樟子松皰銹病重寄生菌的分離鑒定

鄧勛，張素華，宋小雙，馬曉乾，魏霞

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林保護(hù)研究所，黑龍江哈爾濱 150040;2.呼和浩特市森林病蟲(chóng)害防治檢疫站，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020)

樟子松皰銹病是二針?biāo)深愔Ω缮系闹饕『?，病原為松芍柱銹菌Cronartium flaccidum(Alb.et Schw.)Wint.，皰銹病感染率一般在10%左右，重病林分可達(dá)40%左右，對(duì)我國(guó)林業(yè)生態(tài)建設(shè)造成了嚴(yán)重的威脅［1］。松芍柱銹菌銹孢子傳播可侵染轉(zhuǎn)主寄主芍藥Paeonia lactiflora Pall.和赤芍P．obovata Maxim.，因此防治困難，并帶來(lái)一系列的環(huán)境問(wèn)題。眾多研究發(fā)現(xiàn)，重寄生菌對(duì)植物病原菌有著明顯的控制作用，是一類極具生防潛力的生物資源［2］，重寄生性也是多數(shù)生防菌的主要生防機(jī)理。重寄生菌的研究不僅具有理論意義，更有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文對(duì)松芍柱銹菌重寄生菌進(jìn)行了分離鑒定，并研究其對(duì)銹孢子的作用機(jī)理，為進(jìn)一步研制生防菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試劑 于2009年6月上旬在大興安嶺林科所實(shí)驗(yàn)基地加格達(dá)奇樟子松種子園隨機(jī)選取樟子松皰銹病發(fā)病植株，進(jìn)行銹孢子和感病枝干的采集。用手術(shù)刀片劃破銹孢子器，將銹孢子抖入滅菌的三角瓶中，4℃干燥保存;用手鋸將銹孢子器較多的感病枝干截成小段，放入牛皮紙袋中，剝?nèi)「胁≈Ω蓸?shù)皮放入已滅菌的三角瓶中。

組織DNA提取試劑盒、Taq酶、D2000 Marker購(gòu)自北京天根生化試劑公司，其它試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重寄生菌的分離鑒定

(1)在銹孢子上的分離:將銹孢子直接抖入PDA平板上，待銹孢子周圍長(zhǎng)出菌落后，進(jìn)行分離純化。

(2)在感病枝干上的分離:將感病枝干和病皮放在恒溫培養(yǎng)箱中，25℃、相對(duì)濕度80%保濕培養(yǎng)，待銹孢子器表面長(zhǎng)出菌絲，銹孢子器變白后，挑取少量菌絲放到PDA平板上，25℃恒溫箱中培養(yǎng)，3 d后長(zhǎng)出菌落，分離純化菌落。

(3)菌株鑒定方法:對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行形態(tài)鑒定，確定分類地位;通過(guò)PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA序列，將PCR產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，進(jìn)行序列提交，獲得基因登錄號(hào)。

1.2.2 重寄生菌的篩選

(1)菌株接種銹孢子堆 通過(guò)對(duì)分離的真菌進(jìn)行寄生能力測(cè)定來(lái)篩選重寄生菌，具體方法:將放有濾紙的培養(yǎng)皿滅菌，滴入無(wú)菌水使其濕潤(rùn)，在濾紙上抖入小堆銹孢子，將分離到的菌株直徑5 mm菌餅放到銹孢子堆中，25℃保濕培養(yǎng)，每2 d觀察1次，連續(xù)觀察6 d，以不接入菌塊的銹孢子堆作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。通過(guò)銹孢子堆顏色變化和接入菌株的菌落形成情況，判斷重寄生能力的高低，篩選重寄生菌，并計(jì)算銹孢子活力。

(2)供試菌株的再分離 從接種真菌后的銹孢子堆中挑取少量銹孢子置于PDA平板上，培養(yǎng)5 d后，觀察菌落情況，并與原始菌株進(jìn)行對(duì)比，每處理3次重復(fù)。

1.2.3 重寄生菌對(duì)銹孢子的破壞作用

(1)保濕后感病枝干和病皮銹孢子器的變化將采集得到的感病枝干和病皮進(jìn)行保濕(相對(duì)濕度80%)處理，20 d后，觀察銹孢子器變化，并挑取銹孢子在顯微鏡下觀察銹孢子的變化。

(2)重寄生菌對(duì)銹孢子的作用觀察 通過(guò)活體接種在銹孢子堆，顯微觀察銹孢子的變化，結(jié)合重寄生菌的作用機(jī)理，分析不同重寄生菌對(duì)銹孢子的破壞作用機(jī)理。

2 結(jié)果分析

2.1 重寄生菌的分離鑒定 從樟子松皰銹病的銹孢子和發(fā)病組織中分離得到45株真菌，通過(guò)形態(tài)鑒定和ITS序列測(cè)定，分離真菌屬于6屬9種，包括鏈格孢、木霉、鐮刀菌、毛霉、莖點(diǎn)霉和球殼菌等，不同屬的真菌出現(xiàn)頻率存在差異(表1)，優(yōu)勢(shì)類群包括鏈格孢菌、鐮刀菌和毛霉菌，多數(shù)都屬于腐生菌。

2.2 重寄生菌的篩選

2.2.1 通過(guò)接種銹孢子堆篩選重寄生菌 選用上述分離到的8株有代表性的真菌進(jìn)行接種(表1)，其中擬枝孢鐮刀菌Fusarium sporotrichioides Sherb.和深綠木霉Trichoderm atroviride重寄生能力最強(qiáng)，在6 d的保濕培養(yǎng)中，菌塊可以在孢子堆中生長(zhǎng)，并形成明顯的菌落。在菌落形成和延伸的過(guò)程中，銹孢子堆的顏色會(huì)逐漸由鮮黃色變?yōu)榘咨?。而其它菌雖有生長(zhǎng)，但是不能形成明顯的菌落，銹孢子堆的顏色也有變化，僅部分變白。對(duì)照在6 d的保濕培養(yǎng)中，顏色變化較小，銹孢子完整，顏色鮮艷，具有活力。在6 d的培養(yǎng)過(guò)程中，擬枝孢鐮刀菌和深綠木霉對(duì)銹孢子的殺傷較大，銹孢子的死亡率在85%以上，初步判斷擬枝孢鐮刀菌和深綠木霉具有重寄生能力，但需要通過(guò)回接來(lái)驗(yàn)證。

表1 接種后銹孢子堆顏色變化及銹孢子活力測(cè)定

2.2.2 重寄生菌的再分離 在變白的銹孢子堆上進(jìn)行再分離驗(yàn)證，其中擬枝孢鐮刀菌、深綠木霉可以在銹孢子堆中形成明顯菌落，并使銹孢子堆變白，銹孢子失活，回接后，也分離得到了原始菌株，進(jìn)一步驗(yàn)證了對(duì)銹孢子的重寄生作用，其他菌株的回接分離不到原始菌株，說(shuō)明銹孢子在采集過(guò)程中會(huì)混入雜菌，因此在分離的過(guò)程中，由于雜菌的生長(zhǎng)，原始菌株的作用不明顯。

2.3 重寄生菌對(duì)銹孢子的破壞作用 感病枝干和樹(shù)皮保濕大約20 d后，多數(shù)銹孢子器可以被寄生，上面著生白色、褐色等顏色的菌絲體，銹孢子堆由鮮黃色變成白色和淺黃色。挑取少量的銹孢子鏡檢，發(fā)現(xiàn)銹孢子出現(xiàn)了幾種變化:內(nèi)含物濃縮，銹孢子萎縮，變癟;銹孢子表面的疣脫落，變得透明;銹孢子破碎，失去原有形狀。這可能與不同的重寄生菌對(duì)樟子松皰銹病銹孢子的寄生作用機(jī)理不同所致。

為進(jìn)一步研究重寄生菌對(duì)銹孢子的破壞作用，通過(guò)銹孢子堆的接種、對(duì)銹孢子顯微結(jié)構(gòu)變化觀察，結(jié)果與病皮和病枝保濕培養(yǎng)后的結(jié)果一致，顯微結(jié)構(gòu)觀察銹孢子的變化也大致相同(圖1)。

圖1 不同的重寄生菌對(duì)銹孢子的破壞作用

非重寄生菌如毛霉，球殼菌等，接種后雖然菌絲也能生長(zhǎng)，但是顯微觀察，銹孢子外形完好，疣沒(méi)有脫落，排列緊密，細(xì)胞液沒(méi)有外溢;而重寄生菌接種后，銹孢子變化明顯，并且表現(xiàn)出幾個(gè)不同的類型，這與重寄生菌對(duì)銹孢子的作用機(jī)理有必然的聯(lián)系。重寄生菌的作用機(jī)理主要有:(1)通過(guò)分泌抑菌物質(zhì)如毒素、抗生素等，作用于寄主真菌的細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)及能量代謝，導(dǎo)致其生理失調(diào)最終使細(xì)胞死亡，胞內(nèi)物質(zhì)外泄，為寄生菌生長(zhǎng)提供養(yǎng)分。通過(guò)觀察鐮刀菌對(duì)銹孢子的作用發(fā)現(xiàn)，其菌絲、孢子等并未附著寄生在銹孢子表面，但是卻能使銹孢子死亡;顯微觀察表明，雖然銹孢子外表沒(méi)有受到明顯的破壞，疣狀突起多數(shù)沒(méi)有脫落，排列比較整齊，但是由于內(nèi)含物的消融外泄，導(dǎo)致了銹孢子外壁向內(nèi)凹陷;(2)重寄生菌通過(guò)形成附著胞吸附在銹孢子表面，沿著寄主菌體平行生長(zhǎng)或者螺旋生長(zhǎng)，通過(guò)分泌胞外酶如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、纖維素酶等分解細(xì)胞壁，穿透菌體吸取營(yíng)養(yǎng)，最后使銹孢子死亡。木霉接種在銹孢子堆幾天后，銹孢子堆變白，顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，木霉產(chǎn)生大量孢子，吸附在銹孢子表面，通過(guò)寄生作用獲得營(yíng)養(yǎng)，而銹孢子的疣狀突起大量脫落，孢子變得透明，或者孢子破碎，最后死亡，這些都說(shuō)明不同的重寄生菌對(duì)寄主的作用機(jī)理不同，相互配合，互不干擾，這與前人研究得出的重寄生菌作用機(jī)理結(jié)論相同。

3 小結(jié)

生物防治是有效控制林木病害的手段，樟子松皰銹病是樟子松的重要病害，由于大面積的發(fā)生，造成了較大經(jīng)濟(jì)損失，目前的防治主要以剪除病枝、加強(qiáng)檢疫等措施為主，沒(méi)有有效的控制手段。生態(tài)系統(tǒng)中各種因素相互制約，從而維持了一個(gè)穩(wěn)定的系統(tǒng)，銹菌的生物防治是利用自然界生物之間的重寄生現(xiàn)象(即一種真菌寄生在另一種真菌上)，來(lái)控制有害生物的群體數(shù)量，達(dá)到抑制病害發(fā)生的目的。楊艷紅對(duì)五針?biāo)砂掍P病重寄生菌進(jìn)行了分離鑒定，篩選得到多株重寄生菌，并在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)茶藨子柱銹菌起到很好的控制作用［3］。

通過(guò)分離篩選樟子松皰銹病重寄生菌，實(shí)現(xiàn)以菌抑菌的生物防治是有效的控制樟子松皰銹病的手段［4］。在首次報(bào)道了澳大利亞的楊樹(shù)Populus×euroamericana銹病Melampsora larici-populina夏孢子上銹菌重寄生菌極細(xì)枝孢 Cladosporium tenuissimum Cooke后［5］，有關(guān)銹病重寄生菌陸續(xù)報(bào)道，研究范圍涉及到了寄生菌的分離鑒定、次生代謝產(chǎn)物的作用方式等多個(gè)方面［6-8］，并在實(shí)際應(yīng)用中有效控制了銹病的發(fā)生［9］。本研究通過(guò)分離篩選，得到了2株樟子松皰銹病病原菌的重寄生菌，分別是擬枝孢鐮刀菌和深綠木霉。該重寄生菌對(duì)銹孢子有幾種不同的作用方式，其中擬枝孢鐮刀菌通過(guò)分泌毒素作用于寄主真菌的細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，殺死寄主，使細(xì)胞液外泄，從而提供其生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分;而深綠木霉通過(guò)纏繞寄生在銹孢子上，吸取養(yǎng)分，最后使寄主死亡。重寄生菌的寄生能力必須通過(guò)野外防治實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，本研究?jī)H為進(jìn)一步研制生防菌提供理論依據(jù)。

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