低氧對小鼠骨骼肌離體線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔功能的影響

彭艷艷，孫麗娜，宋菁，金露，王小同

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 腦科、康復(fù)中心，浙江 溫州 325027）

低氧是一種常見的應(yīng)激，可引起機(jī)體結(jié)構(gòu)及功能的改變，其結(jié)果隨著低氧的程度、持續(xù)時間、機(jī)體反應(yīng)性的不同而異。低氧可廣泛影響機(jī)體的多個系統(tǒng)，包括神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸循環(huán)系統(tǒng)和肌肉骨骼系統(tǒng)等。骨骼肌作為人體最大的組織，為機(jī)體的活動提供動力。低氧可引起機(jī)體低氧應(yīng)激，從而導(dǎo)致骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的變化[1-3]。線粒體（mitochondria）作為機(jī)體的“能量工廠”，是機(jī)體利用氧進(jìn)行呼吸功能和生成ATP的重要細(xì)胞器。低氧應(yīng)激可引起線粒體功能障礙[4]。同時線粒體也與細(xì)胞凋亡和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5]。本實驗旨在通過利用低氧導(dǎo)致小鼠骨骼肌離體線粒體低氧的模型，探討低氧對小鼠骨骼肌離體線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）功能的影響。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 SPF級C57BL/6雄性小鼠32只（由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），體質(zhì)量20～28 g，7～9周齡，按隨機(jī)數(shù)字表法分為低氧組和常氧組，每組16只。

1.2 試劑與儀器 線粒體分離試劑盒購自pierce公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天，小鼠CytC ELISA法檢測試劑盒、純化線粒體凍存液和GENMED純化線粒體膜通道孔比色法檢測試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、谷胱甘肽（GSH）測試盒、微量丙二醛（MDA）測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司，連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）為國產(chǎn)分析純；TECNAI10透射電子顯微鏡（PHILIPS公司），ALLEGRA-64R臺式高速冷凍離心機(jī)（美國BECKMAN公司），熒光分光光度計，MD連續(xù)波長酶標(biāo)儀（美國），AVL-COMPACT3型血?dú)夥治鰞x（瑞士AVL公司）。

1.3 小鼠骨骼肌離體線粒體低氧模型的建立 提取線粒體后，低氧組將0.5 mL的線粒體懸液加入2 mL的密閉容器中，保持37 ℃并向內(nèi)通入100%氮?dú)饧把跚宄齽㎞a2S2O40.5 mmol·L-1致PO2測不出來，保持30 min。常氧組：線粒體懸液置于空氣中，其他條件同低氧組。

1.4 取材和檢測方法

1.4.1 小鼠骨骼肌線粒體的提取：小鼠直接用頸椎脫臼法處死，分離后肢股四頭肌，立即放入4 ℃預(yù)冷的PBS液沖洗2次，仔細(xì)去除PBS，將組織剪碎后加800μL PBS液，玻璃勻漿器冰上研磨后1000×g，4 ℃離心3 min，棄上清液，沉淀物加入800μL LBSA/A液，漩渦振蕩5 s（中速），冰上孵育最長2 min，再加入10μL B液，漩渦振蕩5 s（高速），冰上孵育5 min，并且每分鐘高速振蕩1次，后再加入800μL C液，倒置混勻，不可振蕩。700×g，4 ℃離心10 min后棄沉淀將上清轉(zhuǎn)移到2 mL管中，12000×g，4 ℃離心15 min，棄上清液，保留沉淀，在沉淀中加入500μL Wash Buffer，12000×g，4 ℃離心5 min后棄上清液，得到線粒體沉淀，在沉淀中加入200μL線粒體凍存液制成線粒體懸液。整個提取過程均在冰浴中（0～4 ℃）進(jìn)行，提取的線粒體冰上保存，當(dāng)天檢測指標(biāo)。

1.4.2 線粒體蛋白含量測定：采用BCA法。

1.4.3 骨骼肌線粒體膜電位測定：取線粒體懸液50μL加入現(xiàn)配的1 mL JC-1染液中，再加入2 mL蒸餾水，在激發(fā)波485 nm，散發(fā)波590 nm條件下用熒光分光光度計測定反映線粒體膜電位的相對熒光單位（RFU)。JC-1染液的配制參照上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒說明書操作。

1.4.4 MPTP開放狀態(tài)檢測：取線粒體懸液70μL加入到96孔板的對應(yīng)孔里，再加入170μL GENMED緩沖液（Reagent A)，混勻，即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀在波長540 nm條件下讀數(shù)，觀察MPTP開放狀態(tài)。

1.4.5 線粒體CytC測定：造模后的線粒體懸液于10000×g，4 ℃，離心10 min，取上清檢測CytC具體操作見說明書。

1.4.6 SOD、GSH和MDA測定：根據(jù)蛋白定量結(jié)果取線粒體懸液適量，再用線粒體緩沖液補(bǔ)足至500 μL，玻璃勻漿器冰上研磨5 min破膜，10000×g 4 ℃，離心10 min， 取上清檢測 SOD活性、GSH和MDA含量（具體按照南京建成提供的說明書操作）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 正態(tài)性檢驗采用shapirowilk檢驗，方差齊性采用levene檢驗，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌MPTP開放狀態(tài)測定 以待測樣本的吸光值比值來代表離體線粒體MPTP的開放狀態(tài)，吸光值越低，表示MPTP開放增加。與常氧組比較，低氧組骨骼肌線粒體的吸光值比值明顯降低，提示低氧組MPTP開放增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）見表1。

表1 線粒體膜通道孔開放、線粒體膜電位和CytC含量

2.2 線粒體膜電位測定 與常氧組相比，熒光分光光度計的定量測量結(jié)果提示低氧組線粒體膜電位明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1 2.3 線粒體釋放的CytC含量測定 與常氧組相比低氧組線粒體釋放的CytC含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

2.4 線粒體SOD活性和GSH、MDA含量測定 和常氧組相比，低氧組的線粒體SOD活性明顯降低，GSH含量明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2。

表2 SOD活性和GSH、MDA含量

3 討論

線粒體在細(xì)胞的正常生命活動和細(xì)胞死亡的過程中發(fā)揮著重要的作用，大多數(shù)的真核生物利用線粒體通過氧化磷酸化作用合成ATP，為機(jī)體各種生命活動提供能量。線粒體的正常功能與線粒體膜電位（mitochondrial transmembrane potential，Δ Ψm）有關(guān)，線粒體內(nèi)外膜物質(zhì)平衡依賴于線粒體的膜電位正常[6]。線粒體膜通透性（permeability transition，PT）改變可以引起ΔΨm的下降，而PT由MPTP所調(diào)控。MPTP是一種跨膜蛋白孔道，是由位于線粒體內(nèi)膜和外膜上的多種蛋白組成的蛋白復(fù)合體。正常生理條件下，MPTP處于關(guān)閉狀態(tài)，線粒體內(nèi)膜除對一些選擇性的代謝底物和離子外，對其他物質(zhì)都沒有通透性。然而在低氧、缺血再灌注損傷、鈣超載等應(yīng)激條件下，MPTP開放，通透性增加，內(nèi)膜外的小分子物質(zhì)大量進(jìn)入內(nèi)膜，使基質(zhì)內(nèi)的滲透壓增大，又進(jìn)一步促進(jìn)小分子物質(zhì)不斷進(jìn)入內(nèi)膜，導(dǎo)致線粒體的腫脹，外膜破裂，從而釋放存在于內(nèi)外膜間的CytC和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）等凋亡蛋白，導(dǎo)致線粒體損傷和功能障礙[7-9]。Ca2+、氧化應(yīng)激、無極磷酸鹽、pH值增大等可以促進(jìn)MPTP的開放，而Mg2+、環(huán)孢素A（CsA）、pH值降低、米帕林、狄布卡因可以抑制MPTP的開放[10]。MPTP開放的結(jié)果取決于開放的程度和時間，嚴(yán)重者可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[11]。

我們的先期實驗發(fā)現(xiàn)慢性低氧高二氧化碳血癥可以導(dǎo)致骨骼肌纖維萎縮，肌細(xì)胞線粒體增多并伴有線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的明顯損害[12]，凋亡可能部分參與了慢性低氧高二氧化碳引起的這種骨骼肌萎縮[13]。同時，我們還發(fā)現(xiàn)慢性低氧高二氧化碳條件下小鼠大腦線粒體能量生成障礙、COXI和III活性受到抑制，SOD活性、GSH含量顯著降低，推測線粒體的功能障礙可能和氧化應(yīng)激有關(guān)[14]。本實驗采用離體的線粒體低氧模型，可以直接定位觀察低氧對線粒體功能的損害。實驗結(jié)果為低氧組MPTP的開放增加，線粒體膜電位下降明顯，CytC釋放增多，SOD活性、GSH含量顯著降低，MDA含量明顯升高。以上結(jié)果在某種程度上支持我們先期的實驗結(jié)論。

線粒體是產(chǎn)生內(nèi)源性自由基的主要場所，同時也是自由基攻擊的靶部位[15]。本實驗中MPTP開放和膜電位的下降，可能與自由基引起的損傷有關(guān)。與常氧組相比，低氧組小鼠骨骼肌離體線粒體中SOD活性、GSH含量顯著降低，MDA含量明顯升高。SOD和GSH是機(jī)體兩種主要的自由基清除酶，其活性可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力。GSH還是重要的保護(hù)因子，可以保護(hù)生物膜和生物大分子免受自由基的攻擊。

氧自由基清除不足可以抑制SOD的活性，同時氧自由基還可以作用于生物膜中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）引起脂質(zhì)過氧化，并形成脂質(zhì)過氧化物如MDA。線粒體產(chǎn)生ROS越多，對膜脂質(zhì)攻擊作用越強(qiáng)，生成的MDA也越多。MDA含量可以反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。在本實驗中，低氧組的小鼠骨骼肌離體線粒體內(nèi)MDA含量明顯升高，表明低氧后線粒體內(nèi)氧自由基生成增加和組織損傷。因此，SOD活性、GSH含量下降，MDA含量增加，與氧化應(yīng)激有關(guān)。這可能是MPTP開放增加，線粒體膜電位下降， CytC釋放增加的重要原因。

此外，從理論上推測，MPTP開放，線粒體膜電位降低，CytC釋放增加等還可誘導(dǎo)凋亡，從細(xì)胞凋亡途徑影響線粒體。

綜上所述，本實驗從線粒體損傷角度解釋了低氧所致機(jī)體損害的可能病理生理機(jī)制。低氧可通過增加小鼠肌肉離體線粒體的MPTP開放，下調(diào)膜電位，釋放CytC，抑制SOD活性、降低GSH含量，升高M(jìn)DA含量，即通過增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和細(xì)胞凋亡途徑等多種機(jī)制導(dǎo)致線粒體損傷。

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