MDM2和MDM4對(duì)P53調(diào)控研究進(jìn)展

趙 婧 屈 藝 母得志

P53蛋白是DNA損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)P53的嚴(yán)格調(diào)控是哺乳動(dòng)物細(xì)胞存活所必須的，P53過(guò)多表達(dá)或不當(dāng)?shù)募せ钍辜?xì)胞死亡，而表達(dá)減少或失活則導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。編碼P53的基因在腫瘤中常發(fā)生突變或缺失，分別在1980年和1990年發(fā)現(xiàn)的鼠雙微基因MDM2和MDM4在許多腫瘤中擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)，并可導(dǎo)致P53蛋白的失活［1］。通過(guò)與P53相互作用對(duì)其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的蛋白超過(guò)160種，幾乎每月都會(huì)發(fā)現(xiàn)一種新的P53調(diào)節(jié)蛋白。而MDM2和MDM4不僅在腫瘤中表達(dá)經(jīng)常發(fā)生變化，在胚胎發(fā)育過(guò)程中也對(duì)P53發(fā)揮特異性的抑制作用［2］。因此進(jìn)行MDM2和MDM4對(duì)P53調(diào)控的研究，具有重要的病理生理意義。

一、MDM2和MDM4的蛋白結(jié)構(gòu)

人類MDM2(HDM2)和MDM4(HDM4)分別含有491和490個(gè)氨基酸序列，蛋白結(jié)構(gòu)相似，都含有三個(gè)進(jìn)化保守的結(jié)構(gòu)域:與P53 N端連接的N端結(jié)構(gòu)域，一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(功能仍不明確)及C端的RING(really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域。還含有特異性的酸性序列結(jié)構(gòu)域［3］。

X射線衍射晶體分析法明確了MDM2 N端與P53 N端主要通過(guò)疏水作用結(jié)合。P53疏水面的Phe19、Trp23和Leu26嵌入到 MDM2由13個(gè)氨基酸形成的疏水裂隙中，同時(shí)結(jié)合界面還有3處分子間的氫鍵相連以穩(wěn)定這種結(jié)合［4］。MDM4有10個(gè)疏水氨基酸與MDM2相同，形成的疏水裂隙與MDM2相似［5］。在MDM2 N端含有的一段“l(fā)id”序列也參與P53－MDM2的相互作用，這段序列在MDM4中完全不同，說(shuō)明MDM2和MDM4與P53的相互作用具有明顯差異。最近研究還發(fā)現(xiàn)，MDM2與P53 N端結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變，有利于穩(wěn)定MDM2的酸性序列結(jié)構(gòu)域與P53的DNA結(jié)合域結(jié)合［6］。MDM4是否有此作用仍不清楚。

C端的RING結(jié)構(gòu)域有利于MDM2和MDM4形成同源或異源二聚體［7］。MDM2的RING結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄銭3泛素蛋白連接酶活性十分重要，而MDM4沒(méi)有泛素酶活性。多種翻譯后修飾，包括磷酸化、乙?；?、寡聚化及泛素化可影響MDM2和MDM4的功能和穩(wěn)定性［8～10］。

二、MDM2和MDM4的生物學(xué)功能

在小鼠胚胎發(fā)育的研究中，敲除MDM2基因的胚胎在宮內(nèi)因激活P53依賴的細(xì)胞凋亡通路發(fā)生死亡;敲除MDM4基因的胚胎則因依賴P53的細(xì)胞增殖抑制而發(fā)生死亡，但若同時(shí)敲除P53基因，胚胎能正常發(fā)育［2］。表明MDM2和MDM4可以通過(guò)不同的方式負(fù)調(diào)控抑癌蛋白P53。

1.MDM2——泛素蛋白連接酶:MDM2 是 RING型泛素蛋白連接酶的重要成員之一，大約10%的人類腫瘤存在MDM2的異常擴(kuò)增或蛋白表達(dá)水平的增高而導(dǎo)致P53功能失活，MDM2是P53最重要的負(fù)調(diào)控分子之一。體外研究發(fā)現(xiàn)MDM2主要通過(guò)與P53直接結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄因子活性及促進(jìn)P53泛素化修飾和降解兩種途徑參與對(duì)P53的調(diào)節(jié)，同時(shí)MDM2基因也是P53介導(dǎo)的反式激活的靶基因，即形成MDM2 －P53 之間的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)［11，12］。

2.MDM4——多功能蛋白:MDM4不是 P53的靶基因，也不具有泛素蛋白酶活性，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)P53的活性發(fā)揮作用，與MDM2協(xié)同發(fā)揮其泛素蛋白酶活性［13］，也可通過(guò)依賴/不依賴MDM2增加和穩(wěn)定P53蛋白表達(dá)水平，這兩種完全相反的調(diào)節(jié)方式可能表明MDM4是一個(gè)多功能蛋白。缺失MDM4基因的小鼠較野生型小鼠的腫瘤發(fā)生率高。Mancini等［14，15］研究發(fā)現(xiàn)，位于線粒體內(nèi)的 MDM4對(duì) P53 發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用。降低MDM4蛋白水平使不同基因毒性(如UV、抗癌藥物等)引發(fā)的P53凋亡作用減弱，并且是不依賴P53轉(zhuǎn)錄活性。線粒體MDM4約為胞質(zhì)中的1/10，與Bcl－2結(jié)合，使Bcl－2錨定在線粒體外膜。在凋亡信號(hào)刺激下，線粒體MDM4穩(wěn)定地定位于線粒體內(nèi)，促進(jìn)P53 Ser46磷酸化，并與Bcl－2結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。但也有研究表明在分化成熟的神經(jīng)元中，MDM4發(fā)揮抗凋亡作用。這可能與P53線粒體凋亡途徑不是在所有細(xì)胞類型中存在有關(guān)［16］。目前也有學(xué)者認(rèn)為在不同的細(xì)胞狀態(tài)和損傷因素下，MDM4可能發(fā)揮不同的作用［17］。

3.P53－MDM2－MDM4調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò):體外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為MDM2和MDM4在功能上相互聯(lián)系，MDM4能穩(wěn)定MDM2的表達(dá)，MDM2有利于 MDM4的核轉(zhuǎn)位［18］。但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究則發(fā)現(xiàn)MDM2和MDM4對(duì)P53的調(diào)節(jié)具有不同的、互補(bǔ)的作用［19］。敲除小鼠P53基因中富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的P53△P蛋白對(duì)促細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的作用均較弱。這種突變小鼠能在敲除MDM4時(shí)存活，而在敲除MDM2時(shí)死亡。MDM4的缺失不影響MDM2的穩(wěn)定性，而是增強(qiáng)P53△P的轉(zhuǎn)錄活性，能部分恢復(fù)其抑制細(xì)胞增殖的活性，但同時(shí)也使MDM2的表達(dá)增加，最終使P53△P的降解增加。反之，MDM2的缺失使P53△P表達(dá)增加，但每分子單位的活性并未改變。因此，MDM2可能主要調(diào)節(jié)P53的穩(wěn)定性，MDM4調(diào)節(jié)P53的活性。同樣的研究結(jié)果也在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)發(fā)育的研究中觀察到［20］。MDM2和MDM4在CNS早期就有表達(dá)，敲除二者之一，可使胎鼠發(fā)生無(wú)腦或顱腦畸形，如二者同時(shí)敲除，則發(fā)生更早和更嚴(yán)重的顱腦畸形，而這些改變均可在P53敲除的條件下恢復(fù)。

DNA受損后啟動(dòng)P53途徑的前提是MDM2對(duì)自身和MDM4的降解。據(jù)此，Toledo等［21］提出了 P53損傷應(yīng)答的動(dòng)態(tài)模型。在正常細(xì)胞中，由于MDM2和MDM4的抑制作用，P53維持在較低水平;細(xì)胞受損后，MDM2對(duì)自身和MDM4的降解使P53的表達(dá)和活性開始增強(qiáng);P53的激活也使MDM2表達(dá)增加，進(jìn)一步降解MDM4，使P53充分激活;損傷因素消除后，累積的MDM2再次以P53為靶點(diǎn)發(fā)揮其泛素蛋白酶活性，MDM4表達(dá)也增加，P53活性下降。此模型中的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)如正常狀態(tài)下P53的降解及MDM2從自身降解到對(duì)P53降解的轉(zhuǎn)換，仍需進(jìn)一步研究。最近認(rèn)為皰疹病毒屬伴隨的泛素特異性的蛋白酶(HAUSP)可能在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。正常的細(xì)胞中，死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Daxx)、MDM2和HAUSP結(jié)合形成的復(fù)合物防止MDM2的自身降解，促使P53降解。而在細(xì)胞受損時(shí)復(fù)合物形成受阻，MDM2自身降解增加，P53 活性增強(qiáng)［22，23］。HAUSP 也能調(diào)節(jié)P53依賴的線粒體凋亡途徑。因此，HAUSP和Daxx是P53－MDM2－MDM4調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。

這個(gè)動(dòng)態(tài)模型在包括成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及HCT116和U2OS細(xì)胞系中也得到證實(shí)，說(shuō)明P53－MDM2－MDM4調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)存在于許多組織中，可能在不同的細(xì)胞分化期中有所差異［24］。

三、MDM2和MDM4拮抗劑的研發(fā)

超過(guò)50%的人類腫瘤表達(dá)野生型P53和擴(kuò)增的MDM2，由于P53信號(hào)通路的不正常調(diào)節(jié)，使其無(wú)法發(fā)揮正常的促凋亡和抑制細(xì)胞增殖的作用。因此，抑制P53與其負(fù)調(diào)控因子結(jié)合是一種很有應(yīng)用前景的抗腫瘤策略。

如前所述，P53疏水界面的氨基酸是與MDM2相互作用的關(guān)鍵，因此，目前針對(duì)MDM2－P53相互作用的化合物可分為:①M(fèi)DM2－P53相互作用的特異性阻斷劑;②采用類似P53結(jié)合界面的低分子化合物競(jìng)爭(zhēng)性抑制MDM2－P53的結(jié)合;③抑制MDM2泛素蛋白連接酶活性。其中順式咪唑啉類似物Nutlin－3a在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出較強(qiáng)的干擾MDM2－P53相互作用，并明顯抑制裸鼠骨肉瘤的生長(zhǎng)且對(duì)正常細(xì)胞毒不良反應(yīng)較?。?5，26］。

線粒體MDM4在腫瘤治療中可調(diào)節(jié)順鉑的反應(yīng)性，高表達(dá)MDM4的人類卵巢腫瘤對(duì)順鉑治療較低表達(dá)者療效好［14］。在某些有野生型P53表達(dá)的腫瘤中如乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)有MDM4基因擴(kuò)增，但在某些腫瘤中又可見下調(diào)的MDM4。因此，針對(duì)MDM4研發(fā)的藥物可能需要組織特異性。而且雖然P53－MDM2和P53－MDM4相互作用的結(jié)構(gòu)相似，但抑制P53－MDM2的化合物對(duì)P53－MDM4的拮抗作用很弱。聯(lián)合應(yīng)用Nutlin 3a和siRNA MDM4的腫瘤細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的P53活性［27，28］。

P53－MDM2－MDM4與細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA損傷、腫瘤發(fā)生均有密切關(guān)系，對(duì)其相互作用及功能調(diào)控的深入研究將有利于理解不同細(xì)胞狀態(tài)下促/抑凋亡的機(jī)制、診治由凋亡系統(tǒng)功能紊亂而引起的各種疾病。

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