HPLC法同時(shí)測(cè)定膽木及其制劑中酚酸和生物堿類成分

王靜靜，蔣俊，朱粉霞，李秀峰，賈曉斌*

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇南京210028;3.鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局，國(guó)家食品添加劑及調(diào)味劑檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212003;4.海南制藥廠有限公司黎藥工程中心，海南五指山572200)

膽木Nauclea officinalis為茜草科烏檀屬植物，是一味重要的黎族藥用植物，在我國(guó)海南一帶比較常用［1］。膽木注射液和膽木浸膏片均是由膽木單味藥材制得的中藥制劑，具有清熱解毒，消腫止痛之功效。臨床常用于治療上呼吸道感染、支氣管炎、急性扁桃體炎及咽喉炎等癥。

文獻(xiàn)報(bào)道［2-4］膽木中主要含有生物堿，五環(huán)三萜和有機(jī)酚酸等，認(rèn)為這類物質(zhì)是膽木發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究室通過(guò)對(duì)膽木注射液化學(xué)成分的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)膽木注射液中的有機(jī)小分子化合物主要由有機(jī)酚酸類和生物堿苷類組成，并采用液質(zhì)聯(lián)用的方式鑒定了短小舌根草苷和異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺兩個(gè)生物堿成分［5］。進(jìn)一步的研究表明膽木注射液中還含有原兒茶酸和3-表短小舌根草苷。液相色譜圖顯示上述4個(gè)成分的含有量均較高。這類化合物被證實(shí)具有一定的抗氧化、抗炎、抗微生物等活性［6-8］，很可能是膽木注射液發(fā)揮臨床療效的重要藥效成分。

本實(shí)驗(yàn)中，作者選擇了原兒茶酸、短小舌根草苷、3-表短小舌根草苷和異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺4個(gè)成分作為含有量測(cè)定的指標(biāo)，所建立的方法簡(jiǎn)單、可靠，可作為控制膽木藥材及其制劑質(zhì)量的一種方法。

1 儀器與試藥

Waters公司高效液相色譜儀(包括Waters在線脫氣機(jī)，600泵，717進(jìn)樣器，2996紫外檢測(cè)器)，Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，METTLER TOLEDO分析電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，十萬(wàn)分之一)。

乙腈(TEDIA公司，色譜純)，甲醇(南京化學(xué)試劑有限公司，分析純)，水為超純水;原兒茶酸(批號(hào)110809)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，短小舌根草苷，3-表短小舌根草苷，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制(純度均高于98%)。

膽木藥材(批號(hào):100303，110802)和膽木注射液(批號(hào):110601，110801，110901，101101)均由海南制藥廠有限公司提供，藥材產(chǎn)于海南省五指山，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳德康教授鑒定為藥烏檀(N.officinalis)的帶皮心材。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取原兒茶酸、短小舌根草苷、3-表短小舌根草苷，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺對(duì)照品5.0 mg置同一10 mL量瓶中，加入70%甲醇溶解至刻度，制得混合對(duì)照品貯備液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 膽木供試品溶液的制備取膽木心材(帶皮)適量，打成粗粉，精密稱取膽木藥材粗粉10 g，加入200 mL超純水，回流提取2 h，趁熱過(guò)濾，濾液冷卻至室溫，用超純水定容至200 mL，混勻，靜置，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.2.2 膽木注射液供試品溶液的制備取膽木注射液0.5 mL于10 mL量瓶中，以超純水定容，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件X-SELECT CSHTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，0～10 min，6%～16%A，10～15 min，16%A，15～40 min，16%～41%A;檢測(cè)波長(zhǎng):258 nm(原兒茶酸)，243 nm(短小舌根草苷和3-表短小舌根草苷)和226 nm(異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺);體積流量1 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL?；旌蠈?duì)照品，膽木藥材及膽木注射液樣品HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系精密吸取2.1項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，采用逐步稀釋法分別制得原兒茶酸的質(zhì)量濃度為0.966 0、19.32、38.64、77.28、154.56 μg/mL，短小舌根草苷的質(zhì)量濃度為0.944 0、18.88、37.76、75.52、151.04 μg/mL，3-表短小舌根草苷的質(zhì)量濃度為0.954 0、19.08、38.16、76.32、152.64 μg/mL，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺的質(zhì)量濃度為0.916 0、18.32、36.64、73.28、146.56 μg/mL的對(duì)照品溶液。按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以峰面積積分值(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，見(jiàn)表1;將混合對(duì)照品不斷稀釋后分析，得到4個(gè)成分的最低檢測(cè)限(LOD:S/N≈3～4)和最低定量限(LOQ:S/N≈10～12)，見(jiàn)表1。

2.5 精密度試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各對(duì)照品峰面積，原兒茶酸，短小舌根草苷，3-表短小舌根草苷和異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺4種成分峰面積積分值的RSD分別為1.64%、0.42%、0.38%、0.80%，表明精密度良好。

圖1 對(duì)照品(A1～3)，膽木藥材(B1～3)和膽木注射液(C1～3)258、243和226nm下的HPLC圖Fig.1 Chromatogram s obtained by HPLC analysis of reference substances(A1-3)，N.officinalis(B1-3)and Danmu Injection(C1-3)at 258，243 and 226 nm

表1 4個(gè)待測(cè)成分的回歸方程、線性范圍、LOD、LOQ及相關(guān)系數(shù)Tab.1 Summary of calibration curves，linear ranges，LODs，LOQs and correlation coefficients for four compounds

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(100303)膽木藥材，按2.2.1項(xiàng)下操作方法制備膽木供試品溶液6份;取同一批號(hào)(101101)膽木注射液，按2.2.2項(xiàng)下操作方法制備供試品溶液6份。按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算膽木藥材和膽木注射液中4種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.74%，1.54%，1.30%，2.17%;1.53%，1.04%，2.32%，1.26%。表明本法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取2.2項(xiàng)下處理好的同一份膽木供試品溶液和膽木注射液供試品溶液，室溫放置，分別在0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積分別計(jì)算膽木藥材和膽木注射液中4種成分的RSD為1.12%，0.87%，1.02%，1.26%;1.50%，1.85%，1.18%，2.86%。表明穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.8.1 膽木藥材加樣回收實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)膽木藥材粗粉6份，分別精密加入一定量(與樣品中含有量相當(dāng))的對(duì)照品。按2.2.1項(xiàng)下操作方法制備，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算回收率。4種成分的平均回收率分別為98.2%，101.3%，97.4%，99.2%;RSD分別為2.22%，2.06%，1.79%，3.62%。結(jié)果見(jiàn)表2，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.8.2 膽木注射液加樣回收實(shí)驗(yàn)精密移取已知含有量的膽木注射液0.5 mL(批號(hào):101101)，分別精密加入一定量(與注射液中含量相當(dāng)?shù)?對(duì)照品，稀釋至10 mL，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算回收率。4種成分的回收率分別為99.7%，103.0%，98.9%，100.7%;RSD分別為2.44%，1.09%，1.46%，2.16%。結(jié)果見(jiàn)表3，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 膽木藥材加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recoveries of four compounds in N.officinalis

表3 膽木注射液加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Recoveries of 4 compounds in Danmu injection

2.9 樣品測(cè)定分別取2個(gè)不同批號(hào)的膽木藥材及4個(gè)不同批號(hào)的膽木注射液按2.2項(xiàng)下方法操作，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，將測(cè)定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得含量結(jié)果，見(jiàn)表4。

表4 膽木藥材及其注射液中4種指標(biāo)成分的量Tab.4 Contents of four compounds in N.officinalis and Danmu Injection

3 討論

研究表明，膽木及其制劑中含有的生物堿為吲哚類生物堿和喹啉酮類生物堿，這兩類生物堿結(jié)構(gòu)中由于有p-π共軛效應(yīng)的存在，往往堿性減弱，甚至呈現(xiàn)出中性或弱酸性，所以一方面采用常規(guī)的酸提堿沉法提取生物堿并不能達(dá)到理想的效果;另一方面，只有選擇酸性流動(dòng)相才能使色譜峰減少拖尾，增加峰形的對(duì)稱性，較好地分離。本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.05%乙酸、乙腈-0.05%磷酸3種不同流動(dòng)相體系的色譜行為，發(fā)現(xiàn)甲酸和磷酸的分離效果最好，經(jīng)綜合考慮本課題組選擇了甲酸作為流動(dòng)相的添加劑。

膽木注射液為膽木的水煎煮提取液經(jīng)一系列工藝精制得到的膽木提取物溶液，按照一定處方配比精制而得。本實(shí)驗(yàn)選擇了水煎煮的提取方式，通過(guò)比較膽木藥材水煎煮提取液及膽木注射液中4種成分之間含有量的比例，可以發(fā)現(xiàn)，工藝過(guò)程中異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺所占比例明顯減少;在一定程度上反映了4種成分與膽木注射液工藝的相關(guān)性，為膽木注射液質(zhì)量再評(píng)價(jià)提供一定的參考。另外，由結(jié)果可知，膽木藥材中原兒茶酸，3-表短小舌根草苷的含有量較低，在批號(hào)110802的藥材中測(cè)得極少，但在注射液中含量有所升高，異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺和短小舌根草苷是膽木及其注射液中的主要成分，是膽木注射液的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前對(duì)膽木藥材及其制劑的質(zhì)量控制研究較少，文獻(xiàn)報(bào)道［7-11］多以單一成分異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺作為指標(biāo)進(jìn)行含有量測(cè)定。此外，張亞平［12］研究了以蘆丁為對(duì)照，采用紫外分光光度法測(cè)定膽木注射液中總黃酮的質(zhì)控方法;而具有一定抗炎作用的酚酸類成分及其它種類生物堿的含有量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道，本課題組不久前報(bào)道了采用LC/MS鑒定膽木注射液中的短小舌根草苷和異長(zhǎng)春花苷內(nèi)酰胺，在后續(xù)的研究中本課題組從膽木注射液中還分離并鑒定出了原兒茶酸和短小舌根草苷的同分異構(gòu)體3-表短小舌根草苷。本實(shí)驗(yàn)可為全面控制膽木注射液質(zhì)量提供新的分析手段，并為進(jìn)一步研究膽木注射液的藥理藥效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為膽木注射液的再評(píng)價(jià)研究提供參考。

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