貴州枇杷炭疽病病原菌的鑒定及rDNA-ITS序列分析

李小霞，肖仲久，章同平

(遵義師范學院生物系，貴州遵義 563002)

枇杷 Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.屬薔薇科Rosaceae蘋果亞科的一個屬，是我國重要的亞熱帶經(jīng)濟作物，果實味道鮮美，葉因含苦杏仁甙和揮發(fā)油具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等作用;種子可釀酒及提煉酒精;木材質(zhì)地堅韌，可制木梳、木捧等，經(jīng)濟價值很高［1］，種植面積逐年擴大。枇杷從種植、采收到果實的貯存整個過程中都會受到各種病害的危害，葉片、果實、苗木等都會受到侵染，僅真菌性病害就達20余種［2-4］。其中，炭疽病是枇杷生產(chǎn)中危害較重的病害之一，全世界各枇杷種植地均有報道。該病害主要危害枇杷葉和果實，常造成苗圃大量苗木死亡，也會造成果實腐爛落果，枇杷果實貯運期間還會繼續(xù)發(fā)病，引致經(jīng)濟損失。

炭疽病也是貴州枇杷苗木生產(chǎn)中發(fā)生嚴重的病害，在生長期呈暴發(fā)趨勢，嚴重影響苗木的品質(zhì)。

在此之前貴州尚未發(fā)現(xiàn)枇杷炭疽病，對貴州枇杷炭疽病的病原菌種類不清楚，國內(nèi)其它枇杷產(chǎn)區(qū)報道較多的是對該病病原菌的生物學特性研究及室內(nèi)抑菌實驗等。為弄清該病害致病菌的歸屬，有效地開展防治工作，筆者在對貴州枇杷炭疽病調(diào)查的基礎(chǔ)上，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學方法并結(jié)合病原菌rDNA-ITS序列分析進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查和癥狀觀察 2009—2010年調(diào)查貴州遵義市郊、黔南羅甸枇杷苗圃基地炭疽病的發(fā)生和危害情況，對枇杷病葉的癥狀觀察、記載和拍照。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌的分離和純化 采用常規(guī)組織分離法［5］。把病原菌接種在PSA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)，待分生孢子產(chǎn)生后，挑入滅菌蒸餾水中，配成濃度約為1.0×106個/mL的孢子懸浮液，用無菌毛細管吸取少量孢子液，輕輕點在PSA培養(yǎng)基平板上(培養(yǎng)基平板預先用直徑5 mm的打孔器打孔作好標記)，待分生孢子萌發(fā)后，形成微小菌落時，顯微鏡下將由單個分生孢子萌發(fā)形成的微小菌落切下，接入新的PSA平板上，以獲得單孢純菌株。

1.2.2 致病性鑒定 以病原菌的菌碟作為接種體，選擇健康的枇杷葉片進行離體接種。供試葉片先用75%酒精進行表面消毒，再進行傷口接種(刺傷)，葉脈另一側(cè)接種直徑為5 mm無菌的PSA培養(yǎng)基做對照，接種后保濕24 h，每隔1或2 d觀察癥狀。發(fā)病后再次分離病原菌，并與原接種菌進行比較［6］。

1.2.3 病原菌形態(tài)學的特征觀察 將病原菌移接于PSA平板上，25℃培養(yǎng)3～4 d，記錄菌落特征，并在顯微鏡下觀察分生孢子和附著胞。

1.2.4 分子鑒定

1.2.4.1 DNA提取 將已純化的病原菌移至PSA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，25℃培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)好的菌絲在雙層尼龍網(wǎng)上過濾，并用無菌水沖洗2～3次，用濾紙壓干后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫珼NA提取采用常規(guī) CTAB 法［7］。

1.2.4.2 rDNA-ITS的擴增 采用真菌ITS通用引物ITS1和 ITS4［8］進行擴增。PCR反應體系為25 μL，各組分如下:模板 DNA 1 μL(約 30 ng)，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，引物 ITS1 和ITS4 各 0.5 μL(10 μmoL/L)，TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 17 μL，所用試劑除引物外，均購自Tiangen生化科技有限公司。

PCR擴增在PTC-200型擴增儀上完成，擴增程序為:94℃，預變性3 min，然后94℃，1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35次循環(huán)，72℃延伸8 min，4℃保存。反應結(jié)束后，取5 μL擴增產(chǎn)物，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)觀察、照相、保存。在紫外燈下從凝膠中切取目的條帶，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TaKaRa)純化，送北京諾賽基因測序。

然后將菌株的rDNA-ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行序列比對，并進行同源性分析，結(jié)合病原菌的形態(tài)學觀察及致病性測定，最終確定病原菌的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀 枇杷炭疽病在貴州各地苗圃基地均有發(fā)生，發(fā)病嚴重的田塊病葉率25%左右，5—9月是發(fā)生高峰期，嚴重的可造成葉片大量枯死或脫落。該病主要危害枇杷的葉片及葉柄(因是苗木，尚未開始結(jié)果)。發(fā)病初期，病斑呈水漬狀小斑點，后擴展成直徑3～7 mm的近圓形、橢圓形或不規(guī)則形病斑，病斑中部淺褐色至灰白色，邊緣黑褐色，偶爾會出現(xiàn)不規(guī)則的同心輪紋，病斑后期可相互連結(jié)成片;葉柄染病，多發(fā)生在葉柄與葉片交界處，初為暗綠色小點，后發(fā)展成不規(guī)則長條形病斑，顏色呈褐色至黑褐色，后期病部常密生小黑點，即病原菌的分生孢子盤(圖1)。

圖1 枇杷炭疽病自然發(fā)病癥狀

2.2 致病性 將11個已純化的菌株接種到健康的枇杷葉上，5 d后，接種部位出現(xiàn)水漬狀的褐色病斑，10 d后出現(xiàn)典型的炭疽病癥狀(圖2)。對病斑進行再次常規(guī)分離，獲得了與原分離菌相同的病原菌。因此，按照柯赫氏法則可證明，接種菌即為枇杷炭疽病的病原菌。

圖2 枇杷炭疽病菌接種葉片10 d后表現(xiàn)

2.3 病原菌的形態(tài)特征

2.3.1 病原菌的培養(yǎng)性狀 分離純化獲得的11個菌株形態(tài)特征基本一致。在PSA培養(yǎng)基平板上25℃ 培養(yǎng)，菌落呈圓形，菌絲灰白色、絨毛狀，邊緣整齊。在顯微鏡下觀察，菌絲無色，具有隔膜和分枝。菌落正面灰白色，背面橘黃色，即病原菌的分生孢子團(圖3)，分生孢子圓筒形或長橢圓形，有時一端稍小，單胞無色，具有一個油球，孢子大小(10.5～21.3)μm×(4.0～6.75)μm。分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的附著胞，近圓形、橢圓形或不規(guī)則形。在自然條件下及人工培養(yǎng)基上未發(fā)現(xiàn)有性型(圖4)。

圖3 PSA培養(yǎng)基上病菌菌落(正面)

圖4 分生孢子和附著胞;標尺=10 μm

獲得的11個病原菌株的形態(tài)學鑒定結(jié)果較一致，這表明，侵染貴州枇杷的炭疽病菌組成單一。參照陸家云［6］、Sutton［9］等的描述，初步確定，貴州枇杷炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.。

2.4 分子鑒定

2.4.1 rDNA ITS區(qū)段擴增及測序 為進一步確認貴州枇杷炭疽病菌的歸屬，克隆并分析了分離純化的11個菌株的rDNA-ITS序列。11個供試菌株的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，均擴增得到一條分子量介于500～600 bp的條帶(圖5)。將菌株P(guān)CR產(chǎn)物回收純化，經(jīng)測序分析，該片段全長約540 bp。對11個供試菌株的rDNA-ITS序列進行比較分析，表明除8號菌株外(與其它菌株相比，存在2個堿基的差異，可能屬于測序誤差)，其它10個菌株的序列完全一致。

2.4.2 rDNA-ITS序列的Blast比對與親緣關(guān)系分析 在NCBI網(wǎng)站上進行同源性BLAST比較，發(fā)現(xiàn)與供試菌株(包括8號菌株)同源性達99%及以上的均為膠孢炭疽菌或膠孢炭疽菌的有性型圍小叢殼Glomerella cingulata(代表菌株 GX 02登錄號:JN704145)，與分離自我國山東的一株核桃炭疽菌株(登錄號:HQ845105)的rDNA-ITS序列同源性最高。因此，根據(jù)rDNA-ITS序列比對分析，結(jié)合形態(tài)學特征，可以確定該病害為炭疽病，病原菌種類為膠孢炭疽菌，其有性型為圍小叢殼。

圖5 PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(M:100bp DNA Ladder)

3 結(jié)論與討論

由膠孢炭疽菌引起的植物炭疽病是世界性的植物病害，尤其在熱帶、亞熱帶地區(qū)，寄主范圍十分廣泛，能夠侵染多種植物，引起多種經(jīng)濟作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降［10-11］。

炭疽菌的常規(guī)鑒定主要以分生孢子和附著胞的形態(tài)特征為主，菌落培養(yǎng)特征和寄主范圍作參考的綜合特征來確定的。但是，在植物炭疽菌屬中，許多種類的分生孢子和附著胞的大小、形態(tài)都較相似，進行炭疽菌種類的準確鑒定通常較難。根據(jù)形態(tài)學特征來進行炭疽菌種類的鑒定和分類是不完善的［12-14］，尚需借助輔助技術(shù)手段。目前，存在高度保守區(qū)和可變區(qū)的真菌rDNA被認為是真菌分子研究方法的理想部位。尤其是真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，因其進化速率比編碼區(qū)快，在種內(nèi)存在高度保守，而在種間存在著極大的變化。這些都可為真菌的分類鑒定和分子檢測提供豐富的遺傳信息［15］。因此，以傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定為基礎(chǔ)，同時結(jié)合PCR為輔助的rDNA-ITS分子檢測技術(shù)，可最大程度的保證鑒定結(jié)果的可靠性［16］。

植物病害的研究中，病原物的準確鑒定對于病害的防治和流行預測具有十分重要的意義。本研究根據(jù)傳統(tǒng)的真菌形態(tài)學、致病性鑒定及病原菌rDNA-ITS序列的同源性分析結(jié)果，最終確認近年在貴州枇杷苗木上暴發(fā)的疑似病害是由膠孢炭疽菌引起的炭疽病，病菌的有性型為圍小叢殼菌，未發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum Simmonds聯(lián)合致病。這與孔瓊等報道的云南蒙自、陶金華 等報道的福建枇杷炭疽病病原菌相同［17-18］，與瞿付娟報道的重慶枇杷炭疽病病原菌不同［19］。這說明，貴州省不同枇杷種植地發(fā)生的炭疽病病原菌結(jié)構(gòu)比較單一，病原菌種類相同，這對于病害的防治與抗性品種的選育是十分有利的。

［1］ 韓金聲.中國藥用植物病害［M］.長春:吉林科學出版社，1990:144-147.

［2］ 戴芳瀾.中國真菌總匯［M］.北京:科技出版社，1979:79-100.

［3］ 劉添丁.常見枇杷病蟲害及其防治［J］.農(nóng)藥世界，1993(115):23-29.

［4］ 林尤劍，高日霞.福建枇杷病害與綜合防治［J］.福建果樹，1993(3):58-60.

［5］ 方中達.植病研究方法［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998:123-125.

［6］ 陸家云.植物病原真菌學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001:55-56.

［7］ 肖仲久，李小霞，段帥，等.麻瘋樹葉枯病菌的鑒定［J］.菌物學報，2010，29(6):874-878.

［8］ 肖仲久，李紅玫，蔣選利.草石蠶塊莖腐爛病病原菌鑒定［J］.植物病理學報，2011，41(2):210-214.

［9］ Sutton B C.The Coelomycetes［M］.England:CM I.，Kew，1980:523-537.

［10］ S Y Yang，S C Su，T Liu，et al.First report of anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides on pistachio(Pistacia vera)in China［J］.Plant Disease，2011，95(10):1314.

［11］ T Thomidis，E Exadaktylou.Occurrence of a fruit spot disease of pomegranates caused by Colletotrichum gloeosporiodes in the Prefecture of Komotini，Greece［J］.Plant Disease，2011，95(7):1287.

［12］ Du M，Schardl C L，Nuckles E M，et al.Using mating-type gene sequences for improved phylogenetic resolution of Collectotrichum species complexes［J］.Mycologia，2005，97(3):641-658.

［13］ Abang M M，Winter S，Green K R，et al.Molecular identification of Colletotrichum gloeosporioides causing yam anthracnose in Nigeria［J］.Plant Pathology，2002，51:63-71.

［14］ Brown A E，Sreenivasaprasad S，Timmer L W.Molecular characterization of slow-growing orange and key lime anthracnose strains of Colletotrichum from Citrus as C．a(chǎn)cutatum［J］.Phytopathology，1996，86(5):523-527.

［15］ 林劍偉，闕友雄，陳天生，等.核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列標記在真菌分類鑒定中的應用［J］.生物技術(shù)通訊，2007，18(2):292-294.

［16］ 吳良慶，朱立武，衡偉，等.碭山梨炭疽病病原鑒定及其抑菌藥劑篩選［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43(18):3750-3758.

［17］ 孔瓊，袁盛勇，葉海燕，等.云南枇杷炭疽病菌生物學特性研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2010，23(4):1380-1383.

［18］ 陶金華，胡瑞蘭，陳發(fā)河，等.枇杷炭疽病菌的生物學特性的研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學，2006，43(6):472-476.

［19］ 瞿付娟.重慶枇杷花腐病病因研究［D］.重慶:西南大學，2008:41.