檢測可溶性TREM-1的 ELISA法的建立及初步應(yīng)用①

盧 燕 何綺霞 蔡樹云 姚業(yè)興 徐軍發(fā) 張良清 (廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，湛江524001)

髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)是在髓樣細(xì)胞上表達(dá)的免疫球蛋白家族成員［1］，是一種在炎癥反應(yīng)的觸發(fā)及放大過程中具有重要作用的蛋白，選擇表達(dá)于髓樣細(xì)胞(如單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)表面，可放大促炎性細(xì)胞因子的釋放。TREM受體家族現(xiàn)已確認(rèn)的成員有6個(gè)，其中TREM-1是該受體家族最具特征性的一員。TREM-1的基因位于人類6號(hào)染色體(6p 21.1)與 MHC區(qū)域相鄰［2］，其相對分子質(zhì)量約為26×103，含234個(gè)氨基酸，氨基酸序列開始于一個(gè)疏水性的信號(hào)縮氨酸，胞外區(qū)由一個(gè)單獨(dú)的免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，約194個(gè)氨基酸，跨膜區(qū)包括一個(gè)帶正電的賴氨酸殘基，有29個(gè)氨基酸，胞質(zhì)區(qū)僅由幾個(gè)氨基酸組成。TREM-1結(jié)合糖基后分子量為30 kD，未結(jié)合糖基為26 kD，感染早期還可以可溶性形式sTREM-1釋放進(jìn)入體液，而且sTREM-1與感染嚴(yán)重程度有較好的相關(guān)性，提示sTREM-1是一種早期診斷感染的新指標(biāo)，為了進(jìn)一步研究TREM-1在急性肺部感染發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究建立了一種檢測 sTREM-1的 ELISA方法。

1 材料與方法

1.1材料 酶聯(lián)微量反應(yīng)板，來源于cloning公司。鼠抗人TREM-1單克隆抗體(mAb)，購自Invitrogen公司;純化的人TREM-1蛋白和兔抗人TREM-1多克隆抗體由本室自制。HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，TMB底物及顯色劑，沈陽惠民公司產(chǎn)品。BIOTEK Elx800型酶標(biāo)儀等。

1.2方法

1.2.1酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇 采用夾心ELISA法，用PBS將兔抗人TREM-1多抗稀釋為100 μg/L，每孔 100 μl包被于酶標(biāo)板，4℃過夜，加洗滌液洗板5次，加入封閉液37℃孵育2小時(shí)，再洗板5次，將羊抗兔酶標(biāo)抗體進(jìn)行一系列稀釋(1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000)，37℃孵育 1 小時(shí)，洗板5次，加底物顯色，選取A450值為1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體濃度為工作濃度。

1.2.2抗原抗體工作濃度的選擇 采用棋盤方陣滴定法確定單抗最佳包被稀釋度和多抗的最適工作濃度，具體方法如下：以pH9.6的碳酸鹽緩沖液(包被液)將鼠抗人TREM-1單克隆抗體(1 mg/ml)分別稀釋為 1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000，分別在 ELISA板上進(jìn)行包被，每一濃度包被9個(gè)孔，4℃過夜。次日洗滌后封閉液封閉2小時(shí)，再洗滌，在三個(gè)縱行各包被孔中加入強(qiáng)陽性抗原液(50 μg/ml TREM-1蛋白)，另三縱行加入弱陽性抗原液(5 μg/ml TREM-1蛋白)，剩余三縱行加入PBS作為陰性對照，37℃溫育1小時(shí)。洗滌后加入兔抗人TREM-1多抗，稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000，分別加入每一抗原濃度9個(gè)孔，37℃溫育1小時(shí)，洗滌，每孔加入本節(jié)1.2.1中確定的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG工作濃度，37℃溫育1小時(shí)，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后測A450值，選擇強(qiáng)陽性抗原液的A值在1.0左右，陰性參考的A值小于0.1的條件作為最佳單抗包被和多抗最適工作濃度。

1.2.3封閉液和封閉時(shí)間的選擇 用最佳的鼠抗人TREM-1單抗包被稀釋度和包被條件包被酶標(biāo)板，4℃包被過夜，洗滌后分成 3組。第1組：用10%FCS封閉;第2組：用1%BSA封閉;第3組：用5%BSA 封閉;200 μl/孔，37℃ 孵育 2小時(shí)。按照ELISA基本步驟檢測陰、陽性樣品，取OD值接近1.0且P/N值最大的一組為確定的最佳封閉液。

用單抗最佳的包被稀釋度和包被條件包被酶標(biāo)板，4℃包被過夜，洗滌后加入選定的封閉液，200 μl/孔，分成4組，第1組：37℃封閉4小時(shí);第2組：37℃封閉2小時(shí);第3組：4℃過夜;第4組：37℃封閉2小時(shí)后過夜。按照ELISA基本步驟檢測陰、陽性樣品OD值，取OD值接近1.0且P/N值最大的一組為確定最佳封閉時(shí)間。

1.2.4測定范圍的選擇 按以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)最佳條件，將重組人 TREM-1蛋白(200 mg/ml)做1∶500稀釋后再進(jìn)一步做二倍稀釋，如 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000，直到 1∶256 000 進(jìn)行測定，以抗原濃度為橫坐標(biāo)，A450為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢測范圍及最小檢出濃度。

1.2.5重復(fù)性檢測 (1)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：在同一批內(nèi)對50 μg/L純化重組人TREM-1蛋白進(jìn)行20次平行檢測，測其A450，計(jì)算CV值。(2)批間重復(fù)試驗(yàn)：分5次檢測50 μg/L純化重組人TREM-1蛋白，每次設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔，測其A450，計(jì)算CV值。

1.2.6TREM-1含量的檢測 按實(shí)驗(yàn)1.2.3最佳優(yōu)化條件，按夾心ELISA法基本步驟測定30例急性肺部感染患者和30例健康體檢正常人的A450值，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)1.2.5測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出它們的各自值，采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用 SPSS16.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1雙抗體夾心ELISA檢測方法最佳反應(yīng)條件的確定

2.1.1酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定 選取A450值接近1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體濃度為工作濃度，從(表1)可以看到二抗比例為1∶5 000時(shí)吸光度值為0.991，最接近1.0，因此確定酶標(biāo)抗體最佳工作濃度為1∶5 000。

表1 不同濃度酶標(biāo)二抗A450值Tab.1 The absorbance about different percentage of enzyme label antibody

2.1.2鼠抗人TREM-1包被單抗和兔抗人TREM-1多抗最適工作濃度的確定 根據(jù)棋盤法測定的結(jié)果(表2)，取OD值接近于1.0，P/N值最大的工作濃度為最佳濃度，由表中可以看到包被單抗?jié)舛葹?∶3 000和多抗?jié)舛葹?1∶2 000時(shí)，其 A450值為0.993，接近1.0，陰性對照A450值低于0.1。因此，確定包被的鼠抗人TREM-1包被單抗工作濃度為1∶3 000，兔抗人 TREM-1多抗最適工作濃度為1∶2 000。

表2 棋盤法比色結(jié)果Tab.2 Result of checherboard method

圖1 不同封閉液檢測結(jié)果Fig.1 The result of different block buffer

圖2 不同封閉時(shí)間檢測結(jié)果Fig.2 The result of different block time

2.1.3封閉液及封閉時(shí)間的選擇 從不同封閉液檢測結(jié)果(圖1)可見10%FCS的封閉效果OD值最接近1.0，P/N值最大，所以采用10%FCS作為本實(shí)驗(yàn)的封閉液。不同封閉時(shí)間結(jié)果(圖2)顯示37℃ 2小時(shí)和4℃過夜方法相比無明顯區(qū)別，為節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間采用37℃ 2小時(shí)。

圖3 雙抗體夾心ELISA法檢測TREM-1工作曲線Fig.3 Standard curve of TREM-1 by sandwich ELISA

圖4 急性肺部感染組與對照組TREM-1濃度柱狀圖Fig.4 The concentration of TREM-1 between patient with acute lung infection and the control group

2.2測定范圍的確定 結(jié)果顯示0.78～200 μg/L范圍線性較好，以這段結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，回歸方程為y=0.006 4x+0.184 8，R2=0.993 3。當(dāng)抗原稀釋到1∶128 000時(shí)已經(jīng)檢測不出，因此此方法最低檢出限為0.78 μg/L。

2.3重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)分別為6.52%和9.46%，說明該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性都較好。

2.4TREM-1檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)TREM-1標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程代入各樣本OD值，計(jì)算出它們各自濃度，采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用±s表示;急性肺部感染組：(1.16±0.42)μg/L;對照組為：(0.69±0.18)μg/L，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，圖4)。

3 討論

TREM-1是2000年Bouchon首先發(fā)現(xiàn)的一種新的免疫球蛋白超家族受體，選擇性表達(dá)于血液中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面，能觸發(fā)及擴(kuò)大細(xì)菌感染后細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)并進(jìn)一步影響膿毒性休克的病理過程，因此被認(rèn)為可能在炎性反應(yīng)的觸發(fā)及放大過程中具有重要作用［3］。TREM-1可溶性形式sTREM-1是TREM-1的mRNA剪接突變體編碼的一種缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的分泌亞型［4］，研究發(fā)現(xiàn)肺部感染過程中sTREM-1可以釋放入體液且與感染嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可用于評價(jià)療效和評估預(yù)后［5］。Tejera等［6］對226例社區(qū)獲得性肺炎(Community acquired pneumonia，CAP)患者血清 sTREM-1水平檢測發(fā)現(xiàn)，sTREM-1水平是CAP獨(dú)立診斷和預(yù)測指標(biāo)，與患者死亡率密切相關(guān)，而且其預(yù)測價(jià)值獨(dú)立于此前已經(jīng)確認(rèn)的CAP預(yù)測指標(biāo)，提示sTREM-1是急性肺炎患者特殊的預(yù)測標(biāo)志物。我們前期研究制備了純化的人TREM-1蛋白和兔抗人TREM-1多克隆抗體［7］。因此建立一個(gè)快速簡便的檢測方法可為TREM-1的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究都具有積極的意義。

本實(shí)驗(yàn)以鼠抗人TREM-1單抗作為包被抗體，以兔抗人TREM-1多抗作為夾心抗體，建立了定量檢測TREM-1的夾心ELISA方法，經(jīng)過條件優(yōu)化最終選擇1∶3 000抗人TREM-1單抗包被，4℃包被過夜，10%FCS封閉2小時(shí)，1∶2 000的多抗為捕獲多抗，1∶5 000的HRP標(biāo)記二抗，各步驟采用洗滌液洗3分鐘×5次，顯色10分鐘，A450測吸光度值，結(jié)果批內(nèi)和批間CV值分別為6.52%和9.46%，說明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性均可。線性分析結(jié)果本實(shí)驗(yàn)最低檢測含量為0.78 μg/L，R2為0.993 3說明相關(guān)性尚好，截距為0.184 8，大于0，說明該方法仍存在一定的系統(tǒng)誤差。實(shí)驗(yàn)中采用鼠抗人TREM-1單克隆抗體作為包被抗體，而二抗采用羊抗兔IgG多抗，理論上不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，但實(shí)驗(yàn)證實(shí)了單抗與多抗之間有少量交叉反應(yīng)的結(jié)合，這可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)陰性對照的吸光度值較高、重復(fù)性試驗(yàn)的CV值較高的原因。

我們利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對30例急性肺部感染患者和30例正常健康體檢者血清sTREM-1含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：急性肺部感染組sTREM-1含量為(1.16±0.42)μg/L;而對照組為(0.69±0.18)μg/L，證明了急性肺部感染患者血清中TREM-1表達(dá)增加，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該方法的建立為以后對TREM-1與急性肺部感染關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)，特別是可望研制出商品化的ELISA試劑盒，使sTREM-1的檢測在早期診斷急性肺部感染中得到廣泛的應(yīng)用。

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7 盧 燕，鄭淑華，劉 偉 et al.人髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)及多克隆抗體的制備［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011;28(9)：1438-1440.