PTSD大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

王 芳

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是指受到親身經(jīng)歷或目睹的異乎尋常的威脅性、災(zāi)難性事件所致的心理創(chuàng)傷，導(dǎo)致出現(xiàn)長(zhǎng)期持續(xù)性精神障礙［1］。在競(jìng)爭(zhēng)日益激烈的現(xiàn)代社會(huì)，應(yīng)激事件日趨增多，PTSD的發(fā)生呈明顯上升趨勢(shì)，對(duì)PTSD的研究，可有效降低應(yīng)激人群PTSD的發(fā)生，促進(jìn)應(yīng)激人群的身心健康。反復(fù)發(fā)生的闖入性體驗(yàn)的病理性重現(xiàn)和不自主地反復(fù)回想是PTSD最具特征性的癥狀，關(guān)于這一病理性記憶增強(qiáng)的神經(jīng)和分子機(jī)制目前尚不明確。PTSD除具有一般精神疾病癥狀外，其患者血清皮質(zhì)醇往往處于較低水平［2］。本研究采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，測(cè)定大鼠行為學(xué)改變和血清皮質(zhì)醇濃度，驗(yàn)證PTSD模型的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要儀器設(shè)備試劑

成年雄性Wistar大鼠20只，體重160±20g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物在用于實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1w。Morris水迷宮，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光法測(cè)定試劑盒，南京建成生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PTSD模型的建立 隨機(jī)將大鼠分為對(duì)照組(10只)和模型組(10只)。采用SPS方法建立PTSD模型:在適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)3次的不同刺激，分別為:禁錮2h、強(qiáng)迫性游水20min(水深40cm，水溫25℃)和乙醚麻醉至大鼠意識(shí)喪失，其中強(qiáng)迫游泳和乙醚麻醉間隔15min。麻醉后將大鼠置于通風(fēng)處至自然蘇醒，放回飼養(yǎng)籠，無(wú)干擾喂養(yǎng)，常規(guī)飲食。

1.2.2 高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)實(shí)驗(yàn)OF實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行EMP實(shí)驗(yàn)。將大鼠置于高架十字迷宮中央?yún)^(qū)，頭朝開臂。通過(guò)上方的攝像機(jī)記錄5min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。每只大鼠測(cè)試完畢后徹底清理迷宮。測(cè)量開臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比。

1.2.3 水迷宮(Morris water mace，MWM)實(shí)驗(yàn) EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)，水溫24℃。首先進(jìn)行獲得性訓(xùn)練4d，于5d時(shí)進(jìn)行的MWM測(cè)試，前4d僅用于對(duì)動(dòng)物的訓(xùn)練。取d5的測(cè)試成績(jī)作為動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。

1.2.4 恐懼記憶的行為測(cè)定(僵立行為測(cè)定) 另取兩組大鼠各5只，于造模7d后，放入游泳用的玻璃缸內(nèi)，測(cè)4min僵立行為。每10s測(cè)1次，表現(xiàn)為僵立行為為陽(yáng)性，所得陽(yáng)性次數(shù)之和占總次數(shù)的百分比為僵立時(shí)間百分比。

1.2.5 血清皮質(zhì)醇濃度監(jiān)測(cè) 僵立行為測(cè)定完成后，經(jīng)大鼠心采血3～5ml，3000r/min離心10min，收集血清。用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清皮質(zhì)醇濃度。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料用平表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EMP結(jié)果表明，大鼠活動(dòng)符合大鼠趨暗的自然屬性，即大鼠趨向于在光線暗處活動(dòng)。大鼠在閉臂內(nèi)活動(dòng)時(shí)間和路程顯著多于開臂。隨著大鼠對(duì)環(huán)境的逐漸適應(yīng)，大鼠向開臂內(nèi)的探究行為逐漸增多。模型組和對(duì)照組大鼠在開臂內(nèi)停留時(shí)間所占總臂內(nèi)停留時(shí)間比分別為11.9±1.3和18.7±1.7，模型組顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.837，P＜0.01)。模型組和對(duì)照組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)占總進(jìn)臂次數(shù)的百分比分別為 21.3 ±2.2 和37.8 ±2.9，模型組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.295，P＜0.01)。

2.2 MWM 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照組與模型組大鼠平均逃避潛伏期分別為5.63s±1.06s、20.76s±3.24s，模型組顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.932，P ＜0.01)

2.3 僵立行為測(cè)定結(jié)果

模型組大鼠再次放入玻璃缸中后(重新面臨恐懼情景時(shí))，大鼠表現(xiàn)為明顯的僵立行為:活動(dòng)明顯減少，主要表現(xiàn)為刻板的蹲伏行為，僅頭部有輕微的轉(zhuǎn)動(dòng)，背部拱起。同時(shí)大鼠還表現(xiàn)出全身情緒喚起的其他表現(xiàn)(例如可見(jiàn)大鼠全身毛發(fā)豎立)。對(duì)照組大鼠重新面臨恐懼情景時(shí)，行為模式與模型組顯然不同。表現(xiàn)為自由運(yùn)動(dòng)，出現(xiàn)探究、理毛等行為。分析結(jié)果顯示，對(duì)照組僵立行為百分比為12.5±4.2，模型組為60.0 ±7.6，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.275，P ＜0.01)。

2.4 血清皮質(zhì)酮濃度

對(duì)照組與模型組大鼠血清皮質(zhì)酮濃度分別為1.26μg/dl±0.17μg/dl和 0.54 μg/dl± 0.13μg/dl，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.34，P ＜0.01)。

3 討論

PTSD的基礎(chǔ)研究應(yīng)用嚙齒類動(dòng)物做了一些動(dòng)物模型，包括海馬驚厥閾下電刺激模型、單次強(qiáng)烈應(yīng)激模型(包括電擊、溺水傷害、外傷、應(yīng)激-再應(yīng)激、捕食者應(yīng)激等單獨(dú)使用以及多種應(yīng)激序列使用等)、使用外源性皮質(zhì)激素等［3～5］。其中強(qiáng)烈應(yīng)激模型更能模擬人類PTSD。SPS是一種PTSD動(dòng)物模型，能表現(xiàn)PTSD的臨床癥狀和神經(jīng)內(nèi)分泌改變，是國(guó)際公認(rèn)的 PTSD 動(dòng)物模型［6，7］。Liberzon等人報(bào)道，SPS小鼠表現(xiàn)出于PTSD患者同樣的HPA軸的抑制現(xiàn)象［8］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、僵立行為實(shí)驗(yàn)等，驗(yàn)證SPS大鼠的行為學(xué)改變。EMP實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行焦慮研究的較新方法。其原理是嚙齒類動(dòng)物有探究行為，放入高架十字迷宮后會(huì)主動(dòng)探究開臂，但又懼怕開臂中高懸敞開的環(huán)境。動(dòng)物出現(xiàn)焦慮時(shí)，開臂探究活動(dòng)減少。本研究EMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠在閉臂內(nèi)活動(dòng)時(shí)間和路程顯著多于開臂。隨著大鼠對(duì)環(huán)境的逐漸適應(yīng)，大鼠向開臂內(nèi)的探究行為逐漸增多。模型組大鼠在開臂內(nèi)停留時(shí)間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比顯著低于對(duì)照組。結(jié)果和OF實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，均提示SPS能增加大鼠的焦慮狀態(tài)。MWM實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺(tái)的一種實(shí)驗(yàn)，主要用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置覺(jué)和方向覺(jué)的學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明SPS應(yīng)激能損傷大鼠的空間記憶能力。僵立行為是一種普遍見(jiàn)于嚙齒類動(dòng)物的防御行為，是大鼠在負(fù)性刺激無(wú)法避免時(shí)的一種防御反應(yīng)，表現(xiàn)為刻板的蹲伏行為，全身除呼吸外其余肌肉運(yùn)動(dòng)均消失。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠放入玻璃缸后，表現(xiàn)為典型的僵立行為，即刻板的蹲伏行為、僅頭部有輕微轉(zhuǎn)動(dòng)、背部拱起、全身毛發(fā)豎立。對(duì)照組則表現(xiàn)自由活動(dòng)，出現(xiàn)探究、理毛等行為。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示模型組僵立行為百分比顯著高于對(duì)照組。表明SPS可使大鼠獲得對(duì)恐懼情景的記憶，說(shuō)明該模型較好地模擬了PTSD的核心癥狀——病理性恐懼記憶增強(qiáng)。研究表明，PTSD患者血清皮質(zhì)醇往往處于較低水平［2］，這是PTSD的一個(gè)主要的神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了大鼠血清皮質(zhì)酮濃度，結(jié)果表明模型組血清皮質(zhì)酮濃度顯著低于對(duì)照組。

由此可見(jiàn)，SPS應(yīng)激能誘發(fā)大鼠活動(dòng)習(xí)性明顯改變，獲得對(duì)恐怖情景的記憶，并且有顯著的神經(jīng)內(nèi)分泌改變。這些基本符合PTSD主要的臨床表現(xiàn)，說(shuō)明模型復(fù)制成功。

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