不同時間點GABAA受體α2亞基在神經(jīng)病理性痛中的表達

連宇，司軍強，馬克濤，尚媛媛 ，李麗

不同時間點GABAA受體α2亞基在神經(jīng)病理性痛中的表達

連宇，司軍強，馬克濤，尚媛媛 ，李麗

（石河子大學醫(yī)學院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002）

為探討慢性坐骨神經(jīng)壓榨性損傷（CCI）模型背根神經(jīng)節(jié)GABAA受體α2亞基在不同時間點（3、7、12 d）表達。采用雄性SD大鼠28只，隨機分為4組（n＝7）。A組（假手術組）、B組（CCI術后3 d）、C組（CCI術后7 d）、D組（CCI術后12 d），取L4－L6背根神經(jīng)節(jié)做冰凍切片，用免疫熒光染色方法觀察GABAA受體α2亞基表達變化。結果顯示，（1）CCI模型鼠熱縮足反射潛伏期與假手術組相比顯著縮短（P＜0.01）。（2）免疫熒光染色示A組、B組、C組、D組DRG神經(jīng)元均有GABAA受體α2亞基表達，分布于DRG各種直徑神經(jīng)元細胞膜上。（3）與A組比較，D組L4－L6背根神經(jīng)節(jié)GABAA受體α2亞基受體的表達減少（P＜0.05）；B組、C組變化不明顯（P＞0.05）。由此可知，慢性坐骨神經(jīng)壓榨性損傷（CCI）模型背根神經(jīng)節(jié)GABAA受體α2亞基表達下調，提示GABAA受體α2亞基參與了神經(jīng)病理性痛的發(fā)生。

GABAA受體α2亞基；神經(jīng)病理性痛；背根神經(jīng)節(jié)；免疫熒光

神經(jīng)病理性痛是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或功能障礙所致，損傷修復后疼痛仍可能長期存在，主要特征是：自發(fā)的持續(xù)性或多變性疼痛 （自發(fā)痛）以及痛覺過敏和／或痛覺超敏［1］。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal r oot ganglion，DRG）細胞是軀體感覺的初級傳入神經(jīng)元，在疼痛的發(fā)生和維持中起著重要的作用［2］。在神經(jīng)病理性痛的情況下DRG發(fā)生顯著的可塑性變化，如神經(jīng)肽、受體、酶和細胞表面分子的表達都發(fā)生了不同程度的上調或是下調［3］。

γ-氨基丁酸 （gamma aminobutyric acid，GABA）作為一種經(jīng)典的抑制性神經(jīng)遞質已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一百多年，GABA受體可分為 GABAA、GABAB和GABAC，其中GABAA受體屬于配體門控離子通道受體，由5個亞基（α、β、γ、s、r）組成，組成 GABAA受體亞基的種類有17個（α1－6、β1－4、γ1－4、s、r1－2），其中的α2亞基構成了GABAA受體的優(yōu)勢組合，即α2β3γ2［4］。神經(jīng)損傷后GABAA受體會發(fā)生積極的自身變構以達到鎮(zhèn)痛作用，而這種變構就是通過恢復脊髓內α2、α3亞基功能進行的［5］。本實驗主要采用免疫熒光技術觀察背根節(jié)神經(jīng)元L4－L6GABAA受體α2亞基表達變化，探討其在坐骨神經(jīng)病理性痛過程中發(fā)揮的作用，旨在為神經(jīng)痛的治療提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

選用成年雄性SD大鼠28只（新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物質量符合一級標準）體重250～280 g。隨機分為4組（n＝7）：A組（假手術組）、B組（CCI術后3 d）、C組（CCI術后7 d）、D組（CCI術后12 d）

1.2 CCI模型制備

大鼠以1%戊巴比妥鈉 （30～40 mg／kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下手術。下肢背側部縱向切口，暴露股二頭肌，經(jīng)肌間鈍性分離于股骨后找到坐骨神經(jīng)主干，用鉻制羊腸線做間距為1 mm的4道結扎，結扎線以不影響神經(jīng)外膜的血運為度，然后逐層縫合。假手術組除不做鉻制羊腸線結扎外其余方法同上。術后單獨飼養(yǎng)，籠底鋪有鋸末，嚴格12 h明暗交替光照，給予充足的水源和飼料。

1.3 熱板實驗

分別在術前1 d、術后1、3、7、12 d對CCI模型大鼠和假手術大鼠行熱板實驗。將白色手術托盤置于52.5℃恒溫水浴鍋里，使其溫度達到平衡。上置一個頂部敞開的透明有機玻璃罩，構成一個容積為20 c m×20 c m×15 c m＝6000 c m3的透明觀測盒。將大鼠置于透明觀測盒里，用秒表計時，從大鼠后肢與托盤接觸到出現(xiàn)踮腳、回縮、舔足、掙扎計為大鼠熱縮足反射潛伏期，作為后肢痛閾的指標。為避免組織損傷，時間不得超過30 s。每次測量5遍，取后三次平均值。所有測試都在上午8：00～11：00時之間進行。

1.4 免疫熒光染色及定量分析

在解剖顯微鏡下取出大鼠的DRG，4%多聚甲醛室溫下固定4-6 h，30% 蔗糖溶液過夜后OCT包埋，連續(xù)冰凍切片，片厚5μm。DRG冰凍切片用0.01 mol／L PBS液洗4次，每次5 min，然后在室溫下加封閉液，1 h后吸去封閉液并加入山羊多克隆GABAARα2（1∶200，SANTA CRUZ），置于室溫24 h，吸去一抗，用0.01 mol／L PBS液洗3次，加入FITC標記兔抗山羊二抗（1∶100，中杉金橋），避光室溫下作用1 h，再用0.01 mol／L PBS液洗3次，立即于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

對于激光共聚焦顯微鏡檢測的DRG神經(jīng)元的定量分析是通過測量其胞膜的熒光灰度水平進行的。每張片子選取5個視野，在每個細胞的胞膜隨機選取3個點，測量并比較四組的灰度值。

1.5 統(tǒng)計學處理

用單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，組間比較用t檢驗。統(tǒng)計學分析通過SPSS進行，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（ˉX±S）表示。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異，P＜0.01為差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 行為學表現(xiàn)及熱痛敏實驗

CCI模型制備成功后觀察，無傷口感染征象；無傷側肢體自噬現(xiàn)象；術側下肢輕觸地面，不持重或輕微持重，行走時跛行。熱板實驗結果如表1所示，CCI模型組術后第1天出現(xiàn)顯著的熱縮足反射潛伏期縮短，可持續(xù)至術后12 d。假手術組前后熱縮足反射潛伏期無差異（P＞0.05）；CCI模型組手術側熱縮足反射潛伏期術前1 d與術后1 d、3 d、7 d、12 d相比有統(tǒng)計學差異，與假手術組比較差異具有顯著性（P＜0.01）。

表1 假手術組、CCI術側3、7、12 d組熱縮足反射潛伏期變化Tab.1 Change of Ther mal withdrawal latency（TWL）of different groupsˉΧ±S，n＝7

2.2 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元GABAA受體α2亞基的表達

免疫熒光染色如圖1所示A組、B組、C組、D組DRG神經(jīng)元均有GABAA受體α2亞基表達，分布于DRG各種直徑神經(jīng)元細胞膜上，在四組的DRG神經(jīng)元胞膜上GABAA受體α2亞基陽性信號呈梯度性減弱。用高清晰HP-9001處理軟件分析結果如圖2所示，A組陽性細胞光密度均值OD＝37.2±5.31（n＝7）；B組 OD＝34.9±5.21（n＝7）；C組 OD＝31.1±3.50（n＝7）；D組OD＝20.2±2.24（n＝7）。與 A組相比，B組、C組 L4－L6DRG的 GABAA受體α2亞基表達無明顯變化（P＞0.05），而D組 OD＝20.2±2.24（n＝7）GABAA受體α2亞基表達減少，與 A組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

圖1 免疫熒光染色示假手術組、CCI術側3、7、12 d組GABAA受體α2亞基表達（20×）Fig.1 Expression of GABAA Rα2 on different ti mes of Sham group，CCI operative side 3，7，12 d groups（20×）

圖2 假手術組、CCI術側3，7，12 d組神經(jīng)元陽性細胞光密度均值Fig.2 Comparison of mean optical density of positive cells in Sham group，CCI operative side 3，7，12 d groups

3 討論

在疼痛的基礎研究中，既往很多外周神經(jīng)損傷的模型，如保留性神經(jīng)損傷模型（spared nerve inj ur y SNI）、脊神經(jīng)結扎模型 （spinal ner ve ligation SNL）、坐骨神經(jīng)部分結扎模型（partialligation of the sciatic nerve PLSN）等都是損傷軸突或初級感覺神經(jīng)元，從而模擬損傷區(qū)異位放電而研究疼痛的機制［6］。Bennett等［7］于1988年建立的坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷（chr onic constriction injur y，CCI）模型手術操作較簡單，創(chuàng)傷小，且可以出現(xiàn)較明顯穩(wěn)定的自發(fā)痛、熱痛覺過敏和機械性痛覺超敏等類似臨床神經(jīng)痛的癥狀和體征，在神經(jīng)痛研究中應用較多。

本實驗通過建立大鼠坐骨神經(jīng)縮窄性損傷模型，應用免疫熒光技術觀察該模型中不同時間點背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元L4至L6GABAA受體α2亞基表達變化。研究發(fā)現(xiàn)，在DRG各種直徑的神經(jīng)元細胞膜上均有GABAA受體α2亞基表達，CCI術后12 d陽性細胞GABAA受體α2亞基半定量光密度值OD＝20.2±2.24，小于假手術組半定量光密度值OD＝37.2±5.31，兩者比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。CCI術后3、7 d半定量光密度值分別為OD＝34.9±5.21和OD＝31.1±3.50，與假手術組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結果表明GABAA受體α2亞基確實參與了神經(jīng)病理性痛。而CCI術后12 d受體表達的變化并沒有明顯的時間規(guī)律性，這可能與外周神經(jīng)損傷程度有關，神經(jīng)系統(tǒng)不同部位、不同程度、不同時間的損傷，其GABA受體表達也隨著發(fā)生變化。并且DRG除了從外周端向脊髓傳導痛覺外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)病變的大鼠DRG上GABAA受體的密度和敏感性均被持續(xù)的下調［8］。雖然GABAA受體α2亞基表達沒有明顯的時間依賴性，但運用全細胞膜片鉗技術記錄CCI模型手術側、假手術組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞GABAA受體激活電流，發(fā)現(xiàn)CCI模型組大鼠手術側DRG神經(jīng)元GABAA受體激活電流幅值顯著小于假手術組，提示坐骨神經(jīng)的慢性壓榨性損傷改變了損傷側的GABAA受體的功能［9］。細胞內微電極記錄技術記錄到相同濃度的GABA引起DRG神經(jīng)元的去極化的幅度在神經(jīng)病理性疼痛模型組大鼠明顯小于正常對照組大鼠，表明神經(jīng)病理性痛時，GABA在初級感覺傳入終末產(chǎn)生的突觸前抑制作用被減弱，從而易化了傷害性信息（痛覺）的傳遞［10］。

總之，應用免疫熒光染色的方法證明了GABAA受體α2亞基確實參與了神經(jīng)病理性痛大鼠痛覺傳導并且觀察了L4至L6DRG神經(jīng)元GABAA受體α2亞基的表達特點。除之前所述，初級傳入突觸前抑制作用的減弱可以是由于突觸前膜GABAA受體表達的下調，也可以是突觸前膜GABAA受體發(fā)生了磷酸化或脫磷酸化，使受體的功能活動降低所致［11］。在神經(jīng)病理性痛的發(fā)生中，眾多的胞內信號通路參與了GABAA受體亞基磷酸化，如c A MP、PKA、c GMP／PKC、NO、Ca MK II等。而 GABAA受體的磷酸化或脫磷酸化也是我們今后的研究方向，希望對這一方面的研究，使神經(jīng)病理性痛的發(fā)生發(fā)展機制更加明確。

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Expression of GABAAReceptorα2Subunit in Neuropathic Pain at Different Ti me Points

LIAN Yu，SI Junqiang，Ma Ketao，SHANG Yuanyuan，LI Li
（School of Medicine／Key Laborator y of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Ministr y of Education，Shihezi University，Shihezi 832002，China）

To investigate the expression of dorsal root ganglia GABAAreceptorα2subunit in sciatic nerve chronic cr ush injury（CCI）model at different ti me points（3、7、12 d）.Methods：Twenty-eight male Sprague Dawley rats were rando mly divided into 4 groups：group A of sham operation，group B 3 days after CCI；group C 7 days after CCI，and group D 12 days after CCI.L4-L6 dorsal root ganglia were used f or frozen sections.Immunofluorescence staining was applied to observe the changes in GABAAreceptorα2subunit.Results：（1）CCI injured side produced significantly ther mal with drawal latency shorter（P＜0.01）.（2）The i mmunofluorescence staining sho w A，B，C and D group of DRG neuron nave GABAAreceptorα2subunit expression，located in the DRG each kind of diameter neuron cell membrane.（3）Compared with group A，the expression of L4-L6 dorsal root ganglia GABAAreceptor variousα2subunit receptor in group D decreased（P＜0.05）；no significant changes in group B and group C（P＞0.05）.Conclusion：The decrease in the expression of GABAAreceptorα2subunit in sciatic ner ve chronic cr ush injury（CCI）model of dorsal root ganglia suggests that GABAA receptorα2subunit has a correlation with neuropathic pain.

GABAARα2；neuropathic pain；dorsal root ganglion；i mmunofluorescence

R338

A

1007-7383（2012）02-0202-04

2011-12-02

新疆兵團青年科技創(chuàng)新基金專項（2010JC33）

連宇（1984-），女，碩士生，專業(yè)方向為神經(jīng)生理和血管生理；e-mail：Lianyu8410891＠sina.com。

李麗，（1976-），女，副教授，從事神經(jīng)生理和血管生理；e-mail：Lily7588＠163.co m。