幽門(mén)螺桿菌唾液酸結(jié)合黏附素（SabA）的克隆表達(dá)＊

李冬宏，宮雅楠，肖 迪，周南進(jìn)，謝 勇，張建中

幽門(mén)螺桿菌唾液酸結(jié)合黏附素（SabA）的克隆表達(dá)＊

李冬宏1，2，宮雅楠1，肖 迪1，周南進(jìn)2，謝 勇3，張建中1

目的構(gòu)建幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，簡(jiǎn)稱(chēng)H．pylori或Hp）唾液酸結(jié)合黏附素（sialic acid－binding adhesion，Sab A）的重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)，為探討Sab A的功能及相關(guān)疫苗的發(fā)展提供幫助。方法以Hp 26695株基因組為模板，設(shè)計(jì)sabA基因特異性引物擴(kuò)增目的基因，將PCR產(chǎn)物插入到pGEX－4T－1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)蛋白經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定，并用免疫印跡法評(píng)價(jià)其抗原性。結(jié)果經(jīng)SDS－PAGE和飛行質(zhì)譜鑒定，該表達(dá)蛋白為Hp外膜蛋白Sab A，經(jīng)免疫印法跡檢測(cè)具有良好的抗原性。結(jié)論成功克隆了Hp的Sab A，并能在大腸桿菌BL21中表達(dá)，該蛋白具有良好的抗原性。

幽門(mén)螺桿菌；唾液酸黏附素；基因克?。槐磉_(dá)

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，H．pylori或Hp）感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織（MALT）淋巴瘤的發(fā)病密切［1－3］。Hp的定植是致病的前提，而黏附素對(duì)其定植有著至關(guān)重要的作用。唾液酸結(jié)合黏附素（sialic acidbinding adhesion，Sab A）是新近發(fā)現(xiàn)的一種黏附素，它又稱(chēng)Hp外膜蛋白17（outer membrane protein，OMP17），在Hp致病中起著重要作用，它與胃黏膜萎縮、腸上皮化生和胃癌的發(fā)生密切相關(guān)［4］。本研究擬構(gòu)建sab A重組質(zhì)粒，并對(duì)表達(dá)的Sab A進(jìn)行初步探討，為后續(xù)致病機(jī)理研究和以其為靶點(diǎn)的Hp疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料 Hp 26695菌株及表達(dá)質(zhì)粒p GEX－4T－1為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所診斷室（傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）保存；大腸桿菌BL21、瓊脂糖、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、XhoⅠ、Ta KaRa LA Taq酶、1 kb DNA Ladder Marker、T4DNA連接酶均購(gòu)自Ta KaRa公司；QIAamp DNA Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司。1．2 方法

1．2．1 基因組和表達(dá)質(zhì)粒的提取 按照QIAamp DNA Mini Kit和質(zhì)粒小提試劑盒的操作方法，提取Hp 26695菌株的基因組和表達(dá)質(zhì)粒p GEX－4T－1。

1．2．2 目的基因的擴(kuò)增 根據(jù) GenBank（ID：899697）中Hp 26695菌株omp17基因序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并在5′端加入合適的內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列如下：

上游引物ATGGATCCAGCGCCGGCTATCAAATCG，

下游引物CGCTCGAGTCAGTAAGCGAACACATAATTGAGATA

上下游引物分別加入的酶切位點(diǎn)為Bam HⅠ、XhoⅠ。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以Hp 26695菌株基因組為模板擴(kuò)增sabA基因片段，其反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃10 min、變性95℃1 min、退火55℃1 min、延伸72℃2 min、終延伸72℃5 min，35個(gè)循環(huán)。所獲PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠DNA回收，其方法按試劑盒操作。1．2．3 pGEX－4T－1／sab A重組質(zhì)粒的構(gòu)建 取回收后的PCR產(chǎn)物和提取的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切反應(yīng)，瓊脂糖凝膠鑒定后回收。后將回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，其中PCR產(chǎn)物與p GEX－4T－1比例為1∶3，金屬浴16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E．coli BL21后，并涂布于含有氨芐青霉素（100μg／m L）的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，其詳細(xì)方法參見(jiàn)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》［5］。

1．2．4 重組質(zhì)粒的鑒定 挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒做質(zhì)粒PCR，然后用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、XhoⅠ30℃酶切1 h后再37℃酶切3 h，鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1．2．5 誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE經(jīng)鑒定成功的陽(yáng)性克隆株在LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后按照1∶100轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0．6～0．8時(shí)，加入終濃度為1．0 mmol／L的IPTG，誘導(dǎo)4 h。收集菌液，將菌液用PBS清洗，離心棄上清，再加入30 μLPBS和10μL蛋白上樣緩沖液煮沸10 min后進(jìn)行12%SDS－PAGE分析。

1．2．6 飛行質(zhì)譜鑒定 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）后，在凝膠的相應(yīng)位置切下表達(dá)蛋白條帶，按照飛行質(zhì)譜樣制備操作流程制備質(zhì)譜樣，然后經(jīng)過(guò)4700 MALDI－TOF－MS蛋白質(zhì)組分析系統(tǒng)分析鑒定是否為Sab A。

1．2．7 免疫印跡 將誘導(dǎo)表達(dá)菌樣品進(jìn)行SDSPAGE，再轉(zhuǎn)到0．45μm的PVDF膜上，用抗 Hp 26695全菌蛋白免疫兔血清（1∶100稀釋?zhuān)贵w由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所診斷室制備）室溫孵育3 h，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶10 000稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，用DAB顯色。

2 結(jié) 果

2．1 sabA基因的擴(kuò)增 以Hp 26695基因組DNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到一條大小約1 890bp的片段，與目的基因的大小相符（圖1）。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析1：1 kb DNA Ladder Marker；2：陰性對(duì)照；3：PCR 擴(kuò)增sabA產(chǎn)物Fig．1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products 1：1 kb DNA Ladder Marker；2：negative control；3：sab A of PCR products

2．2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 將重組質(zhì)粒p GEX－4T－1－sab A經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切后1%凝膠電泳鑒定，得到兩條目的條帶，大小分別約為4 969bp（p GEX－4T－1）和1 890bp（sabA），符合預(yù)期結(jié)果（圖2），證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2．3 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE和飛行質(zhì)譜鑒定包含重組質(zhì)粒p GEX－4T－1－sab A的菌株經(jīng)誘導(dǎo)后進(jìn)行12%SDS－PAGE，發(fā)現(xiàn)在90 k D附近出現(xiàn)大量表達(dá)蛋白條帶，與預(yù)計(jì)大小95 k D（含GET標(biāo)簽蛋白26 k D）相比稍微偏小（圖3），切下該處的蛋白條帶按質(zhì)譜樣制作標(biāo)準(zhǔn)流程制備質(zhì)譜樣，經(jīng)飛行質(zhì)譜分析，為Hp外膜蛋白17（表1），表明該重組質(zhì)粒在E．coli BL21中成功表達(dá)Sab A。

2．4 免疫印跡 將12%SDS－PAGE分離的蛋白樣轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，Western blot結(jié)果顯示在95k D附近出現(xiàn)了一條特異性條帶，且條帶位置與SDSPAGE圖中目的條帶位置一致，說(shuō)明表達(dá)蛋白具有良好的抗原性（圖4）。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sabA雙酶切電泳圖1：重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sab A雙酶切樣品；2：重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sab A樣品；3：1 kb DNA Ladder MarkerFig．2 Identification of recombinant plasmid pGEX－4T－1／sabA by restricted endonuclease enzymes 1：Digested by Bam HⅠand XhoⅠ；2：Recombinant plasmid pGEX－4T－1／sab A；3：1 kb DNA Ladder Marker

圖3 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE圖1：重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sab A未誘導(dǎo)樣品；2：重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sab A誘導(dǎo)樣品；3：空pGEX－4T－1誘導(dǎo)樣品；4：E．coli BL21未誘導(dǎo)樣品；5：E．coli BL21誘導(dǎo)樣品；6：蛋白 MarkerFig．3 SDS－PAGE analysis of Sab A recombinant protein expressed in BL21 1：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A before induction；2：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A induction with IPTG；3：plasmid p GEX－4T－1 induction with IPTG；4：E．coli BL21 before induction；5：E．coli BL21 induction with IPTG；6：molecular mass marker

表1 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab．1 Identification of SabA recombinant protein by time－of－flight mass spectrometry

3 討 論

Hp粘附于人胃黏膜必須有特異的黏附素和相應(yīng)受體，Hp的黏附素目前已知有二十多種，但受體明確的不多［6］。2002年Jafar等［7］在研究 CCUG 17875突變株時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)CCUG 17875 bab A2突變株能與感染Hp的胃炎病人的胃黏膜結(jié)合，從而發(fā)現(xiàn)了一種新的黏附素Sab A，它能夠特異性地與胃黏膜上皮細(xì)胞表面的唾液酸化的路易斯（sialyl－Lewis X／A，s LeX／A）抗原結(jié)合，并對(duì)sab A 陽(yáng)性菌株的定植起著重要作用［8］。在Hp感染初期，Bab A與Leb血型抗原結(jié)合有利于Hp在胃黏膜的定植，然而隨著炎癥的加劇，胃黏膜上皮s LeX／A表達(dá)增加，Hp就要通過(guò)Sab A在胃黏膜定植。SLeX／A是唾液酸糖復(fù)合物，它在正常胃黏膜中含量很少，但是隨著Hp感染和其誘導(dǎo)的炎癥持續(xù)存在，正常狀態(tài)下胃黏膜的路易斯抗原被s LeX／A取代［9］。雖然目前國(guó)外學(xué)者對(duì) Hp的Sab A進(jìn)行了研究［10－14］，但至今人們對(duì)Sab A在Hp粘附過(guò)程中的作用及其功能尚不是十分清楚，其致病機(jī)理還有待進(jìn)一步研究探討。

圖4 表達(dá)蛋白免疫印跡1：重組質(zhì)粒p GEX－4T－1－sab A誘導(dǎo)樣品；2：重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－sab A未誘導(dǎo)樣品；3：空 pGEX－4T－1誘導(dǎo)樣品；4：E．coli BL21誘導(dǎo)樣品；5：Hp全菌蛋白；6：蛋白markerFig．4 Protein expression by immunoblot analysis 1：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A induction with IPTG；2：recombinant plasmid pGEX－4T－1／sab A before induction；3： plasmid p GEX －4T－1induction with IPTG；4：E．coli BL21 induction with IPTG；5：Helicobacter pylori whole cell protein；6：molecular mass marker

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)結(jié)晶逐漸應(yīng)用于分子的生物學(xué)功能研究的這一領(lǐng)域，并有著重要的意義。本研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒p GEX－4T－1－sab A表達(dá)蛋白中含有GST標(biāo)簽，便于該融合蛋白的純化，為該蛋白質(zhì)的結(jié)晶創(chuàng)造了有利的物質(zhì)條件，并對(duì)分析該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)及推測(cè)相關(guān)生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，從而探索出研究該蛋白功能的新途徑，這為深入研究Sab A的功能和致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

基因工程疫苗是防治Hp感染的一種很有前途的手段，而Hp外膜蛋白大多數(shù)位于細(xì)菌表面，具有表面暴露的特性，能引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，因此許多Hp疫苗的研究均以其外膜蛋白疫苗為抗原［15－16］。粘附是Hp感染的先決條件，也是致病的關(guān)鍵，編碼黏附素的sabA基因?yàn)镠p所特有，并在不同菌株相對(duì)保守，通過(guò)比對(duì)Hp 26695與Hp SJM180、B8、J99、P12、HPAG1、PeCan4、B38的sab A 基因的核苷酸序列和氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列同源性都在87%～95%，氨基酸序列同源性在78%～94%，其中在Hp P12株變異程度最大，剔除Hp P12株信息后基因序列同源性都在91%以上，氨基酸序列同源性都在89%以上。這結(jié)果表明雖然sab A基因存在多態(tài)性，但相對(duì)于其他蛋白該外膜蛋白更保守。本研究通過(guò)Western blot進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)該表達(dá)蛋白具有良好抗原性，提示Sab A有望成為Hp疫苗研究的候選抗原成分。

［1］Basso D，Plebani M，Kusters JG．Pathogenesis of Helicobacter pylori infection［J］．Helicobacter，2010，15（Suppl．1）：14－20．

［2］Olfat FO，Zheng Q，Oleastro M，et al．Correlation of the Helicobacter pylori adherence factor Bab A with duodenal ulcer disease in four European countries［J］．FEMS Immunol Med Microbiol，2005，44：151－156．

［3］Timothy LC．Role of Helicobacter pylori Outer Membrane Proteins in Gastroduodenal Disease［J］．Journal of Infectious Disease，2006，194：1343－1345．

［4］Yamaoka Y，Ojo O，F(xiàn)ujimoto S，et al．Helicobacter pylori outer membrane proteins and gastroduodenal disease［J］．Gut，2006，55：775－781．

［5］Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al．顏?zhàn)臃f，王海林譯．精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］．北京：科學(xué)出版社，1998．

［6］Mobley HLT，Mendz GL，Hazell SL．Helicobacter pylori：Physiology and Genetics［M］．ASM Press，2001．

［7］Mahdavi J，Sonden B，Boren T，et al．Helicobacter pylori Sab A adhesin in persistent infection and chronic inflammation［J］．Science，2002，297（5581）：573－578．

［8］Nakasato F，Shimoyama T，Yoshimura T，et al．Infection of sab A－positive H．pylori does not induce anti－Lewis X antibody in host［J］．Hepato－Gastroenterology，2008，55：1122－1125．

［9］Mahdavi J，Sonden B，Hurtig M，et al．Helicobacter pylori Sab A adhesin in persistent infection and chronic inflammation［J］．Science，2002，297（5581）：573－578．

［10］Yamaoka Y．Increasing evidence of the role of Helicobacter pylori Sab A in the pathogenesis of gastroduodenal disease［J］．Infect Dev Ctries，2008，2（3）：174－181．

［11］Yanai A，Maeda S，Hikiba Y，et al．Clinical relevance of Helicobacter pylori sab A genotype in Japanese clinical isolates［J］．Gastroenterol Hepatol，2007，22（12）：2228－32．

［12］Nishioka M，Takeuchi H，Con SA，et al．The mechanical binding strengths of Helicobacter pylori Bab A and Sab A adhesins using an adhesion binding assay－ELISA，and its clinical relevance in Japan［J］．Microbiol Immunol，2010，54（8）：442－51．

［13］Sheu BS，Odenbreit S，Hung KH，et al．H．pylori Sab A enhances H．pylori density in patients lacking gastric Lewis B antigen［J］．Am J Gastroenterol，2006，101：36－44．

［14］Yamaoka Y．Increasing evidence of the role of Helicobacter pylori Sab A in the pathogenesis of gastroduodenal disease［J］．Infect Dev Ctries，2008，2（3）：174－181．

［15］劉東升，周南進(jìn)，謝勇，等．幽門(mén)螺桿菌Bab A2／UreI融合基因減毒傷寒沙門(mén)菌重組活載體疫苗的構(gòu)建與鑒定［J］．中華消化雜志，2009，29（9）：564．

［16］Voland P，Hafsi N，Zeitner M，et al．Antigenic Properties of HpaA and Omp18，two outer membrane proteins of Helicobacter pylori ［J］．Infection and Immunity，2003，71 （7）：3837－3843．

Cloning and expressing of Helicobacter pylori sialic acid－binding adhesion（SabA）

LI Dong－h(huán)ong1，2，GONG Ya－nan2，XIAO Di2，ZHOU Nan－jin1，XIE Yong3，ZHANG jian－zhong2
（1．The Medical Institute of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2．Department of Diagnosis National Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China；3．Institute of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China）

The aim was to construct a recombinant plasmid that expresses the Helicobacter pylori（H．pylori）sialic acid－binding adhesion（Sab A）for the further study of vaccine and function of Sab A．The primers were designed according to the sequence of the H．pylori 26695 sab A gene．PCR products were inserted into expression vector pGEX－4T－1，and transformed into E．coli BL21 strain for the expression．The recombinant protein was identified by MALDI－TOF－MS and the antigenicity was tested by Western blot．Results indicated that the recombinant protein was identified as H．pylori outer membrane protein Sab A by SDS－PAGE and MALDI－TOF－MS，which showed good antigenicity in Western blot．It＇s concluded that the gene sab A of H．pylori 26695 was successfully cloned and expressed in E．coli BL21，and the protein expressed has good antigenicity．

Helicobacter pylori；Sab A；gene cloning；expression

R378．2

A

1002－2694（2012）03－0197－04

＊國(guó)家科技支撐計(jì)劃（No．2007BAI04B02）資助

張建中，Email：zhangjianzhong＠icdc．cn

1．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所診斷室，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2．南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，南昌 330006；3．南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化研究所，南昌 330006

2011－10－27；

2012－01－05