梅山與杜洛克母豬發(fā)情前期卵巢中差異表達基因的分離與鑒定

趙志超，孫敬禮，黃濤，李大全，王宵燕，宋成義，劉麗娟，楊飛

（1石河子大學動物科技學院，石河子832003；2揚州大學動物科技學院，揚州225000）

梅山與杜洛克母豬發(fā)情前期卵巢中差異表達基因的分離與鑒定

趙志超1，孫敬禮1，黃濤1，李大全1，王宵燕2，宋成義2，劉麗娟1，楊飛1

（1石河子大學動物科技學院，石河子832003；2揚州大學動物科技學院，揚州225000）

為了探討梅山與杜洛克母豬卵巢差異表達基因對豬排卵與繁殖性狀的影響，采用mRNA差異顯示技術對梅山豬與杜洛克豬卵巢中基因表達的差異性進行了研究。結果顯示：利用DDRT－PCR在梅山與杜洛克豬卵巢中分離了1條差異表達的表達序列EST142，并用半定量RT－PCR鑒定。通過GenBank／BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該EST142與BCL－2／BNiP3L具有較高的同源性。組織表達譜分析揭示了該EST142在梅山豬心、肝、肺、腎、肌肉、脂肪、小腸、大腦、卵巢、子宮、脾、輸卵管等各個組織中的表達有不同程度的差異。這表明該基因在梅山與杜洛克豬卵巢中差異表達，可能在某種程度上影響卵泡發(fā)育。本研究為研究影響豬排卵數(shù)的分子調控網(wǎng)絡奠定了基礎。

梅山豬；杜洛克豬；卵巢；半定量；組織表達譜

從遺傳學和綜合經(jīng)濟效益的角度出發(fā)，豬繁殖性狀是具有微效多基因效應的低遺傳力和限性遺傳性狀，而產(chǎn)仔數(shù)又是其中最重要的性狀［1－2］。在歐美國家含25%梅山豬血液的青年母豬比大白×法國

長白母豬每窩約多產(chǎn)1．6個活仔［3］，這在一定程度上證明了梅山豬相對國外一些豬種具有較高的產(chǎn)仔數(shù)的生產(chǎn)性能。因此，取繁殖力較高的梅山和肉質型較好而繁殖力低的杜洛克作為研究對象則具有很大的意義。

梅山與杜洛克為著名的優(yōu)良豬種，梅山豬屬我國優(yōu)良的地方豬種太湖豬的一種，具有繁殖力高的特點，經(jīng)產(chǎn)母豬平均窩產(chǎn)仔數(shù)為15～16頭，是世界著名的高產(chǎn)豬種。杜洛克豬原產(chǎn)美國，是最優(yōu)良的瘦肉型豬種之一，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，在我國的存欄數(shù)也很大，但其產(chǎn)仔數(shù)卻很低，經(jīng)產(chǎn)母豬窩產(chǎn)仔數(shù)僅為9～10頭［4］。國內(nèi)外研究者從激素、細胞因子、營養(yǎng)、管理、環(huán)境等方面對中外豬種繁殖力差異形成的原因與機理進行了廣泛的研究與探討，發(fā)現(xiàn)排卵數(shù)多是我國太湖豬高產(chǎn)的基礎之一［5］。中外豬種發(fā)情母豬的排卵數(shù)有很大的差異。梅山經(jīng)產(chǎn)母豬每個情期排卵數(shù)為25～29個［5］，而杜洛克豬每個情期排卵數(shù)只有12．3個［6］，二者差異很大，這是形成兩豬種產(chǎn)仔數(shù)差異的重要原因。因此，從排卵特異基因的角度來進行研究有助于更好的理解排卵的分子機制，有助于發(fā)展新的途徑以提高繁殖力和繁殖控制。

mRNA差異顯示（differential display reverse transcription polymerase chain reaction，DDRTPCR）技術能快速篩選差異表達基因，并已在人、動物和農(nóng)作物的研究中取得了一些可信成果［7］。本研究利用DDRT－PCR的方法從基因轉錄水平研究發(fā)情前期梅山與杜洛克母豬卵巢之間差異表達的基因進行分離和鑒定，通過研究，分離得到了在梅山豬卵巢中表達而在杜洛克豬卵巢中不表達的BCL2基因，并對該基因進行了組織表達譜分析。

1 材料與方法

1．1 材料

選取發(fā)情正常、符合品種特征的梅山豬和杜格克母豬各3頭。Trizol Reagent、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）、N－N′－亞甲基丙烯酰胺（Bisacrylamide，Bis）、TEMED、PGM－T載體連接試劑盒、DNA膠回收試劑盒；高速冷凍離心機、梯度PCR儀、電泳凝膠成像系統(tǒng)、DNA／RNA濃度測定儀。

1．2 方法

1．2．1 樣品的采集和總RNA的提取

每天2次觀測豬的發(fā)情表現(xiàn)，以發(fā)情出現(xiàn)靜立反應時為發(fā)情周期第0天。在發(fā)情周期第14天耳根靜脈注射獸用氯前列烯醇注射液1支。48h（第2天）取其卵巢和其他組織樣（包括肌肉、肝臟、肺臟、心臟、脾臟、子宮、輸卵管、小腸、胃等），用錫紙包裹，用液氮速凍（宰殺后30－40min），提取RNA后迅速置于－80℃保存。組織樣品總RNA的提取參照TRIzol試劑盒（Invitrogen公司）的操作說明書提取。DnaseI處理后用1．0%普通瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計法檢測RNA的抽提質量和濃度。提取后的總RNA置于－80℃保存，備用。

1．2．2 DDRT－PCR

RNA反轉錄和第一鏈cDNA合成?？傮w積50 μL：2μL 10mmol／L的dNTP，模板 RNA 5μL，2 μL的Oligo（dT）混勻離心PCR上75℃變性5min立即放冰上冷卻，再加入10μL 10×Reaction Buffer，0．5μL RNasin，29．5μL DEPC 水，1μL MMLV反轉錄酶，混勻后37℃反應60min，95℃滅活5min。反轉錄成功的cDNA單鏈可于－20℃中保存。

采用9條錨定引物和10條隨機引物隨機組合對梅山和杜洛克母豬卵巢的cDNA進行PCR擴增。DDRT－PCR擴增體系總體積20μL：2．0μL 10×Taq DNA polymerase buffer，1．0μL 10μmol／L錨定引物，1．0μL 10μmol／L隨機引物，0．3μL Taq DNA polymerase，和12．7μL水。PCR程序如下：94℃5min，（94℃30s，40℃30s，72℃30s）10個循環(huán)，隨后25循環(huán)：94℃30s，45℃30s，72℃30s，最后72℃延伸10min，4℃終止反應。PCR產(chǎn)物用PAGE膠銀染分析。

1．2．2 差異條帶的重擴增、克隆和序列分析

參照Liang等［8］的方法采用煮沸法回收差異cDNA片段，切下包含差異條帶的聚丙酰胺凝膠，放入無菌1．5mL的EP管中。加入約80μL膠浸泡液TE，用槍頭搗碎，95℃水浴放置15min。以回收的模板按照第1次擴增的條件進行再次擴增。PCR產(chǎn)物連接pMD－18T載體進行克隆。將得到克隆序列進行分析。引物及退火溫度見表1。

表1 差異ESTs的引物序列及退火溫度Tab．1ESTs specific primers and annealing temperature

1．2．3 半定量RT－PCR鑒定及組織表達譜分析

將各組織總RNA反轉錄的第一鏈cDNA稀釋成相同的濃度作為模板，根據(jù)差異表達的EST的序列設計引物進行PCR，以β－actin的基因的表達作為對照，PCR的反應參數(shù)因不同的引物而異，反應一般為25個循環(huán)，每個PCR重復3次。

退火溫度55℃。

2 結果與分析

2．1 mRNA差異顯示分析

通過對梅山與杜洛克母豬發(fā)情前期卵巢組織的cDNA進行DD－PCR，將PCR產(chǎn)物在12%的聚丙烯酰胺凝膠上分離、銀染顯色分析，發(fā)現(xiàn)存在基因表達差異，差異顯示的1個EST如圖1所示。

圖1 EST142的差異表達分析Fig．1The differential expression analysis of EST142

2．2 序列分析

采用錨定引物和隨機引物進行DDRT－PCR，獲得1條同源性較高的差異表達條帶，EST142（104 bp）與豬 BCL2／adenovirus E1B19kDa interacting protein 3－like（BNIP3L）同源性為92%。

表2 差異表達EST信息Tab．2Information on the differentially displayed EST

2．3 半定量RT－PCR

利用半定量PCR對差異基因EST142進行驗證。發(fā)現(xiàn)EST142在杜洛克母豬的卵巢中不表達，在梅山豬的卵巢中表達。

2．4 組織表達譜分析結果

用梅山豬的組織cDNA為模板進行半定量RT－PCR，結果（表3）顯示，差異EST142卵巢中表達豐富，在腎、肌肉、脂肪、大腦 、脾 、子宮、輸卵管中中等表達，在心、肝中微量少量表達。

圖2 半定量PCR結果Fig．2Result of semi－quantitative RT－PCR

表3 差異ESTs的組織表達譜分析Tab．3Information on the differentially displayed ESTs tissue expression profile analysis

3 討論

EST142與豬BCL2／adenovirus E1B19kDa interacting protein 3－like（BNIP3L）序列同源，同源性為92%。BCL－2基因最早是Tsujimoto等［9］從人濾泡性淋巴瘤t（14，18）染色體易位的斷裂點分離得到，是目前最受關注的細胞凋亡相關基因之一。該基因的主要功能是通過編碼蛋白Bcl－2，而發(fā)揮其抑制細胞凋亡的功能。具體的抗凋亡的機制包括下面幾個方面：（1）通過與其它蛋白間發(fā)生結合性相互作用而抑制細胞凋亡。Bcl－2抗凋亡功能的發(fā)揮在一定程度上依賴于與其它蛋白的結合和相互作，且已經(jīng)得到證實。例如Bcl－2可通過與BAG－1結合而協(xié)同抵抗anti－Fas和CTL誘導的細胞凋亡［10］。（2）通過影響Ca2＋流而抑制凋亡。諸多證據(jù)表明，Ca2＋流的改變在凋亡中起著重要作用［11－12］。Bcl－2過表達可以抑制正在發(fā)生凋亡的細胞內(nèi)質網(wǎng)中鈣離子的釋放。但鄭英如等［13］發(fā)現(xiàn)，在ionophore處理的PC12細胞，過表達Bcl－2，不能阻止胞內(nèi)游離Ca2＋的升高，這又提示Bcl－2能夠通過阻止位于Ca2＋升高事件下游的一個凋亡信號而抑制凋亡。（3）通過干擾其它凋亡相關蛋白的功能和活性而抑制凋亡。如：在SV誘導的凋亡中，可因Bcl－2的表達而使NF－kB活性明顯受抑，從而使凋亡過程受阻。（4）通過抑制胞膜磷脂酰絲氨酸早期重分布而阻止凋亡［13］。由于胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）的早期重分布是凋亡的一個共同特征，而Bcl－2恰恰能夠抑制PS的這種改變，從而提示Bcl－2有可能通過抑制PS的外在化而阻止凋亡。（5）通過參與信號傳遞而抑制細胞凋亡。R－RasP23、R－RasP21、Raf－1、NO等都是重要的信號傳導分子，同時也參與細胞凋亡的調節(jié)。這些分子或可與Bcl－2結合，或可調節(jié)Bcl－2表達。于是人們推測，Bcl－2可能參與這些分子相關的信號傳導通路，通過影響這些通路而抑制細胞凋亡［15］。另外Bcl－2可能通過抗氧化作用或抑制氧自由基的產(chǎn)生而抑制細胞凋亡。但是，Bcl－2基因是否能夠抑制由活性氧化物質特殊誘導的細胞死亡，以及活性氧化中間體是否為細胞凋亡所必需，至今仍不清楚［14］。有研究報道動物排卵前顆粒細胞凋亡與排卵有關［15］，隨著排卵的臨近，凋亡細胞逐漸增加，因此，若是Bcl－2基因在動物體內(nèi)充分表達的話將有助于減少細胞凋亡，將極大的提高動物的繁殖率。

本研究發(fā)現(xiàn)該基因在梅山豬卵巢中表達豐富，而在杜洛克豬卵巢中不表達。可以推測可能在梅山豬排卵的期間由于Bcl－2參與調控導致排卵前顆粒細胞凋亡減少，從而使梅山豬排卵數(shù)增加。這可能是梅山豬相對于杜洛克豬高產(chǎn)的原因之一。本研究利用DDRT－PCR的技術獲得差異EST142，并通過半定量RT－PCR驗證EST142在豬種間的表達差異，驗證后的EST142將作為一種重要的資源為揭示中外豬品種間差異的遺傳基礎帶來希望和活力，有助于深入探討卵巢、卵泡生理和生殖數(shù)量的遺傳控制的潛在途徑。

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Isolation and Identification of Differential Expression Genes in Ovarian Tissues of Meishan and Duroc Sows at Proestrus Stage

ZHAO Zhichao1，SUN Jingli1，HUANG Tao1，LI Daquan1，WANG Xiaoyan2，SONG Chengyi2，LIU Lijuan1，YANG Fei1
（1College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225000，China）

In order to explore the effect of the differential expression genes on ovulation and reproduction traits，mRNA differential diplay（DD）technique was employed to investigate the differences in gene expression in the ovary tissues of Meishan and Duroc sows．One expressed sequence tag EST142，differentially expressed between Meishan and Duroc，was isolated and identified through semi－quantitative reverse transcriptase－polymerase chain reaction（RT－PCR）．The nucleotide sequence analysis revealed that the EST showed similarity to the known genes BCL－2／BNiP3Lpublished in GenBank．Tissue expression profile analysis showed that the EST142was expressed differently in heart，liver，lung，kidney，muscle，fat（subcutaneous fat little legs，the same below），small intestine，brain，ovary，uterus，spleen，and oviduct．Conclusion：The EST142expresses differentially between Meishan and Duroc．The gene will result in the differences of little size in pigs．This research provides a foundation for further study on the molecular mechanism of ovulation regulatory network．

Meishan；Duroc；ovary；semi－quantitative；expression profiles

S828

A

2011－12－09

國家自然科學基金項目（30901014），石河子大學高層次人才啟動資金項目（RCZX200602）

趙志超（1985－），男，碩士生，專業(yè)方向為豬分子遺傳育種；e－mail：qingxihuyang2008＠163．com。

黃濤（1978－），男，副教授，從事豬分子遺傳育種研究；e－mail：taohuang100＠sina．com。