異甘草素固體脂質(zhì)納米粒中低分子肝素鈉包封率的測定

鞏慧敏，馮澤岸，邵婷璣，廖明琪，喬 華

(蘭州大學(xué) 1.第一醫(yī)院，2.藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

異甘草素固體脂質(zhì)納米粒中低分子肝素鈉包封率的測定

鞏慧敏1，2，馮澤岸1，2，邵婷璣1，2，廖明琪1，2，喬 華1

(蘭州大學(xué) 1.第一醫(yī)院，2.藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的 測定異甘草素固體脂質(zhì)納米粒中低分子肝素鈉(LMWH)的包封率。方法 在Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液中，天青A與LMWH相互作用，在662 nm處測定吸光度差值(△A)，用△A對LMWH濃度進行線性回歸。樣品同法操作，測定LMWH的包封率。結(jié)果 LMWH的回收率在90.0% ～102.5%之間，線性范圍為100～1 000μg/mL(r=0.999 1)，異甘草素固體脂質(zhì)納米粒中LMWH的平均包封率為35%(n=5)。結(jié)論 此法操作簡單、準(zhǔn)確，適用于該制劑的質(zhì)量評價。

異甘草素;固體脂質(zhì)納米粒;低分子量肝素鈉;天青A;納米粒;包封率

異甘草素(isoliquiritigenin，ISL)固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是以 ISL為主藥，以磷脂、十六醇、米高-2等為輔料，經(jīng)肝素改性而得到的粒徑在80～250 nm的新型給藥系統(tǒng)。為了克服SLN靜脈注射用藥時容易引起凝血的缺點，同時增強制劑的物理穩(wěn)定性和SLN在溶液中的分散性，用低分子肝素鈉(LMWH)對ISL的SLN進行了改性。目前，LMWH的含量測定一般采用生物學(xué)方法和紫外分光光度法，即利用堿性染料作用后吸光度(A)值降低的特點進行肝素鈉的含量測定。但SLN中含有磷脂、十六醇等輔料，對測定有干擾，為了消除SLN中輔料的干擾，本文以陽離子染料天青A與LMWH相互作用，在662 nm波長處測定吸光度差值(△A)，并對測定條件進行了優(yōu)化。

1 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計(PerkinElmer Lambda 35);DT-224S電子分析天平(北京塞多利斯);H2050R高速冷凍離心機(湘儀離心機股份有限公司);YEH-A型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠);pH計(Mettler Delta 350，梅特勒托利多儀器);超濾離心管(10000MWCO PES，Sartorius Stedim Bio-tech)。

ISL的 SLN(自制);天青 A(Azure A chloride Salt，Lot No:090201，Ri Chu Bio Science Co.，Ltd);LMWH(批號:080311，效價:105.1 Axa IU/mg，河北常山生化藥業(yè)股份有限公司);ISL(上海邦成化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 吸收波長的選擇

取10 mL量瓶，加Britton-Robinson(B-R)緩沖液2 mL，1 mg/mL天青A溶液100μL，加水至刻度。圖1為該溶液的紫外吸收光譜圖。B-R緩沖液中，天青A在662 nm處有最大吸收，當(dāng)加入LMWH 100 μL后，最大吸收波長不發(fā)生變化，但A值下降，如圖2。圖2中由上往下7條曲線加入的LMWH濃度分別為100，200，300，400，600，800 和 1 000 μg/mL。加入的LMWH的濃度越大，A值下降越大，即△A越大。因此選擇662 nm為測定波長，用△A值對LMWH進行測定。

圖1 天青A的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of Azure A

圖2 不同濃度LMWH反應(yīng)體系的吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectra of different LMWH concentrations

2.2 B-R緩沖液pH值和用量的選擇

在B-R緩沖液中，LMWH與天青A作用，662 nm波長處△A增大。不同pH值的B-R緩沖液對LMWH與天青A的結(jié)合有影響。參考文獻［1］的方法，取10 mL量瓶2個，一個加水100μL，另一個加400μg/mL LMWH溶液100μL，再分別加入400 μg/mL天青A溶液100μL，pH 1.5的B-R緩沖液2 mL，加水至刻度，渦旋混勻，于662 nm處測定A值，計算△A 值，平行測定5 份。再以 pH 2.0，2.5，3.0，4.0和5.0的B-R緩沖液替代 pH 1.5的 B-R緩沖液按上述方法同法操作，測定△A，對pH作圖，結(jié)果見圖3。由圖3 看出，在 pH 1.5 ～5.0 之間，pH 2.5時△A最大，所以選用pH 2.5的B-R緩沖液。

取10 mL量瓶2個，空白加入水100μL，另一個加400μg/mL LMWH 溶液100μL，各加400μg/mL天青 A 溶液100μL，pH 2.5的B-R 緩沖液0.5 mL，加水至刻度，渦旋混勻，于662 nm處測定A值，計算△A，平行測定5份。再分別取pH 2.5的B-R緩沖液 1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 和 5.0 mL 同法操作，計算△A。結(jié)果表明，B-R 緩沖液用量在1.0～3.0 mL內(nèi)，△A較大且變化較小，用量大于3 mL或小于1 mL時，△A值減小，所以確定最佳用量范圍為1.0～3.0 mL，結(jié)合文獻報道［1］，確定選用 B-R 緩沖液1.5 mL。

圖3 pH值對△A的影響(n=5)Fig.3 Influence of pH on △A(n=5)

2.3 天青A用量

配制200～800μg/mL系列濃度的天青A溶液。取10 mL量瓶8個，分別加入各濃度天青A溶液100 μL，加 pH 2.5 B-R 緩沖液 1.5 mL，400 μg/mL LMWH溶液100μL，渦旋混勻，加水至刻度，待反應(yīng)完全測定△A值，平行測定5份。結(jié)果如圖4。天青A濃度在600μg/mL時△A最大，所以選擇天青A的濃度為600μg/mL。

圖4 天青A濃度對△A的影響(n=5)Fig.4 Influence of Azure A concentration on △A(n=5)

2.4 反應(yīng)時間和體系的穩(wěn)定性

取10 mL量瓶4個，分別加入600μg/mL天青A溶液100μL。空白加水100μL，其他分別加入100，200，400 μg/mL LMWH 溶液100 μL，pH 2.5 BR緩沖液1.5 mL，加水至刻度，渦旋混勻，于662 nm波長處測定A值，平行測定5份。結(jié)果見表1。由表1可以看出，在室溫下反應(yīng)20 min即達到反應(yīng)平衡，體系具有很好的穩(wěn)定性，A值在2 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

表1 反應(yīng)時間對體系穩(wěn)定性的影響(室溫，n=5)Tab.1 Influence of reaction time on system stability(room temperature，n=5)

2.5 SLN原輔料對測定的影響

2.5.1 SLN原輔料的吸收光譜 ISL的SLN中含有磷脂、泊洛沙姆、硬脂酸、十六醇、中碳鏈三苷脂等輔料及異甘草素，稱取處方量的SLN原輔料于10 mL量瓶中，加水稀釋到刻度，吸收光譜圖如圖5。可以看出，ISL及輔料在662 nm波長處基本無吸收，因此，原輔料本身對LMWH的測定基本無干擾。

圖5 ISL的SLN輔料的吸收光譜圖Fig.5 Absorption spectra of ISL solid lipid nanoparticles materials

2.5.2 SLN原輔料對天青A與LMWH相互作用的影響 取ISL的SLN混懸液(不含LMWH)200μL，加甲醇200μL，破壞SLN并使其溶解。取10 mL量瓶3個，各加入上述溶液200μL、50%甲醇溶液200μL、水200 μL，分別加入 pH 2.5的 B-R 緩沖液1.5 mL，600 μg/mL天青 A 溶液 100 μL，加水至刻度，渦旋混勻，室溫靜置20 min，于662 nm處測定△A值，平行測定5份。結(jié)果顯示，含SLN原輔料的樣品△A值為0.395±0.007，加入50%甲醇溶液的△A值為0.455±0.020，加水的△A 值為 0.472±0.040，將測定結(jié)果進行 t檢驗分析，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，SLN原輔料和甲醇對天青A與LMWH的作用都有影響，因此，在反應(yīng)體系中，應(yīng)平行加入甲醇溶液以消除其影響。

2.6 包封率的測定

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性 取10 mL量瓶10個，空白管加水 100 μL，其他加入 1 000，800，700，600，500，400，300，200，100 μg/mL LMWH 溶液 100 μL，加600μg/mL天青 A溶液100μL，pH 2.5的 B-R緩沖液1.5 mL，甲醇溶解并破壞的不含LMWH的SLN溶液200μL，加水至10 mL，渦旋混勻，室溫放置20 min，以水為空白，測定各管的A值?？瞻坠転锳0，含有LMWH的為A，計算△A=A0－A。以△A對LMWH濃度進行一元三次多項式回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:△A=0.000 9 C3－0.020 4 C2+0.168 6 C －0.013 7，r=0.999 1，見圖 5。LMWH 濃度在 100 ～1 000μg/mL范圍內(nèi)與△A線性關(guān)系良好。

圖6 LMWH含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of LMWH determination

2.6.2 回收率與重現(xiàn)性 取LMWH溶液各5份，按照2.6.1項下方法操作，測定A值，同日內(nèi)測定5次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得實測濃度，實測濃度跟配制濃度相比，計算LMWH的回收率，連測3 d，計算日內(nèi)及日間精密度。結(jié)果見表2。

表2 LMWH各濃度點的回收率與精密度(n=5)Tab.2 Recovery and precision of every LMWH concentration(n=5)

2.7 樣品分析

2.7.1 SLN中LMWH的總量測定 精確吸取ISL的SLN混懸液200μL(LMWH總濃度為200μg/mL)，加入甲醇200μL破壞并溶解后，取200μL于10 mL量瓶中，加入600μg/mL天青A溶液100 μL，pH 2.5 B-R 緩沖液 1.5 mL，加水至刻度，渦旋混勻。室溫下放置20 min，于662 nm處測定其△A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得實測濃度為(201.0±1.5)μg/mL。

2.7.2 游離LMWH的測定 吸取一定量 ISL的SLN混懸液，置于超濾離心管中，14 600 r/min離心60 min，取超濾液100μL，置10 mL量瓶中，加600 μg/mL天青 A 溶液100 μL，pH 2.5 B-R 緩沖液1.5 mL，甲醇100μL，加水至刻度，渦旋混勻。室溫放置20 min，662 nm處測定A值。以不含LMWH的ISL的SLN同法處理作為空白管，以水為空白，測定A值(A0)?！鰽=A0－A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算游離LMWH濃度，其實測濃度為(70.4±0.6)μg/mL。

2.7.3 包封率的計算 SLN中LMWH的總量記為△A總，游離LMWH的量記為△A游，則 SLN中 LMWH的包封率=(△A總－△A游)/△A總×100%。測得樣品中LMWH的平均包封率為35%(n=5)。

3 討論

LMWH是肝素鈉經(jīng)裂解獲取的硫酸氨基葡聚糖片段，常以鈉鹽形式存在，在溶液中帶有大量的負(fù)電荷。天青A是一種陽離子染料，在溶液中解離形成無色的陰離子和有色的陽離子，天青A在溶液中氨基帶正電荷，可與LMWH中帶負(fù)電荷的硫酸酯基和硫酸氨基基團結(jié)合［2］，結(jié)合型的天青A紫外吸收特征發(fā)生改變，使溶液在662 nm處A值降低，且A值的降低與LMWH的濃度成比例，因此，可用本方法對LMWH濃度進行定量分析。

本實驗發(fā)現(xiàn)，ISL的SLN本身在662 nm波長處基本無吸收，但其對LMWH與天青A的結(jié)合有影響，所以在樣品測定過程需加入ISL的SLN，以消除對反應(yīng)的影響。ISL的SLN本身對LMWH與天青A結(jié)合反應(yīng)造成影響的可能原因為ISL的SLN中含有表面活性劑大豆卵磷脂和泊洛沙姆，其中大豆卵磷脂含有磷酸基及季銨基，是兩性分子，在溶液中可與天青A或LMWH發(fā)生相互作用，使LMWH和天青A結(jié)合比例受到影響，導(dǎo)致溶液A值升高，△A減小。實驗發(fā)現(xiàn)，甲醇的加入對A值也有影響，其可能原因為影響了溶液中各種離子的解離，干擾了LMWH和天青A的解離和結(jié)合過程，造成了A值的改變。為了消除影響，在LMWH分析方法建立過程中，加入了少量甲醇溶解的ISL的SLN。

按照優(yōu)化的實驗條件，LMWH濃度與△A在100～1 000μg/mL呈三階多項式關(guān)系，實驗對每個濃度點進行了精密度和回收率測定，日內(nèi)和日間精密度分別在 1.03% ～6.15%和 1.20% ～5.85%之間，回收率在90.0% ～102.5%之間，滿足測定要求，其工作曲線變化趨勢與文獻報道［3］一致，但線性回歸結(jié)果優(yōu)于文獻報道［1］。

在樣品測定過程中，為了檢測分子質(zhì)量量5 000～8 000的LMWH能否完全通過10 kD MWCO超濾離心管，同時對ISL的SLN完全截留，本實驗配制了LMWH溶液，在超濾離心前后測定原溶液和超濾液的濃度，結(jié)果表明超濾前后溶液濃度相同，10 kD MWCO的超濾離心管對游離的LMWH無截留;經(jīng)激光粒度分析，ISL的SLN粒徑均大于80 nm，其膠團分子總質(zhì)量量遠(yuǎn)超10 kD，因此，該超濾離心管可將ISL的SLN有效截留。故本實驗可用于該SLN中LMWH包封率測定，且操作簡單快速。

［1］孫 偉，焦 奎，牛學(xué)良，等.用燦爛甲酚藍褪色分光光度法測定肝素鈉的研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2005，25(8):1322-1324.

［2］劉本舉，李新梅.堿性染料的pH大于7嗎?［J］.生物學(xué)教學(xué)，2005，30(1):28.

［3］Jiao Qingcai，Liu Qian.Characterization of the interaction between methylene blue and glycosaminoglycans［J］.Spectrochim Acta A，1999，55:1667-1673.

Encapsulation efficiency determination of low molecular weight heparin in isoliquiritigenin nanoparticle

GONG Hui-min1，2，F(xiàn)ENG Ze-an1，2，SHAO Ting-ji1，2，LIAO Ming-qi1，2，QIAO Hua1
(1.The No.1 Hospital of Lanzhou University，2.School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)

Purpose To determine the encapsulation efficiency of low molecular weight heparin(LMWH)in isoliquiritigenin(ISL)nanoparticle.Methods In Britton-Robinson(B-R)buffer solution，Azure A chloride Salt has a maximum absorption peak at 662 nm and the absorbance reduced by the reaction with LMWH.Polynomial regression between absorbance and LMWH concentration was made.ISL nanoparticle and ultrafiltrate were treated by the similar method and absorbance was recorded.The contents of LMWH and entrapment efficiency were calculated respectively.Results Recoveries of LMWH were between 90.0%-102.5%，the linear ranges of determination of LMWH was 100-1 000 μg/mL(r=0.999 1).Average encapsulation efficiency of LMWH in ISL nanoparticle was 35%(n=5).Conclusion The method was convenient and accurate.It is suitable for the quantity control of ISL nanoparticle.

isoliquiritigenin;nanoparticle;low molecular weight heparin;Azure A chloride salt，nanoparticle;encapsulation efficiency

R944.9;R927.1

A

1005-1678(2012)04-0381-04

2011-06-28

甘肅省中醫(yī)藥科研立項課題(GZK-2008-21)

鞏慧敏，女，碩士研究生;喬 華，男，通信作者，碩士，主任藥師，副教授，碩導(dǎo)，Tel:13109431668，E-mail:qhbrian@163.com。