出現(xiàn),新型抗生素的研發(fā)越來越困難,同時,隨著大量噬菌體基因組的測序,研究者對噬菌體的進(jìn)化史?噬菌體和宿主間相互作用?噬菌體生態(tài)學(xué)有了更深的了解,噬菌體療法的知識背景和技術(shù)手段逐漸成熟以及噬菌體作為一種抗菌劑,具有特異性強(qiáng)?自我增殖快?來源廣等一些其他抗菌劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn),噬菌體療法成為抗耐藥菌研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[2]?研究者報道了一系列應(yīng)用噬菌體治療大腸埃希菌感染的研究,來觀察噬菌體治療感染性疾病,特別是抗生素耐藥菌導(dǎo)致的感染性疾病的潛力?采用噬菌體療法的動物實驗可以明確噬菌體在大腸埃希菌感染中的治療潛力并探尋最佳治療方案,是噬菌體療法用于人體前非常關(guān)鍵的一步?現(xiàn)就相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述?

1 噬菌體治療大腸埃希菌感染的潛力

目前研究者報道了一系列應(yīng)用噬菌體治療大腸埃希菌導(dǎo)致的小鼠?肉雞?牛?羊羔?豬等動物的腹瀉?呼吸道感染?敗血癥及腦膜炎等的研究成果?大多數(shù)研究報道噬菌體能減少動物荷菌量,降低病死率,延長生存期,甚至能治愈大腸埃希菌感染[3-18]?Smith?Huggins[4]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌感染小鼠后立即用噬菌體Φ9882治療,24～168h小鼠存活率為100%,而生理鹽水對照組存活率為0?研究發(fā)現(xiàn)噬菌體SPR02?DAF06可降低感染大腸埃希菌的肉雞的病死率,當(dāng)噬菌體劑量為108噬斑形成單位(plaque forming units,PFU)時病死率為0[11-17];Smith等[9]甚至發(fā)現(xiàn)低劑量105PFU 的噬菌體B85/1?B85/2,單次給藥也能治愈小牛大腸埃希菌導(dǎo)致的腹瀉?噬菌體除用于治療外,還能預(yù)防性應(yīng)用,預(yù)防動物遭受大腸埃希菌的感染?比如將102PFU噬菌體噴灑于牛圈中,或?qū)⑿∨０仓糜诮邮苓^噬菌體治療的小牛曾生活過的牛圈中,即對新生小牛具有保護(hù)作用[9]?Huff等[11]也發(fā)現(xiàn)先用噬菌體噴霧給藥7d后,再用大腸埃希菌感染肉雞,噬菌體預(yù)防組肉雞病死率較對照組下降?

但是少數(shù)實驗并未觀察到噬菌體具有治療作用,或者動物荷菌量短暫降低后又恢復(fù)到對照組水平[19-23]?Stanford等[21]報道將噬菌體包入聚合物膠囊,或者摻入飼料中經(jīng)口給藥可以減輕噬菌體被胃酸失活,但是牛體內(nèi)的大腸埃希菌荷菌量并沒有減少?研究發(fā)現(xiàn)噬菌體能減少羊腸內(nèi)大腸埃希菌荷菌量,但沒有根除病原菌[20-21]?還有研究發(fā)現(xiàn)未用噬菌體處理的對照組體內(nèi)也檢出噬菌體,并且體內(nèi)檢出的噬菌體滴度與直腸給藥組相近,口服給藥組?直腸給藥組?口服和直腸給藥組以及對照組荷菌量無明顯差異[22]?

噬菌體療法對不同動物的大腸埃希菌感染療效有所不同?噬菌體療法對小鼠?肉雞大腸埃希菌感染有較好療效,并能預(yù)防其遭受大腸埃希菌感染,而對大腸埃希菌導(dǎo)致的羊和牛的腹瀉療效不確切[3-24],有的實驗發(fā)現(xiàn)噬菌體能治愈大腸埃希菌導(dǎo)致的羊和牛的腹瀉,而有的實驗卻發(fā)現(xiàn)噬菌體治療組和空白對照組療效無差異[8-23]?Stanford等[21]發(fā)現(xiàn)同一噬菌體 對小鼠腹瀉療效好,對羊的腹瀉卻療效欠佳?

2 影響噬菌體療法療效的因素

2.1 給藥方式

2.1.1 給藥途徑 噬菌體治療大腸埃希菌感染給藥途徑有噬菌體摻入飲用水給藥?灌胃?直腸給藥?腹腔注射?霧化吸入?肌肉注射等,不同給藥途徑的治療效果不同?噬菌體摻入飲用水中給藥對不同部位的感染療效不同,對呼吸道感染無治療作用[12],但長期給藥能降低腹瀉小鼠腸道荷菌量[23]?灌胃給藥途徑對治療大腸埃希菌導(dǎo)致的小鼠?肉雞腹瀉療效好,而對羊和 牛的腹瀉療 效 不 一[8-9,19-24],這 是 否 與 食 草 動 物 特 殊 而 發(fā) 達(dá)的多室胃導(dǎo)致噬菌體失活有關(guān),還有待進(jìn)一步驗證?經(jīng)直腸給藥療效與灌胃相近[22-23]?腹腔注射給藥治療小鼠大腸埃希菌感染療效好[3,6]?Huff等[13,15]研究發(fā)現(xiàn)霧化給藥能保護(hù)呼吸道感染大腸埃希菌的肉雞,不能保護(hù)全身感染的肉雞,而肌內(nèi)注射給藥治療效果好,肉雞全身感染大腸埃希菌后48h,噬菌體肌內(nèi)注射給藥也能挽救重度感染的肉雞?霧化吸入噬菌體比肌內(nèi)注射給藥治療全身感染效果差,可能與霧化吸入給藥,血液中不能達(dá)到噬菌體高滴度有關(guān)?霧化給予噬菌體1h后血液里能檢測到少量噬菌體(96PFU/mL),而肌內(nèi)注射給予噬菌體6h后血液里也可檢測到大量噬菌體(104PFU/mL)[3]?總的來說,對于全身性感染,全身給藥療效優(yōu)于局部給藥?

2.1.2 給藥劑量 大多實驗性感染中,噬菌體治療效果與噬菌 體 滴 度 相 關(guān) ,滴 度 高 治 療 效 果 好[15-16,24]?Huff等[12,15-16]研究發(fā)現(xiàn)小鼠感染大腸埃希菌后立即給予與細(xì)菌等量(6×104PFU)的噬菌體SPR02?DAF6,可以使病死率從85%降至35%,而給予108PFU噬菌體時小鼠死亡率為0?Oliveira等[24]研究發(fā)現(xiàn)給予107PFU噬菌體F78E時治療無效,而109PFU噬菌體F78E能使治療組肉雞發(fā)病率和病死率分別降低43%和25%;當(dāng)應(yīng)用噬菌體雞尾酒制劑(F78E?phi F258E?phi F61E)治療時,低劑量(107PFU)即可在3周內(nèi)控制感染,未發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)病例?但是Smith等[9]發(fā)現(xiàn)低劑量的噬菌體也有很好的療效:低劑量105PFU單次給藥能治愈大腸埃希菌導(dǎo)致的腹瀉;將102PFU噬菌體噴灑于牛圈中,或?qū)⑿∨０仓糜诮邮苓^噬菌體治療的小牛曾生活過的牛圈中,即對新生小牛具有保護(hù)作用?這可能與每株噬菌體的生物學(xué)特性不一?殺滅宿主菌的能力不同有關(guān),說明噬菌體治療沒有普遍適用的應(yīng)用條件,每種噬菌體用于治療感染性疾病前均需要尋找最佳的給藥方案?

2.1.3 給藥頻率 噬菌體治療大腸埃希菌感染連續(xù)給藥比單次給藥治療效果好?噬菌體單次給藥能使糞便中的噬菌體短暫下降,9d后噬菌體給藥組和未處理組荷菌量差別不大,連續(xù)每日給藥后,能快速減少小鼠胃腸道的荷菌量,糞便里能檢測到高滴度的噬菌體[19]?小鼠感染大腸埃希菌后,第0?1?2天連續(xù)肌內(nèi)注射噬菌體,可治愈所有感染的肉雞;單次肌內(nèi)注射能降低肉雞病死率,但不能治愈所有肉雞[17]?

2.1.4 給藥時間 各種噬菌體治療時間窗不同,大多數(shù)實驗表明感染大腸埃希菌后立即用噬菌體治療效果佳,能減少動物荷菌量,降低死亡率,延長生存期,甚至治愈,延遲治療會導(dǎo)致療效差,甚至治療失敗[17-18]?Wang等[3]發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌感染后延遲60min給予噬菌體治療,小鼠168min存活率降至60%;Bull等[5]發(fā)現(xiàn)延遲給藥會導(dǎo)致難治性感染;但是Barrow等[10]發(fā)現(xiàn)在延遲至雞出現(xiàn)臨床癥狀時再給予噬菌體治療仍能預(yù)防敗血癥和腦膜炎?在感染大腸埃希菌前預(yù)防性應(yīng)用噬菌體,可預(yù)防病原菌感染,保護(hù)時間窗各不相同,從1d至1周不等,可能與噬菌體本身的免疫原性有關(guān),易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的噬菌體預(yù)防時間窗短,而免疫原性低的噬菌體保護(hù)時間窗長[18,25]?

不同給藥途徑的治療時間窗也不同,肌內(nèi)注射的治療時間窗長于霧化吸入[10]?肉雞感染大腸埃希菌后立即噬菌體霧化給藥,可降低肉雞病死率,延遲至24?48h時給藥無治療作用,而延遲至48h肌內(nèi)注射給予噬菌體也能降低肉雞病死率?這可能與霧化給藥途徑噬菌體不能有效到達(dá)感染部位有關(guān)[13]?

2.2 噬菌體抗性 噬菌體與宿主之間存在著防御和反防御的相互作用,宿主菌已經(jīng)建立了擊退噬菌體在其生活周期中的幾乎所有階段對它發(fā)生毒性攻擊的方法,即產(chǎn)生了噬菌體抗性(bacteriophage resistance)[26]?Tanji等[19]發(fā)現(xiàn)噬菌體和大腸埃希菌共培養(yǎng)時能使培養(yǎng)基濁度降低,但繼續(xù)培養(yǎng),噬菌體抵抗的病原菌增多,導(dǎo)致濁度又增加?分離出的噬菌體抵抗細(xì)菌,對某一噬菌體抵抗的細(xì)菌對另一種噬菌體仍然敏感?噬菌體治療無效死亡的小牛小腸內(nèi)有大量的噬菌體抵抗的大腸埃希菌[8]?分離的噬菌體抵抗變異株多為k1陰性菌,毒性下降,且易恢復(fù)對噬菌體的敏 感性[4-5,8-9]?少數(shù)分離 的菌為 k陽 性菌,k1陰性菌和陽性菌在培養(yǎng)基中增殖速率相近,但k1陽性菌在小鼠血清中增殖速率較快,毒力無下降[5,9],多株大腸埃希菌混合感染的小牛體內(nèi)很快可以分離出新的噬菌體變異株,這株新噬菌體可以控制噬菌體抵抗株的感染[9]?

2.3 機(jī)體對噬菌體的清除 噬菌體可以在機(jī)體內(nèi)繁殖[10],但同時噬菌體具有免疫原性,進(jìn)入機(jī)體后會被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除,不同噬菌體在體內(nèi)存活時間不同?在用噬菌體治療大腸埃希菌感染前,動物暴露于噬菌體,會影響噬菌體治療效果,可能與機(jī)體產(chǎn)生中和抗體有關(guān)[18,25]?Huff等[18]發(fā)現(xiàn)感染大腸埃希菌后立即給予噬菌體治療,可降低肉雞病死率,病死率與未感染大腸埃希菌的對照組無差別,而先肌內(nèi)注射噬菌體7d后再用大腸埃希菌感染肉雞,肉雞病死率與未治療對照組無差別,該組肉雞血清能降低噬菌體活性,IgG含量比未用噬菌體處理的對照組高?

2.4 噬菌體雞尾酒制劑 噬菌體雞尾酒制劑治療大腸埃希菌感染療效較好[24-25]?Tanji等[19]研究發(fā)現(xiàn)3種噬菌體 SP15?SP21?SP22單獨(dú)應(yīng)用時能使培養(yǎng)基濁度降低,但繼續(xù)培養(yǎng),噬菌體抵抗的大腸埃希菌增多,導(dǎo)致濁度又增加;在有氧條件下,3種噬菌體聯(lián)用時培養(yǎng)基濁度降低后沒有再增加?但是某些單一噬菌體也能達(dá)到雞尾酒制劑的治療效果[23]?單一噬菌體治療效果與噬菌體滴度相關(guān),107PFU噬菌體F78E治療無效,109PFU噬菌體F78E能使治療組肉雞發(fā)病率和病死率分別降低43%和25%;大規(guī)模動物實驗發(fā)現(xiàn)低劑量(107PFU)雞尾酒制劑(F78E?phi F258E?phi F61E)可在3周內(nèi)控制大腸埃希菌感染,未發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)病例[24]?

2.5 噬菌體和抗生素聯(lián)用 噬菌體和抗生素治療效果比較,噬菌體優(yōu)于部分抗生素,兩者聯(lián)用效果較佳?噬菌體單次給藥治療大腸埃希菌感染比多次給藥的四環(huán)素?氨芐青霉素?氯霉素?復(fù)方新諾明療效好,與鏈霉素療效相近[4]?恩氟沙星使肉雞病死率從68%降至3%,而噬菌體治療組病死率為15%,兩者聯(lián)合應(yīng)用無肉雞死亡[14]?

3 噬菌體療法的不良反應(yīng)

目前發(fā)表的研究未發(fā)現(xiàn)噬菌體療法有明顯的不良反應(yīng)?Nishikawa等[6]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)接種噬菌體未產(chǎn)生對機(jī)體的不利反應(yīng)?Huff等[14]發(fā)現(xiàn)恩氟沙星治療組肉雞肺泡損傷較噬菌體組治療輕?

4 噬菌體療法前景展望

研發(fā)噬菌體防治細(xì)菌性感染比研發(fā)新的抗生素具有一些優(yōu)勢:(1)噬菌體特異性強(qiáng),通常僅針對宿主菌,不會干擾機(jī)體內(nèi)正常的菌群平衡;(2)噬菌體在細(xì)菌感染或污染的部位可以快速增殖,給藥劑量得到放大,增強(qiáng)療效;(3)噬菌體幾乎沒有毒性反應(yīng),機(jī)體內(nèi)本身就寄居著種類繁多的噬菌體,特別是在胃腸道區(qū)域;(4)噬菌體可以再侵染噬菌體抗性菌株,某一種噬菌體抗性菌株可以被其他具有類似抗菌范圍的噬菌體裂解,某些噬菌體還可以隨著抗性菌株的產(chǎn)生而變異,可以重新裂解變異菌株;(5)篩選新的噬菌體治療細(xì)菌感染,時間相對較短,通?？稍跀?shù)天或數(shù)周之內(nèi)完成,而且進(jìn)化論認(rèn)為通過自然選擇的不斷篩選,噬菌體能夠治療耐受抗生素和噬菌體的細(xì)菌感染?

噬菌體療法是個體化的治療,很難像抗生素抗感染一樣給出標(biāo)準(zhǔn)化的治療方案?本文綜述的22個研究中,使用了16株大腸埃希菌和49株噬菌體,這些大腸埃希菌致病力有差異,噬菌體的生物學(xué)特性和實驗條件也各不相同,這造成實驗彼此之間可比性差?有些實驗,給藥時間延遲數(shù)小時,噬菌體療法的療效就變差,但有些實驗給藥時間延遲數(shù)天,療效也沒有差別?某些噬菌體顯示出優(yōu)于其他噬菌體的特性,比如噬菌體SH1單獨(dú)應(yīng)用和雞尾酒療法(噬菌體SH1?KH1聯(lián)用)療效相當(dāng)[20];噬菌體phi1靜脈注入小鼠體內(nèi)后未檢測到中和抗體,2周內(nèi)均有抗菌活性[27];105PFU噬菌體單次給藥即能治愈大腸埃希菌導(dǎo)致的腹瀉[9]?研究者通過噬菌體療法的動物實驗可以弄清噬菌體在大腸埃希菌感染中的治療潛力,篩選出療效好?免疫原性低的噬菌體用于治療?Merril等[8]使噬菌體在小鼠體內(nèi)反復(fù)循環(huán),篩選出噬菌體變異株,不僅能在體內(nèi)長時間存活,而且對小鼠保護(hù)效力強(qiáng)于野生型噬菌體[28-29]?

研究者已經(jīng)應(yīng)用噬菌體治療人體的感染性疾病?2005年,Bruttin等開展口服噬菌體人體安全試驗,自愿者口服含有105PFU/mL大腸埃希菌噬菌體T4的水,所有受試志愿者未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)[30]?許多噬菌體制劑公司也開展了噬菌體療法人體試驗,用于治療耳炎?腿部潰瘍和燒傷等?2008年英國Biocontrol Ltd.公布了該公司主持進(jìn)行的一項應(yīng)用噬菌體治療耐藥銅綠假單胞菌中耳炎的雙盲?安慰劑對照Ⅱ期臨床試驗的研究結(jié)果,24例患者中,噬菌體治療組有50%的人癥狀改善,而對照組只有20%的人改善癥狀?同時,噬菌體治療組的患者治療3周后耳部荷菌量減少80%,而對照組荷菌量稍有增加[2]?2006年,美國FDA批準(zhǔn)了一項噬菌體雞尾酒制劑LMP-102TM用于防治即食肉制品的李斯特菌污染[2]?波蘭和前蘇聯(lián)地區(qū)應(yīng)用噬菌體療法的成功案例表明[2],在常規(guī)抗生素治療失敗后,應(yīng)用噬菌體療法治療感染性疾病是一個可行的治療手段?

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10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.030

A

1671-8348(2012)16-1641-04

* 基金項目:國家“十一五”科技重大專項基金資助項目(2008ZX10303)?△

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2011-11-08

2011-12-19)

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