端粒、端粒酶、shelterin與獲得性再生障礙性貧血的研究概況①

王 琰 徐瑞榮 (山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血液病科，濟(jì)南250011)

再生障礙性貧血(Aplastic anemia，AA，簡稱再障)是由多種原因引起的造血干細(xì)胞數(shù)量下降和功能異常，導(dǎo)致全血細(xì)胞減少的一種綜合病癥，是骨髓衰竭綜合征的一種。AA可以分為獲得性和遺傳性的，獲得性AA又分為原發(fā)性AA和繼發(fā)性AA兩類。近年來，端粒和端粒酶成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，在獲得性AA中發(fā)現(xiàn)，部分患者與同年齡組的正常人相比端?？s短。對(duì)骨髓衰竭綜合征包括獲得性AA患者來說，具有潛在的白血病轉(zhuǎn)化傾向和高的實(shí)體瘤發(fā)生率，提示端粒和端粒酶的異常對(duì)再障的發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)化都有一定的影響，現(xiàn)就再障與端粒、端粒酶及保護(hù)端粒的蛋白復(fù)合體Shelterin的相關(guān)研究作一綜述。

1 端粒與再障

1.1端粒 端粒是真核細(xì)胞內(nèi)線性染色體末端的一種特殊“帽狀”結(jié)構(gòu)，由端粒DNA和端粒蛋白組成。其生物學(xué)功能是防止染色體末端的降解、丟失及端-端不規(guī)則融合，對(duì)維持染色體的完整性和穩(wěn)定性有重要作用。人類在出生的時(shí)候端粒約有10～15 kb，隨著細(xì)胞的分裂次數(shù)增加，端粒的長度不斷地縮短，在人有核血細(xì)胞，平均端粒長度隨年齡增大而顯著減小，特別是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。當(dāng)端?？s短達(dá)到一個(gè)臨界長度(2～4 kb)時(shí)，就會(huì)認(rèn)為是雙鏈斷裂DNA損害，喪失保護(hù)染色體末端的功能，導(dǎo)致不可逆地退出細(xì)胞周期，從而走向衰亡［1］。

1.2端粒長度與再障的發(fā)病 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，大約1/3的獲得性再障患者有白細(xì)胞端粒縮短，用流式-熒光原位雜交方法、Southern blot方法、定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法等檢測都得出了相似的結(jié)果［2-4］，再障患者粒細(xì)胞端粒長度較同年齡段正常組明顯縮短，外周血單個(gè)核細(xì)胞的端粒長度平均比年齡匹配的正常對(duì)照組短1.41 kb(P＜0.001)。端粒的縮短與外周血中性粒細(xì)胞減少的程度和治療后血象的提升有正相關(guān)，與疾病發(fā)現(xiàn)的早晚并無相關(guān)性，提示再障在發(fā)病時(shí)就失去了部分端粒長度，再障端粒的縮短可能反映了造血干細(xì)胞造血功能的缺陷。

端粒侵蝕也可能為我們提供有關(guān)疾病階段的信息。在持續(xù)性血細(xì)胞減少的獲得性再障患者，端粒損失和病程之間存在顯著相關(guān)(P＜0.0001)［5］，除了正常的年齡有關(guān)的損失，相當(dāng)于端粒逐漸侵蝕216 bp/年。研究發(fā)現(xiàn)，中間型再障患者有顯著的端?？s短(P=0.01)，對(duì)這組的病程分析顯示，這組患者有很長的血細(xì)胞減少史［2］。重型再障和外周血單核細(xì)胞的個(gè)人年度端?？s短的速率(IATSR)顯著相關(guān)(P＜0.001)，自發(fā)性細(xì)胞凋亡在重型再障患者或高的IATSR患者中最高(大于200 bp/年)(P＜0.01，n=18)［6］。

1.3端粒長度與再障的演變及治療 對(duì)獲得性再障患者來說，白細(xì)胞端粒長度是惡性克隆發(fā)展的重要預(yù)測指標(biāo)，且與再障的復(fù)發(fā)及死亡率有關(guān)，并與血液復(fù)發(fā)概率成反比。端粒越短，發(fā)生克隆演變的可能性就越高［4］。成人端粒較短的再障患者轉(zhuǎn)化為骨髓增生異常和白血病的可能性最高［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，在5例端粒長度小于5 kb的再障患者中，2例進(jìn)展期的獲得性再障患者有細(xì)胞遺傳學(xué)異常，反映了骨髓已經(jīng)出現(xiàn)深度發(fā)育不良，提示端粒侵蝕可能與再障演變?yōu)楣撬柙錾惓＞C合征的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［5］。

同時(shí)，在研究中也發(fā)現(xiàn)，基于再障發(fā)病的免疫基礎(chǔ)，高達(dá)75%的再障患者對(duì)免疫抑制治療(IST)有反應(yīng)［8］。那些對(duì)免疫抑制治療反應(yīng)良好和服用免疫抑制劑恢復(fù)的患者，端粒平均長度與同年齡段的正常對(duì)照組并無明顯差異，而一些對(duì)免疫抑制劑反應(yīng)差或未進(jìn)行治療的三系嚴(yán)重減少的患者端粒長度明顯縮短，并與正常組差異明顯。而對(duì)于接受免疫抑制治療的重型再障患者來說，端粒長度與治療效果無關(guān)，但與復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，克隆演化，整體存活率有關(guān)［4］。這提示我們?cè)谂R床治療再障過程中，通過檢測端粒的長度，可以更好地有針對(duì)性地治療再障，并對(duì)再障的預(yù)后有初步的評(píng)斷。

2 端粒酶與再障

2.1端粒酶 端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白。是一個(gè)特殊的反轉(zhuǎn)錄酶，活化后以自身RNA為模板，端粒3＇末端富G單鏈為引物合成端粒中重復(fù)DNA序列加到端粒末端而維持端粒長度，以防止端粒隨細(xì)胞分裂而不斷損耗，從而保護(hù)染色體。哺乳動(dòng)物的端粒酶復(fù)合物主要有反轉(zhuǎn)錄酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)和 RNA 模板(Telomerase RNA component，TERC)組成。此外，另外四個(gè)蛋白 GAR1、NHP2、NOP10和 dyskerin組成核仁核糖蛋白復(fù)合物結(jié)合端粒酶，這些蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致端粒酶失活。

除在生殖細(xì)胞、成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和活化的免疫細(xì)胞外，端粒酶在正常體細(xì)胞中無活性或檢測不出其活性。當(dāng)端粒長度足夠長時(shí)，端粒酶活性對(duì)細(xì)胞分裂不是必需的，只有當(dāng)端粒的長度縮短到特定范圍時(shí)，端粒酶活性的有無才成為關(guān)鍵因素。端粒酶活性主要由TERT表達(dá)水平的高低決定。TERT的突變會(huì)導(dǎo)致端粒酶活性的改變。

2.2端粒酶基因突變與再障的發(fā)病機(jī)制 在獲得性再障患者中發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的端粒酶基因的遺傳突變對(duì)再障的臨床管理有重要意義。端粒酶基因的突變可導(dǎo)致再障患者端粒酶活性降低，端?？s短加速，減少造血祖細(xì)胞增殖能力。在1/3有端?？s短的獲得性再障患者中有一部分伴有端粒酶的突變(TERC基因或 TERT基因)，約占所有獲得性再障患者的4% ～10%，但沒有發(fā)現(xiàn) DKC1、NOP10和 NHP2的突變，雖然在這些基因分析中發(fā)現(xiàn)非同義單核苷酸多態(tài)性，但與對(duì)照組有類似的總體等位基因頻率［9-11］。

研究發(fā)現(xiàn)，遺傳性TERC突變導(dǎo)致的端粒酶活性和端粒維持損失，可能會(huì)限制骨髓干細(xì)胞再生［12］。在再障患者中，有一些TERC突變與端粒維持通路的遺傳病變有關(guān)，有一些突變能破壞TERC的二級(jí)結(jié)構(gòu)或折疊［13］。經(jīng)過一項(xiàng)正常和突變TERC分子的端粒酶重組實(shí)驗(yàn)表明，TERC的突變是由于單倍劑量不足引起的。在無負(fù)性干擾的情況下，TERC的變異使端粒酶活性降低或取消，導(dǎo)致端粒合成功能的喪失［14］。在中國北方再障患者的血液樣本中也檢測出了 TERC突變，發(fā)生率與西方相似［15］。

有報(bào)道，TERT基因的突變是通過單倍劑量不足機(jī)制破壞了端粒酶活性，從而造成了白細(xì)胞端粒縮短和造血干細(xì)胞室的增殖能力有限［9，10］。有TERT突變的患者外周血白細(xì)胞端粒明顯縮短，且發(fā)現(xiàn)有突變患者的親屬也具有造血障礙，其CD34細(xì)胞數(shù)的減少、造血集落形成減少、造血生長因子水平增加以及短端粒［16］，揭示了基因突變的家族傾向。體外培養(yǎng)突變的患者及親屬的外周血白細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)細(xì)胞的端粒酶活性較正常對(duì)照組減少了約50%，說明TERT突變相關(guān)再障降低端粒酶活性的機(jī)制是單倍劑量不足：即其余的正常等位基因不足以生產(chǎn)足夠數(shù)量的酶。另有不同的研究發(fā)現(xiàn)，在慢性再障患者中骨髓單個(gè)核細(xì)胞的端粒酶活性是增高的。Shen等［17］在22例兒童再障患者中測定了骨髓單個(gè)核細(xì)胞的端粒酶活性，高于正常對(duì)照組的兩倍，分析端粒酶活性增加與再障患者潛在的造血負(fù)反饋有關(guān)。兩種不同的研究結(jié)果說明關(guān)于端粒酶的活性在獲得性再障的研究中還存在爭議，有待于大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

TERT和TERC的突變可以被視為人類基因造血衰竭的危險(xiǎn)因素。端粒長度維持缺陷導(dǎo)致造血干細(xì)胞室減少，可能會(huì)特別容易受到環(huán)境傷害。

2.3端粒酶基因突變與再障的治療選擇 對(duì)獲得性再障患者來說，抗胸腺細(xì)胞球蛋白加環(huán)孢素的免疫抑制劑和造血干細(xì)胞移植是主要治療方法。Yamaguchi等［9］在再障患者的臨床治療中發(fā)現(xiàn)，200例獲得性再障患者中7例有TERT突變的患者，沒有一例對(duì)免疫抑制治療有反應(yīng)，表明一個(gè)或多個(gè)特定基因的突變可能會(huì)影響治療的選擇——選擇具體的藥物治療方案或決定接受干細(xì)胞移植。對(duì)于要接受干細(xì)胞移植的患者，合適的供者選擇很重要，再障患者基因突變的檢測為端粒酶缺陷的病人移植選擇合適的造血干細(xì)胞家屬捐贈(zèng)者提供了依據(jù)［18］?；谶@個(gè)原因，測量血液中白細(xì)胞端粒長度和進(jìn)行端粒酶基因突變的檢測在獲得性再生障礙性貧血的管理中很重要。

此外，端粒酶活性的調(diào)節(jié)可能在有端粒缺陷的綜合征的治療中發(fā)揮作用，如端粒酶突變的獲得性再障。端粒酶活性可被性激素調(diào)控。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，雄激素治療可誘導(dǎo)改善外周血計(jì)數(shù)，60%的患者能夠達(dá)到不依賴輸血［19］。機(jī)制可能是雄激素能刺激造血細(xì)胞中端粒酶基因表達(dá)，包括CD34+細(xì)胞和淋巴細(xì)胞［20］。此類研究對(duì)于當(dāng)前雄激素化合物的選擇和臨床使用的未來發(fā)展有潛在影響［21］。但需要注意的是，雄激素治療可能引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，如肝癌、肝紫斑病等，必須監(jiān)測肝功能。

3 Shelterin與再障

3.1Shelterin 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中端粒的結(jié)合蛋白是由六個(gè)蛋白組成的端粒特異性蛋白復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體被稱之為Shelterin，包括端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白 1(Telomere repeat binding factor1，TRF1)、端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白2(Telomere repeat binding factor1，TRF2)、Rap 1(Repressor activator protein 1)、TIN 2(TRF1-interacting nuclear protein 2)、TPP1(以往被分別稱為TINT1或PTOP或PIP1)和端粒保護(hù)蛋白1(protection of telomeres 1，POT1)六個(gè)蛋白。這些Shelterin組分特異性地結(jié)合在端粒上，并且在細(xì)胞周期的各個(gè)階段都有表達(dá)。TRF1和TRF2與端粒雙鏈DNA直接結(jié)合，Rap1通過和TRF2相互作用而結(jié)合在端粒上;TIN2則在很大程度上發(fā)揮了一種橋連作用，同時(shí)和TRF1、TRF2以及TPP1相互作用;POT1直接與端粒的單鏈DNA結(jié)合;TPP1同時(shí)與TIN2以及POT1相互作用連接起Shelterin在單鏈DNA和雙鏈DNA結(jié)合的蛋白復(fù)合物，從而形成一個(gè)龐大的六元復(fù)合體結(jié)合端粒末端。

Shelterin的兩個(gè)主要功能是端粒酶的募集，調(diào)節(jié)和保護(hù)染色體末端。染色體末端缺乏端粒保護(hù)將激活DNA損傷反應(yīng)，而Shelterin的存在使得細(xì)胞得以區(qū)分端粒末端和普通的DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)，從而抑制DNA損傷修復(fù)蛋白，避免染色體末端異常融合，同時(shí)調(diào)控端粒的端粒酶延伸途徑。因此，Shelterin的穩(wěn)定對(duì)于端粒的維持有著至關(guān)重要的作用。隨著端粒序列的延伸，結(jié)合在端粒末端的Shelterin會(huì)越來越多，因此也存在counting機(jī)制來維持端粒的長度。研究顯示，Shelterin的組分出了具有特定的功能外，對(duì)于端粒的長度都有負(fù)調(diào)控作用。

3.2Shelterin與再障的發(fā)病及治療 1/3的再障患者有短端粒，但突變只有不到10%，對(duì)這一現(xiàn)象最有趣的解釋是因?yàn)橛衅渌虻膮⑴c，包括大型復(fù)雜修復(fù)的其他成員、Shelterin、仍然模糊的替代修復(fù)系統(tǒng)的組成部分和一些DNA解旋酶［22］。

研究發(fā)現(xiàn)，Shelterin組件(TERF1和TERF2)特定的基因單體型編碼，可能有助于疾病發(fā)病，TRF1和TRF2是直接綁定到端粒DNA鏈，在調(diào)節(jié)端粒長度的同時(shí)保護(hù)端粒不被損壞，突變減少了它們的表達(dá)或者減少了它們綁定到DNA的數(shù)量導(dǎo)致了端粒侵蝕。也可能因?yàn)橥蛔儗?dǎo)致造血干細(xì)胞室的數(shù)量減少，使其可能在數(shù)量上不足以維持免疫介導(dǎo)的損傷。Savage等［23］通過對(duì)獲得性再障患者和健康對(duì)照的TERF1和TERF2基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)對(duì)比分析認(rèn)為，TERF1的遺傳變異可能與AA風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，但仍需要更多的研究證實(shí);TERF2的變異與再生障礙性貧血沒有顯著相關(guān)。

有報(bào)道在1～5%的獲得性再障患者中檢測出了TINF2的雜合子突變，但TINF2的突變?cè)诜窍忍煨越腔涣蓟颊咧胁黄鹬饕饔茫?4］。Yamaguchi等［25］在排除了攜帶端粒酶基因突變基因TERC or TERT的2例(1.4%)日本獲得性重型再障患者中發(fā)現(xiàn)有TINF2雜合突變，且與正常相配年齡的健康人比較，有更短的端粒長度。對(duì)免疫抑制治療無反應(yīng)。用美替諾龍治療，沒有顯示出任何良好的臨床反應(yīng)，這與用雄激素治療TERT突變的骨髓衰竭綜合征有良好的血液學(xué)反應(yīng)不同。

4 展望

近幾年來，再障與端粒、端粒酶及其相關(guān)蛋白之間的關(guān)系研究日益受到血液學(xué)研究者的重視。目前的研究基本都集中在測定外周血及骨髓端粒長度、端粒酶活性及端粒相關(guān)蛋白基因突變等方面，研究者們?cè)噲D從中找出規(guī)律，為再障患者的發(fā)病、疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)化提供有益的指導(dǎo)，尤其是對(duì)臨床應(yīng)用價(jià)值更大的端粒酶突變的研究，如果發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)突變，可作為免疫抑制劑治療無效的一個(gè)指標(biāo)，為臨床針對(duì)性更強(qiáng)用藥提供依據(jù)。另外，對(duì)出現(xiàn)端粒酶突變的患者來說，如果選擇造血干細(xì)胞移植治療，其同胞供者的端粒酶突變檢測也很重要，不排除患者的同胞健康供者之一亦會(huì)有端粒酶突變。這種情況下，則強(qiáng)烈提示我們此再障患者的發(fā)病有家族、遺傳、先天性因素參與。此時(shí)，應(yīng)高度懷疑先天性骨髓造血衰竭，并做相應(yīng)的檢查及鑒別診斷，此種情況下，同胞供者的骨髓移植并非最佳首選，應(yīng)考慮無關(guān)供者的骨髓移植。端粒及端粒酶的深入研究將為再障患者尋找最適治療方案提供幫助，以期達(dá)到提高再障患者的生存率及治愈率的目的。

端粒、端粒酶、Shelterin之間相互作用，是密切相關(guān)的。目前的研究結(jié)果揭示了一部分獲得性再障患者存在外周血白細(xì)胞端粒縮短、端粒酶基因和部分端粒保護(hù)蛋白突變、外周血端粒酶活性降低而骨髓端粒酶活性升高的現(xiàn)象，這部分患者可能有遺傳背景，在治療的選擇上也更為慎重。但對(duì)再障患者端粒相關(guān)的基因蛋白的表達(dá)水平及相互作用關(guān)系，及可能參與的疾病發(fā)生發(fā)展信號(hào)通路等少有具體研究和報(bào)道。鑒于目前Shelterin研究的內(nèi)容尚不全面，已知的六種蛋白它們之間的相互作用及其相互關(guān)聯(lián)與再障發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前尚不清楚，這將是今后需要研究的重點(diǎn)。目前，關(guān)于再障患者遺傳方面的研究包括染色體核型改變、基因突變等都有一定進(jìn)展，但是關(guān)于染色體末端的構(gòu)成部分——端粒、端粒酶以及端粒保護(hù)蛋白的研究遠(yuǎn)不完善，這為今后的研究提供了很大的空間。進(jìn)一步研究它們及其之間的關(guān)系有望為獲得性再障患者的臨床管理提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

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