肌萎縮側(cè)索硬化中病理性TDP-43蛋白研究進展

馮俊強， 張立志， 楊 光綜述， 江新梅審校

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病(neurological degenerative diseases)。變性疾病大部分是異質(zhì)性的，而基因突變造成神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞內(nèi)的異常蛋白表達和聚集卻常常是共性的。如阿爾茨海默病時的β樣淀粉樣蛋白變性及微管相關蛋白(tau)病理即為老年斑及神經(jīng)原纖維纏結主要組成成分即淀粉樣原纖維蛋白聚集物［1］，路易體(Lewy)中的a-共核蛋白也是構成帕金森病的病理基礎。近來神經(jīng)病理學發(fā)現(xiàn):在額葉變性時出現(xiàn)的泛素包涵體(ubiquitin inclusion，UBI)［2］，在 ALS 中也存在［3］。這些異常的蛋白聚集物(包涵體)已經(jīng)成為了疾病的特異性標志，甚至也是疾病的成因。

2006年，Virginia Lee等發(fā)現(xiàn):在肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)及額顳葉癡呆(FTLD)患者的病理性包涵體中檢測到TDP-43(trans active response DNA bind ing protein gene分子量為43千道爾頓的具有免疫活性/反應性的DNA結合蛋白)。病理性的TDP-43是一種高磷酸化泛素，其羧基末端只影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括海馬、大腦皮質(zhì)和脊髓。常見于各種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾?。?］。而TDP-43發(fā)現(xiàn)于1995年，該蛋白曾是囊腫性纖維化和HIV領域的研究內(nèi)容。

1 TDP-43的概念及生理功能

TDP-43是由414個氨基酸構成的核蛋白，是由1號常染色體的TARDBP(trans active response DNA-binding protein gene)基因編碼的。因其分子量為43 kDa，故被命名為TDP-43。最初發(fā)現(xiàn)其在HIV病毒體內(nèi)的基因組所復制，是一種與TAR-DNA相結合的起到抑制轉(zhuǎn)錄的細胞因子［5］。在所有組織中(包括腦組織)呈高度保守及泛素化表達［6，7］。該蛋白含有兩個RNA識別序列，在C末端富含甘氨酸。此蛋白是囊性纖維病跨膜調(diào)節(jié)因子及載脂蛋白A2調(diào)節(jié)因子復合物［8］，在TDP-43中富含甘氨酸的C末端的區(qū)域發(fā)揮針對外顯子的跳躍及拼接的抑制活性［9，10］，而且在 TDP-43中富含甘氨酸的C末端可與多種不同類別的核蛋白即異質(zhì)性的核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)進行結合，并與mRNA生成有關［10］。最近又發(fā)現(xiàn)，在小鼠的TDP-43可與其臨近的SP-10基因(acrosomal vesicle protein 1)啟動子結合，參與并調(diào)節(jié)精子的生成［11］。另外，在發(fā)生ALS患者的殘存運動神經(jīng)元中TDP-43可以在其核小體中起到支架作用［12］。正常情況下，TDP-43在胞漿內(nèi)合成后轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒於€(wěn)定的多肽，成熟的TDP-43將會有大部分轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，與TAR DNA結合，發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接、參與mRNA的修飾等作用，并起到穩(wěn)定mRNA的作用，而留在胞漿中的TDP-43含量甚微。在生理狀態(tài)下，TDP-43多肽經(jīng)歷翻譯后修飾，包括磷酸化和泛素化，在發(fā)揮完其生理功能后便通過蛋白酶體通路被降解。

2 ALS中的TDP-43

2.1 TDP-43與肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)Virginia Lee等研究證明:在對泛素陽性 FTLD［13～17］和 ALS［15，18，19］等疾病時包括神經(jīng)元胞漿、變性軸突、神經(jīng)細胞核內(nèi)包涵體等的研究發(fā)現(xiàn)，其中均含有異常的TDP-43，這些TDP-43蛋白在胞漿中異常聚集(正常情況下胞漿中含量甚微)，形成類似球形的包涵體，對其進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)其是一種特異且敏感的檢測指標。需要指出，在健康的神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的生理性TDP-43也可以被檢測出，而在病理狀態(tài)下，正常神經(jīng)細胞核內(nèi)的TDP-43的表達量顯著減少(生理狀態(tài)下僅在核內(nèi)發(fā)揮作用)，而轉(zhuǎn)為胞漿中異常聚集。由于原有的效應含量明顯下降，所以在ALS時TDP-43的正常生理功能極有可能是被大大的減損了。需要指出，這些病理性的包涵體同樣也呈現(xiàn)泛素化陽性，即在ALS及諸多亞型中的病理性包涵體可同時表現(xiàn)為泛素化陽性及TPD-43陽性。另外，在ALS及其諸多亞型病變中早期無法進行鑒定時，也可以通過對其膠質(zhì)細胞中的包涵體進行TDP-43的免疫組化技術進行鑒定，以幫助早期診斷病變［15，19，20］。在伴或不伴有癡呆的ALS患者的受累腦組織神經(jīng)元胞漿及神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)檢測到的TDP-43包涵體多呈類球形。大部分ALS病例為散發(fā)型病例，僅有大約10%左右為家族型。家族型的ALS在發(fā)病的病因上是呈現(xiàn)異質(zhì)性的，其中約20%是SOD1突變造成的，為常染色體顯性遺傳［21］。由于在非超氧化物歧化酶基因突變的家族性ALS的患者中，其病理性TDP-43蛋白是明確存在的;而在以SOD1基因突變?yōu)椴∫虻囊恍┗颊咧?，其UBI(泛素陽性包涵體)中沒有檢測到 TDP-43［18，19］，這與SOD1基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中沒有檢測到TDP-43這一結論是相符合的［22］，所以有人認為TARDBP突變導致的病理性的TDP-43是非超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變的家族型ALS的候補基因。另外，在西太平洋島嶼中的查莫羅人所患的關島型ALS及以大量tau蛋白為病理表現(xiàn)的帕金森-癡呆癥的患者脊髓中檢測到了TDP-43［23］，在這些患者中的大腦皮質(zhì)及邊緣系統(tǒng)中也檢測到了TDP-43［23，24］。這也進一步提示了病理性TDP-43途徑是完全不同于SOD1基因突變的一類新的發(fā)病途徑，當然，這一結論也尚存爭議［25］。

2.2 ALS中的TDP-43病理表現(xiàn) Piao等［26］對102例ALS剖檢:發(fā)現(xiàn)全部病例的脊髓前前角細胞胞漿中均有包涵體。針對該包涵體進行TDP-43免疫組化染色發(fā)現(xiàn)其全部呈現(xiàn)陽性。日本弘前大學神經(jīng)病理學者［27］對20例ALS患者(其中6例為伴癡呆的ALS，即ALS-D)的皮質(zhì)、皮質(zhì)下、新紋狀體、邊緣系統(tǒng)、顳葉、脊髓等神經(jīng)組織進行了TDP-43的免疫組化研究，其結果發(fā)現(xiàn):在患者的運動神經(jīng)元、額顳葉淺部皮質(zhì)、新紋狀體、蒼白球、黑質(zhì)、丘腦等處均有泛素陽性包涵體，其TDP-43也呈陽性反應。在針對皮質(zhì)、新紋狀體、黑質(zhì)等的神經(jīng)組織進行的HE染色、單/多克隆TDP-43抗體雙重免疫組化染色發(fā)現(xiàn):(1)新紋狀體變性程度較皮質(zhì)、黑質(zhì)的神經(jīng)變性輕微;(2)顳葉、黑質(zhì)的神經(jīng)元丟失多見于伴有癡呆的ALS(ALS-D)，新紋狀體神經(jīng)元丟失并不顯著;(3)所有神經(jīng)組織包括神經(jīng)膠質(zhì)細胞均呈TDP-43陽性反應，其中尤以多克隆TDP-43抗體的陽性反應比例高，反應陽性的包涵體位于胞漿中。(4)在ALS-D患者中其TDP-43陽性率高于普通型ALS。(5)包涵體形態(tài)分為:大神經(jīng)元中的枝芽狀(見圖1)及多形狀兩種包涵體(見圖2)，小神經(jīng)元中的新月形(見圖3)或環(huán)狀(見圖4)兩種包涵體。而其中大神經(jīng)元中的枝芽狀包涵體僅呈泛素陽性反應，TDP-43呈陰性。以上包涵體圍繞細胞核分布或在胞核附近分布。(6)神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)的TDP-43包涵體仍然呈類似表現(xiàn)(見圖5～圖7)。

圖1 新紋狀體大神經(jīng)元泛素陽性包涵體(標尺5μm)

圖2 新紋狀體大神經(jīng)元TDP-43包涵體(標尺5μm)

圖3 新紋狀體小神經(jīng)元TDP-43包涵體(標尺5μm)

圖4 新紋狀體小神經(jīng)元TDP-43包涵體(標尺5μm)

圖5 新紋狀體神經(jīng)膠質(zhì)細胞TDP-43包涵體(標尺5μm)

圖6 新紋狀體神經(jīng)膠質(zhì)細胞TDP-43包涵體(標尺5μm)

圖7 新紋狀體神經(jīng)膠質(zhì)細胞TDP-43包涵體(標尺5μm)

2.3 病理性TDP-43的分子生物學 由于在伴癡呆的ALS患者中發(fā)現(xiàn)了病理性的TDP-43，并且存在于ALS和FTLD-U時的泛素陽性包涵體(UBI)中，TDP-43是二者共有的、相互交織的，在造成神經(jīng)變性方面起到了同一角色作用。時至今日，TARDBP基因變異已經(jīng)引人關注［28］。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TDP-43的功能是抑制轉(zhuǎn)錄及剪接控制因子［5～7］，但是，這種蛋白裝置是如何引起神經(jīng)系統(tǒng)變性的，目前還尚不清楚。至2008年，被鑒定出的TARDBP基因的突變體有多達15種，該基因編碼TDP-43，與FTLD-U、家族性和散發(fā)ALS患者中神經(jīng)組織異常蛋白增長有關［29］。諸如:密碼子290的甘氨酸(Gly)被丙氨酸(Ala)取代和密碼子298的甘氨酸(Gly)被絲氨酸(Ser)取代，而這一區(qū)域是TDP-43中富含甘氨酸的區(qū)域，此區(qū)恰恰具有調(diào)控基因表達和調(diào)節(jié)核蛋白之間的作用功能。又如TARDBP基因外顯子6的突變，密碼子315的丙氨酸(Ala)被蘇氨酸(Thr)替代、密碼子337的甲硫氨酸(Met)被纈氨酸(Val)替代，這種病變在兩個家系中被鑒定出來，另外，在一些散發(fā)ALS患者中的331號密碼子谷氨酰胺(Gln)被賴氨酸(Lys)替代、密碼子294甘氨酸(Gly)被丙氨酸(Ala)替代［30］。基于此，就形成了一些假說。由于氨基酸被異常的替換，原有結構的穩(wěn)定性遭到破壞或功能發(fā)生錯誤改變等，使得在包涵體中的TDP-43多價螯合，發(fā)生功能缺失，所以造成了轉(zhuǎn)錄起始階段的mRNA出現(xiàn)了異常轉(zhuǎn)錄和拼接紊亂。正常情況下TDP-43是一種穩(wěn)定的低分子量的神經(jīng)微絲mRNA結合蛋白，與3’UTR(不翻譯區(qū))相互作用［31］，而在ALS患者中，發(fā)現(xiàn)其活性丟失，成為了不穩(wěn)定的低分子量神經(jīng)微絲mRNA結合蛋白，其亞基上的化學性質(zhì)發(fā)生改變，造成了神經(jīng)微絲的聚集而發(fā)病。另外，TDP-43的多價螯合，也會導致運動神經(jīng)元存活基因(SMN)及核內(nèi)不均一核糖核蛋白(hnRNP)在細胞內(nèi)的正常分布發(fā)生改變，但是這種表達的改變及hnRNP的翻譯后修飾的改變在FTLD-U和ALS中并沒有被觀察到，并且在UBI中也沒有檢測到hnRNP［32］。此外，包涵體中TDP-43與剪接控制功能有關的C末端發(fā)生聚集后，使其正常的生物學活性發(fā)生紊亂，也會引起發(fā)病，此過程被認為毒性獲得功能。另外也有人認為PGRN基因編碼TDP-43的配體蛋白，與 TDP-43的細胞核轉(zhuǎn)運有關［33］。在PGRN的功能失調(diào)或異常就可導致TDP-43的異常分布。最后，由于TDP-43的異常磷酸化，將導致其信號轉(zhuǎn)導功能的斷裂或直接造成TDP-43自身的運輸障礙，因此引發(fā)神經(jīng)功能障礙。目前，由于鼠模型的建立及細胞培養(yǎng)技術的進步，正逐步驗證上訴假說并闡明TDP-43在ALS及FTLD-U的發(fā)病機制中所起的作用。

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