極度瀕危植物巧家五針松基因組微衛(wèi)星特征分析

阮楨媛 王兵益 歐陽志勤 廖禮彬 蘇騰偉 喬 璐

(1.云南林業(yè)職業(yè)技術學院，昆明 650224； 2.中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224； 3.云南省環(huán)境科學研究院， 昆明 650034)

極度瀕危植物巧家五針松基因組微衛(wèi)星特征分析

阮楨媛1王兵益2*歐陽志勤3廖禮彬2蘇騰偉1喬 璐1

(1.云南林業(yè)職業(yè)技術學院，昆明 650224；2.中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224；3.云南省環(huán)境科學研究院， 昆明 650034)

巧家五針松是世界極度瀕危植物，對其SSR引物的開發(fā)有助于其遺傳學研究以及物種的保護。本研究通過Illumina高通量測序技術獲得巧家五針松全基因組序列，并以MISA軟件查找得到2 651個微衛(wèi)星序列，其中單核苷酸重復最多，可能預示了其悠久的進化歷史。不同重復類型中，A/T含量顯著高于G/C；在不同長度重復單元中，二核苷酸重復微衛(wèi)星長度變異程度最高；各重復類型微衛(wèi)星長度與微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率成反比。獲得的微衛(wèi)星序列能夠滿足巧家五針松的種群遺傳學研究，而且反映了該物種的偏好性及對應的潛在功能，并且對該物種的保護提供了資料。

巧家五針松；基因組；微衛(wèi)星

巧家五針松(PinussquamataX.W.Li)是李鄉(xiāng)旺于上世紀90年代發(fā)現(xiàn)的僅分布于我國云南省巧家縣的珍稀樹種[1]，天然狀態(tài)下該種僅存立木31株，其野外種群低于穩(wěn)定存活界限(野生株數(shù)≤5 000株)，隨時有滅絕的危險，2008年被列入云南省極小種群物種，2010年云南省林業(yè)廳、云南省綠色環(huán)境發(fā)展基金會指導資助開展對其實施野外救護項目，且被列入全球100種最瀕危物種名錄[2]。針對該物種瀕?，F(xiàn)狀，陸素娟等對五針白皮松瀕危原因進行了初步探討，指出種子產量少、質量低、發(fā)芽勢弱，氣候變化，毀林開荒等因素可能是其處于極度瀕危狀態(tài)的主要原因[3]。為加強五針白皮松的保護工作，進一步分析該種的瀕危原因，昆明植物研究所張志勇利用RAPD分子標記對原生地2個亞居群的遺傳多樣性和遺傳結構進行分析，結果顯示該物種遺傳多樣性和遺傳分化極低，分析其原因可能是物種演化過程中曾經遭受過嚴重的災害，并由于遺傳漂變和自交衰退等小種群現(xiàn)象而進一步加劇[4]。

自20世紀30年代，Wright、Fisher和Haldane創(chuàng)建種群遺傳學(population genetics)以來[5]，DNA分子標記技術因其所需材料少，代表的遺傳特征穩(wěn)定而廣泛應用于種群遺傳學研究當中。常見的分子標記技術主要有限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、隨機擴增多態(tài)DNA(random amplified polymorphism DNA，RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragments length polymorphism，AFLP)、簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)、序列特征化擴增區(qū)域(sequence characterizedamplified region，SCAR)等，其中RAPD法因其無需知道序列信息，引物具有隨機性，在基因組中豐富度高而被大量運用，但是該技術對反應條件敏感，不同雜交之間不能轉換等因素在一定程度上限制了它的應用。而SSR技術則因其共顯性，涵蓋的范圍廣，揭示多態(tài)性高、穩(wěn)定性高等優(yōu)點彌補了RAPD技術中的缺陷[6]。

SSR技術廣泛應用于種群遺傳結構、遺傳多樣性分析，標記輔助育種，品種親緣關系分析，估算異交率，品種鑒定和指紋圖譜構建和主要性狀基因定位等各個領域[7～11]，但由于開發(fā)SSR引物成本高，很多物種關于SSR信息知之甚少。過去開發(fā)SSR引物大多采用磁珠富集法、FIASCO法(fast isolation by AFLP sequences containing repeats)、ISSR巢式PCR法和改進的選擇性擴增微衛(wèi)星(SAM)法等方法，操作復雜，得到SSR數(shù)量少。部分借助近緣物種進行的SSR引物開發(fā)也因其數(shù)量上的局限性和物種之間的差異，限制了引物的使用以及遺傳信息的獲得。SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)是一套簡化基因組測序技術，是基于全基因組水平上的高通量測序。用SLAF-seq技術開發(fā)的SSR標記具有信息量大、準確率高及成本低廉等特點。目前，將微衛(wèi)星分子標記應用于巧家五針松的研究還處于空白，將其應用于巧家五針松野生種群與不同栽培種群的進一步研究對于該物種的保護及利用都具有重要的意義。因此，本研究利用巧家五針松的基因組測序，全面了解其中SSR序列特征，為篩選巧家五針松微衛(wèi)星標記，進而進行遺傳多樣性和遺傳結構分析，以及巧家五針松的保護提供了遺傳學資料。同時，微衛(wèi)星標記由于需要從已知的序列信息中開發(fā)合適的多態(tài)性信息位點，在資金和時間上都耗費較大，對巧家五針松微衛(wèi)星的分析與開發(fā)利用，有助于將其應用于近緣物種的遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構建、主要性狀基因定位等一系列生物學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料采自云南省昭通市巧家縣藥山國家級自然保護區(qū)。于2015年4月采集剛萌發(fā)的幼嫩針葉，采集后立即置于液氮中帶回實驗室，置于-80℃冰箱中備用。

1.2 方法

采用CTAB法提取植物DNA，對檢測合格的各樣品基因組DNA分別用EcoRV+ScaⅠ酶進行酶切。對得到的酶切片段(SLAF標簽)進行3′端加A處理、連接Dual-index測序接頭、PCR擴增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫質檢合格后用Illumina HiSeqTM2500進行測序。測序完成后將得到的序列進行去接頭、去低質量閱讀框和去污染處理，得到干凈序列，并且進行GC含量和Q30分析，以保證測序質量。

利用MISA軟件對巧家五針松基因組序列進行所有重復單元的微衛(wèi)星查找，查找標準為：單核苷酸重復至少為10個重復，二核苷酸重復最少為6個重復，三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復均最少為5個重復，混合微衛(wèi)星，兩個SSR距離小于250 bp。

2 結果

2.1 SLAF-seq結果

測序后共得到120 356個SLAF，其平均測序深度為26.97，Q30的比例為87.7%。共開發(fā)SSR標記2 651條，平均每45.4個SLAF有1個SSR。

2.2 基因組微衛(wèi)星的組成和基本特征

對巧家五針松基因組中1～6核苷酸重復完整型和復合型SSR進行查找分析，其部分SSR序列的信息見表1。

表1巧家五針松基因組SSR數(shù)據庫的部分結果

Table1PartialresultofSSRdataingenomeofP.squamata

Gene＿ID重復類型Repeattype重復單元RepeatmotifSSR長度LengthofSSR(bp)Marker251單核苷酸Mononucleotide(T)1010Marker4二核苷酸Dinucleotide(AT)612Marker1501三核苷酸Trinucleotide(AGA)515Marker1364四核苷酸Tetranucleotide(AAAT)520Marker399900五核苷酸Pentanucleotide(CTAGC)525Marker254911六核苷酸Hexanucleotide(TTTTAT)530Marker32308復合模式Compoundpattern(CATA)5(AT)935

對獲得的SSR進行密度分析，不同重復類型的長度不一，所得密度也存在較大差異。在所有的2 651個微衛(wèi)星中，單核苷酸重復類型最多，達1 603個，占總數(shù)的60.47%；其次是二核苷酸重復，共700個，占總數(shù)的26.41%；三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復所占比例依次降低，各重復單元的微衛(wèi)星豐度與重復單元的長度呈負相關；非完美型有94個，占總數(shù)的3.54%；復合模式僅7個，占總數(shù)的0.26%(表2)。

表2巧家五針松基因組中SSR重復單元的分布特征

Table2DistributioncharacteristicsofSSRrepeatmotifingenomeofP.squamata

重復類型Repeattype基序種數(shù)NumberofmotifsSSR數(shù)量NumberofSSR所占比例Proportion(%)單核苷酸Mononucleotide2160360．47二核苷酸Dinucleotide570026．41三核苷酸Trinucleotide211987．47四核苷酸Tetranucleotide13421．58五核苷酸Pentanucleotide440．15六核苷酸Hexanucleotide330．11非完美型Unperfectpattern94943．55復合模式Compoundpattern770．26合計Total1492651100

表3不同重復基元類型SSR數(shù)量、長度及比例

Table3Number,lengthandproportionofSSRswithdifferentrepeatmotifs

重復類型Repeattype重復基元Repeatmotif數(shù)量Number長度變化范圍Lengthrange(bp)平均長度Averagelength(bp)所占比例Proportion(%)單核苷酸MononucleotideA/T153710～2611．2057．98G/C6610～2211．422．49二核苷酸DinucletideAC/GT4112～4819．801．55AG/CT7312～4816．882．75AT/TA43812～3015．5716．52CA/TG7012～4216．802．64TC/GA7812～3815．852．94三核苷酸TrinucletideAAG/CTT1615～2416．860．60AAT/ATT3415～3018．091．28AGG/CCT215～1816．500．08ATG/CAT2415～2416．500．91AGA/TCT815～1815．380．30ACA/TGT71515．000．26ATA/TAT2315～2717．740．87ATC/GAT1015～2417．70．38TCA/TGA1615～2116．310．6TAA/TTA1915～2116．420．72GGA/TCC715～1815．430．26GAA/TTC1615～2115．750．6CAA/TTG815～2115．750．30CAG11515．000．04CGG11515．000．04CTA11515．000．04CTC118180．04GTG118180．04GTT118180．04TGC115150．04TGG115150．04四核苷酸TetranucletideAAAT/ATTT52020．000．19AGAA/TTCT220～2824．000．08ACAT/ATGT1720～3221．880．64CATA/TATG520～2823．200．19TAAA/TTTA32020．000．11TACA/TGTA32020．000．11AGTT12020．000．04ATAA12020．000．04ATAC13620．000．04ATCT12020．000．04GTTT12420．000．04TATT12020．000．04TGTT12020．000．04五核苷酸PentanucletideCCTAC12525．000．04CTAGC12525．000．04TATCT12525．000．04TCAAT12525．000．04六核苷酸HexanucletideAATTGT13030．000．04TTTTAT13030．000．04TTTTCT13030．000．04

2.3不同重復基元微衛(wèi)星序列長度分布及變異情況

巧家五針松SSR序列長度變化范圍是10～48 bp，平均長度為14.96 bp，二核苷酸重復長度變化范圍最大(12～48 bp)，其中以AC/GT和AG/CT長度變化范圍最大(12～48 bp)；單核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重復SSR長度變化范圍較小，分別為10～26,15～30和20～36 bp；五核苷酸和六核苷酸長度無變化。在所有重復基元中，所占比例最高的是A/T，達57.68%，其次為AT/TA，占總數(shù)的16.52%，再次為TC/GA，占2.94%，可見巧家五針松中所占比例較高的是富含A/T的基元。

對巧家五針松不同長度重復單元微衛(wèi)星的長度變異情況進行分析，在不同長度重復單元中，二核苷酸重復微衛(wèi)星長度變異程度最高，有17種不同微衛(wèi)星變化長度；單核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重復微衛(wèi)星長度變異程度依次降低；五核苷酸和六核苷酸重復微衛(wèi)星長度無變異(圖1)。每種重復類型都隨著重復長度的增加，微衛(wèi)星豐度呈現(xiàn)出遞減趨勢，即微衛(wèi)星長度越長，微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率越低。

圖1 巧家五針松基因組中含不同長度重復單元的微衛(wèi)星長度變異情況 餅圖每一扇區(qū)對應不同長度的微衛(wèi)星標注于所占比例上部括號內，若對應長度微衛(wèi)星頻率≤0.01,則一起合并在黑色扇區(qū)內。Fig.1 Length diversification of the microsatellites in genome of P.squamata Microsatellites in different lengths are demonstrated in separate slices. If the corresponding percentage≤0.01,slices were combined for percentages(black slices).

3 討論

巧家五針松通過全基因組的測序獲得大量SSR序列，達到2 651個，而且種類豐富，其中包括了單核苷酸至六核苷酸重復，以及非完美型和復合型重復。傳統(tǒng)的利用EST文庫、SAM、錨定PCR和微衛(wèi)星富集等方法開發(fā)出SSR標記[12～14]，覆蓋面較小，無法全面反映各物種微衛(wèi)星序列分布情況，而巧家五針松在全基因組范圍內搜索微衛(wèi)星序列，有助于今后對其各方面研究的開展。

在獲得的巧家五針松基因組所有微衛(wèi)星中，以單核苷酸重復類型最多，這與許多物種以二核苷酸和三核苷酸重復類型居多不同[15～16]。張晗等在谷子基因組中發(fā)現(xiàn)的2 872個SSR中，二核苷酸和三核苷酸重復所占比例達到63.41%和31.86%[17]；孔凡明等在一些松屬物種中獲得的SSR序列也以三核苷酸重復為主[18]。但是在杜仲基因組中，單核苷酸重復所占比例最高(54.34%)[19]，小麥中單核苷酸重復所占比例也最多[20]，這與巧家五針松的情況一致。通常認為，低級重復單元的大量存在暗示著該物種進化水平較高，而高級重復基元出現(xiàn)頻率高的物種具有較短的進化時間或較低的變異頻率[21～23]。巧家五針松以單核苷酸重復所占比例最多，可能預示著它具有較高的變異頻率或較久的進化歷史。已有研究認為巧家五針松與北美西部高山分布的刺果松(Pinusaristata)以及狐尾松(Pinusbalfouriana)有極密切的關系，被列入狐尾松亞組[24]，而狐尾松亞組的共同祖先至少在白堊紀末、第三紀初在亞洲和北美洲大陸分離以前就已經存在[25]，本研究結果或許在一定程度上證明了巧家五針松具有悠久的進化歷史。

微衛(wèi)星的分布在不同物種之間存在著較大的差異，微衛(wèi)星的突變率也不相同，并且物種本身堿基組成也是選擇的結果[26]。在巧家五針松的單核苷酸重復中以A/T重復基元出現(xiàn)的頻率居多，在其它重復類型中A/T出現(xiàn)頻率也顯著高于G/C，二核苷酸重復以AT/TA為主，三核苷酸重復中AAT/ATT所占比例最高，SSR序列顯示出顯著的堿基偏好性。在小麥和楊梅中，其偏好性則不同，以G/C為主[27～28]；在擬南芥和蘋果中呈現(xiàn)出對A/T的偏好[29～30]；與巧家五針松親緣關系較近的馬尾松在二堿基重復中也以AT/TA頻率最高，達72.92%[31]，這或許與不同物種中密碼子使用的偏好性有關。巧家五針松各重復基元中G/C的出現(xiàn)，可能會增加某些氨基酸，從而關聯(lián)于某些特定的功能，如抗逆性、轉錄調控和信號轉導[32～33]。

重復單元的重復次數(shù)不同所造成的多態(tài)性常表現(xiàn)為復等位性，在不同基因型間存在廣泛的多態(tài)性，這種多態(tài)性或起因于復制過程中的滑動[34]。巧家五針松二核苷酸重復微衛(wèi)星長度變異程度最高，有17種不同微衛(wèi)星變化長度,表明其獲得或失去重復單元的活躍程度高，具有較豐富的多態(tài)性。而該物種不同重復類型微衛(wèi)星長度越長，微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率越低，這可能與其分布地收縮，現(xiàn)存野生種群數(shù)量極少有關。因為微衛(wèi)星重復序列越長，基因越不穩(wěn)定，當物種受到強烈趨同選擇的壓力下，SSR序列富集在較短的序列范圍內[12]。

巧家五針松微衛(wèi)星序列特征的分析反映出獲得的微衛(wèi)星序列能夠滿足該物種的種群遺傳學研究，并可進一步為該物種的保護生物學研究提供資料。該研究獲取的巧家五針松微衛(wèi)星序列完整，由此開發(fā)獲得的SSR標記對于松屬植物及其它親緣關系較近物種的研究都具有一定的價值。

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Science Research Fund of Yunnan Provincial Education Department(2014Y569)；Special Fund for the Protection of Biological Diversity in Yunnan(2013-004)；Doctoral Program of Yunnan Forestry Technological College(KY(BS)201402)；Science Research Fund of Yunnan Provincial Education Department(2014Y571)

introduction：RUAN Zhen-Yuan(1983—),female,Doctor,lecturer, major is plant physiology and molecular biology.

date:2016-03-16

CharacterizationofMicrosatellitesinGenomeofPinussquamata,aCriticallyEndangeredSpeciesintheWorld

RUAN Zhen-Yuan1WANG Bing-Yi2*OUYANG Zhi-Qin3*LIAO Li-Bin2SU Teng-Wei1QIAO Lu1

(1.Department of Landscape Architecture,Yunnan Forestry Technologicl College,Kunming 650224；2.The Research Institute of Resource Insects,Chinese Academy of Forestry,Kunming 650224；3.Yunnan Institute of Environmental Science,Kunming 650034)

Pinussquamatais a critically endangered species in the world, therefore, developing simple sequence repeat(SSR) primers will facilitate the species genetic research and conservation. The complete genome sequence ofP.squamaiawas determined through Illumina genome analyzer, and 2 651 microsatellites were discovered by MISA software. Single nucleotide repeat number occupied the highest proportion of these microsatellites which may indicate a long evolution history ofP.squamata. Among different repeat types, A/T contents was significantly higher than G/C contents. In terms of distinct length repeat units, the length of dinucleotide repeat microsatellite varies with the highest degree. The length of SSRs with different repeat type was negatively correlated with frequency of occurrences. The available microsatellite sequences can satisfyP.squamaiapopulation genetics, and reveal the species bias and corresponding potential functions.

PinussquamataX.W.Li;genome;microsatellite

云南省教育廳科學研究基金項目(2014Y569)；云南省生物多樣性保護專項資金資助項目(2013-004)；云南林業(yè)職業(yè)技術學院博士基金項目(KY(BS)201402)；云南省教育廳科學研究基金項目(2014Y571)

阮楨媛(1983—)，女，博士，講師，主要從事植物生理與分子生物學研究。

* 通信作者：E-mail:wangbykm@gmail.com

2016-03-16

* Corresponding author：E-mail:wangbykm@gmail.com

S791.24

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.05.020