RNAi技術防治害蟲的研究進展

景天忠，董瀛謙，張海俠，劉璇

(東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040)

由于“3R”問題，曾經(jīng)風光無限的化學防治只能作為害蟲防治的最后措施來救急，而近年來令人矚目的轉基因抗蟲植物(如Bt棉等)也受到抗性問題的困擾［1］。但人們尋找害蟲控制新方法的步伐從未停止，隨著 RNA干涉(RNA interference，RNAi)技術在基因功能研究、基因治療等方面的廣泛應用，以及RNAi機制研究的深入，利用RNAi技術防治害蟲成了人們研究的熱點之一［2］。

1 RNAi技術防治害蟲的原理

Fire等首先報道了外源的dsRNA可使與之同源的線蟲內(nèi)源的mRNA沉默，并將這一現(xiàn)象稱為RNA干涉［3］。在此之前這種技術在植物中稱為轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)，在真菌中稱為‘quelling’，但在動物中卻是一項全新的技術。目前，RNAi技術已用于基因組研究中對基因功能的鑒定、基因敲除(gene knockdown)、癌癥及病毒病的控制。作為一種生物技術，RNAi在控制農(nóng)林害蟲方面也表現(xiàn)出巨大的潛力［4］。

RNAi可分為細胞自主性的(cell-autonomous)和非細胞自主性的(noncell-autonomous)。后者又包括系統(tǒng)性RNAi(systemic RNAi)和環(huán)境RNAi(environmental RNAi)［4－5］。對細胞自主性 RNAi，沉默過程僅限于引入或表達 dsRNA的細胞，且RNAi過程僅限于單個細胞內(nèi)。目前，細胞自主性RNAi的機制已經(jīng)比較清楚，即dsRNA被RNase III(即通常稱之為Dicer)切割成21－25個核苷酸長的短干涉RNA雙鏈體(short interfering RNA，siRNA)后整合到RNA誘導的沉默復合體(RNA induced silencing complex，RISC)上，在丟棄過客鏈(passenger strand)后，RISC結合到同源的mRNA上，并將其切斷以阻止翻譯。而非自主性RNAi中，干涉發(fā)生于那些非應用dsRNA或非產(chǎn)生dsRNA的組織或細胞;環(huán)境RNAi指的是細胞從環(huán)境中吸收dsRNA，因而該過程也可以發(fā)生于單細胞的生物。系統(tǒng)性RNAi只能發(fā)生于多細胞生物，因為它包含一個沉默信號從一個細胞轉運到另一個細胞或從一個組織轉運到另一個組織的過程。在多細胞生物中，環(huán)境RNAi之后可接著發(fā)生系統(tǒng)性RNAi，非細胞自主性RNAi之后也可接著發(fā)生細胞自主性RNAi。

應用 RNAi防治害蟲主要是非細胞自主式RNAi，即昆蟲通過取食來內(nèi)化目標基因的dsRNA。當dsRNA經(jīng)取食到達昆蟲中腸后被昆蟲吸收(環(huán)境RNAi)，而被干涉的靶基因位于中腸之外，沉默信號能通過細胞或組織進行傳播，起到RNAi的效果(系統(tǒng)性RNAi)。

2 昆蟲吸收dsRNA的機制

在線蟲中，與非細胞自主式RNAi有關的兩個蛋白質(zhì)已經(jīng)鑒定出來，分別命名為SID-1和SID-2。SID-1是一個跨膜蛋白，對系統(tǒng)性RNAi來說是必需的。其作用可能類似于一個多聚體，能被動運輸dsRNA到線蟲的細胞，但對將dsRNA輸出細胞來講，它又是非必需的［6－7］。SID-2 主要發(fā)現(xiàn)于線蟲的腸組織中，有助于環(huán)境RNAi［8］。SID-2可能通過修飾SID-1來激活轉運過程，或者結合到來自環(huán)境的dsRNA上并將dsRNA分發(fā)到SID-1，或者誘導對dsRNA的內(nèi)吞途徑使SID-1將dsRNA分發(fā)到質(zhì)膜上［5］。因而線蟲對dsRNA的吸收是一種跨膜通道介導的吸收機制。

在模式昆蟲果蠅中，沒有發(fā)現(xiàn)sid的同源基因，也沒表現(xiàn)出明顯的系統(tǒng)性RNAi，但其細胞能夠響應環(huán)境RNAi［9］。此外，當將果蠅的S2細胞浸于含有 dsRNA 的培養(yǎng)基中時可產(chǎn)生 RNAi［10－11］。通過對來自S2細胞cDNA庫的2 000個dsRNA片段進行測試，Miller鑒定出了一個上調(diào)胞內(nèi)沉默事件的基因——網(wǎng)格蛋白重鏈基因(clathrin heavy chain gene)［10］。該基因是細胞內(nèi)吞裝置的一個組成部分，這表明細胞過程參與了S2細胞中的RNAi。而實驗又進一步表明，這種內(nèi)吞作用是受體介導的內(nèi)吞作用(receptor-mediated endocytosis)(如清道夫受體)［11］。

非細胞自主式RNAi的dsRNA吸收機制的研究主要集中在3種分子上:(1)SID-1;(2)清道夫受體;(3)RSD-3。

目前sid的同源基因已在半翅目、鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、直翅目以及毛虱目的昆蟲發(fā)現(xiàn)［4］。但在蜜蜂Apis mellifera和赤擬谷盜Tribolium castaneum中，SID在dsRNA吸收中的作用截然相反。在蜜蜂中，sid-1基因的表達恰在靶基因被敲除之前升高［12］，但其表達與沉默效果之間的直接關系并未得到證實。而在赤擬谷盜中，無論是3個同源基因單獨沉默還是一起沉默，RNAi并不受其sid-1基因沉默的影響。但這并不能排除sid-1基因與基因沉默有關，因為這種現(xiàn)象有可能是由于競爭細胞自主式核心RNA裝置，互補基因減弱了RNAi的效果［13］。更有意思的是有些昆蟲的sid-1基因同源物與線蟲的tag-130基因的相似性要高于跟sid-1基因的相似性。而在線蟲中，tag-130基因卻與系統(tǒng)性RNAi無關。這就意味著在這些昆蟲中SID-1可能非系統(tǒng)性RNAi或dsRNA吸收所必需［13］，而存在另一個可能的機制。在鱗翅目昆蟲家蠶中，盡管存在3個SID-1的同源物，但系統(tǒng)性RNAi還是很難實現(xiàn)。而在蚊子中盡管不存在SID-1的同源物，但系統(tǒng)性RNAi卻是有可能的［14］。

果蠅中有兩個 C類清道夫受體，SR-CI和Eater，它們結合于一些革蘭氏陰性或陽性菌，介導吞噬作用。但如前所述，它們介導了 S2細胞對dsRNA的吸收［11］，但關于該受體更多的情況還不得而知。在赤擬谷盜和果蠅中還發(fā)現(xiàn)了rsd-3的同源基因［13］，它們含在特異的epsin氨基末端同源域(epsin amino-terminal homology，EATH)，但還不能確定它是否與RNAi有關。

在有些生物如線蟲Caenorhabditis elegans中，RNAi應答是系統(tǒng)性的。昆蟲中也表現(xiàn)為系統(tǒng)性，但在果蠅中卻并非表現(xiàn)為強健的系統(tǒng)性應答。人們急于尋求研究系統(tǒng)性RNAi應答的模式昆蟲，鞘翅目昆蟲Trbolium是一個候選者。目前，通過對Trbolium基因組的研究，Tomoysu等已鑒定出核心RNAi基因，以及與系統(tǒng)性 RNAi應答有關的基因［13］，如與線蟲 sid-1同源的基因以及 tag-130基因。該機制的研究可能影響利用RNAi技術進行害蟲防治的方法。

3 RNAi技術防治害蟲的優(yōu)勢

RNAi技術防治害蟲具有兩方面的優(yōu)勢:一方面是防治對象的特異性極高，不會對其他昆蟲特別是害蟲天敵產(chǎn)生負面影響，有利于害蟲生物防治和綜合治理體系的實施。Whyard等利用喂食小于40 nt雙鏈RNA的方法，選擇不同物種特異性的序列片段，發(fā)現(xiàn)可以特異性殺死目標害蟲而對近緣物種沒有影響［15］。這一研究結果表明，根據(jù)害蟲基因序列的特異性，可以設計專一性基因沉默技術。另一方面由于RNA分子的不穩(wěn)定性，不會出現(xiàn)殘留污染問題，因此對環(huán)境生態(tài)安全和食品安全沒有影響，具有很高的安全性。

4 RNAi技術防治害蟲的實施方法

4.1 注射 向黃曲條跳甲phyllotreta striolata蛹注射Psor1基因的dsRNA后，其mRNA的轉錄水平下降，且黃曲條跳甲對寄主植物的嗜好性下降［16］。Ghanim等將長的dsRNA注射于粉虱Bemisia tabaci體腔內(nèi)，結果表明與這些dsRNA同源的、特異地表達于中腸和唾腺的基因的表達下降到70%［17］。Tang等向甜菜夜蛾Spodoptera exigua注射兩種貯存蛋白hexamerin 1和storage protein 1的dsRNA，204 h后昆蟲的生存率僅分別為38.7% 和24.3%，顯著低于對照［18］。

4.2 喂食 Huvenne和Smagghe綜述了近年來通過飼喂進行RNAi的昆蟲［4］，這些昆蟲分屬于鞘翅目、雙翅目、膜翅目、等翅目、半翅目和直翅目。連續(xù)取食0.5 mg/mL海藻糖磷酸合成酶(trehalose phosphate synthase，TPS)dsRNA的褐飛虱 Nilaparvata lugens在2，4，7和10 d的累計存活率分別下降到75.56%，64.44%，55.56%和40.00%，顯著低于對照，表明海藻糖磷酸合成酶也可用于害蟲防治［19］。Zhou等通過飼喂法沉默了白蟻Reticulitermes flavipes的兩個基因，其中一個是消化纖維素的酶，另一個是貯存蛋白hexamerin，結果是顯著地影響白蟻的形態(tài)發(fā)育和死亡率［20］。Kumar等用化學合成的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的 siRNA直接飼喂棉鈴蟲Helicoverpa armigera的幼蟲，結果棉鈴蟲的AChE被沉默，死亡率增加，生長受到抑制，蛹重下降，畸形同時產(chǎn)卵力下降［21］。Griebler等通過注射和飼喂法研究了影響昆蟲JH合成的兩個神經(jīng)肽——促咽側體神經(jīng)肽和抑咽側體神經(jīng)肽，基因被抑制后，草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda幼蟲中JH的滴度升高，幼蟲期延長［22］。

4.3 轉基因 Baum等報道了具有突破性的研究工作，即通過使昆蟲取食表達dsRNA的植物來控制害蟲［23］。能夠在液泡產(chǎn)生H+ATPase dsRNA的轉基因玉米可降低玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera的危害。含有棉鈴蟲Helicoverpa armigera細胞色素P450基因的轉基因植物煙草Nicotiana tabacum和擬南芥Arabidopsis thaliana，可降低棉鈴蟲細胞色素P450基因的表達，并抑制幼蟲的生長［24］。甜菜夜蛾取食了通過大腸桿菌Escherichia coli表達的幾丁質(zhì)酶合成基因A(SeCHSA)的dsRNA后，其5齡幼蟲、預蛹和蛹的平均存活率顯著低于對照，取食后靶基因的轉錄水平、組織結構和存活率均呈劑量依賴的模式［25］。

5 存在的問題及展望

使用RNAi技術防治害蟲還面臨著一些問題。首先是靶基因沉默后能否對害蟲產(chǎn)生致死效應。例如用表達Nlsid-1和Nlaub兩個基因siRNA的轉基因的水稻飼喂褐飛虱后，這兩個基因在中腸中的表達下降，然而害蟲并不表現(xiàn)出明顯的致死效應［26］。因此，在設計RNAi防治技術方案時，特別是在轉基因時必須注意對目標基因的選擇。RNAi的致死效應還與劑量有關，使用轉基因的植物可持續(xù)產(chǎn)生siRNA，但其只能表達一種固定的siRNA。通過噴灑的方法來應用RNAi技術則可隨時更換目標dsRNA，但這種方法容易受到dsRNA產(chǎn)量及成本的限制。傳統(tǒng)的體外轉錄方法或者化學合成法均不能滿足實際生產(chǎn)的需要。Bao和Cagan以及Yin等開發(fā)出了dsRNA的原核表達系統(tǒng)［27－28］，在降低成本的同時可大量生產(chǎn)目標dsRNA用于害蟲防治。在將目標dsRNA引入昆蟲的應用技術上，除噴灑、轉基因等常規(guī)方法外，一些新的方法也在研究開發(fā)之中。如Gu等利用濃核病毒介導的RNAi技術使白紋伊蚊Aedes albopictus幼蟲V-ATPase基因的表達下降了 70%［29］。

綜上可以看出，利用RNAi原理防治害蟲的技術還處于實驗階段，要成為主流的害蟲防治技術尚需時日。但人們在該研究領域中取得的成果卻是日新月異。因此有理由相信利用RNAi技術防治害蟲的未來是一片光明。

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