豆渣菌糠淺盤(pán)發(fā)酵制備微小毛霉凝乳酶的研究

鄭恒光 陳君琛 湯葆莎 張炎灼

豆渣菌糠淺盤(pán)發(fā)酵制備微小毛霉凝乳酶的研究

鄭恒光 陳君琛 湯葆莎 張炎灼

(福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350003)

為考察將豆渣和金針菇菌糠這兩種廢棄資源應(yīng)用于微小毛霉凝乳酶固態(tài)淺盤(pán)發(fā)酵的效果，以醫(yī)用托盤(pán)作為發(fā)酵容器，以干燥后的豆渣菌糠1∶1(質(zhì)量比)混合物為培養(yǎng)基，以固液比1∶1(質(zhì)量比)加水潤(rùn)濕培養(yǎng)基，121℃滅菌冷卻后接種微小毛霉進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵72 h時(shí)，加水提取酶，將酶液進(jìn)行濃縮、鹽析、透析以及冷凍干燥后獲得凝乳酶粉末。結(jié)果顯示，以豆渣和菌糠混合物為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，其單位發(fā)酵面積最大產(chǎn)酶量可達(dá)到1 860 SU/cm2，略高于對(duì)照麥麩1 618 SU/cm2的發(fā)酵水平，這表明豆渣和菌糠混合物能夠替代麥麩用于微小毛霉凝乳酶的固體淺盤(pán)發(fā)酵。此外，酶提取液經(jīng)初步分離純化，可獲得凝乳活力為7 497 SU/mg、水解酶活為0．22 Ucas/mg、純度大于50%的凝乳酶粉末制劑。

豆渣 菌糠 凝乳酶 微小毛霉 固態(tài)淺盤(pán)發(fā)酵

豆渣廢棄資源的綜合利用是糧油加工行業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。已有不少研究表明，豆渣在發(fā)酵領(lǐng)域有可能得到應(yīng)用，這其中包括檸檬酸發(fā)酵［1］、酶制劑發(fā)酵［2］、抗生素發(fā)酵［3］、殼聚糖發(fā)酵［4］等。另一方面，凝乳酶是制作奶酪和凝乳型干酪素等牛奶深加工產(chǎn)品必不可少的生化制劑，是世界大宗工業(yè)酶制劑，其傳統(tǒng)來(lái)源是吃奶的小牛皺胃第四胃，現(xiàn)已大量被微生物凝乳酶替代。本研究利用微小毛霉(Mucor pusillus)將豆渣資源轉(zhuǎn)化為凝乳酶制劑，可為豆渣資源的利用提供新思路。

工廠化栽培金針菇的栽培料主要由木屑、麥麩、棉籽殼等成分組成，一般只出1潮菇，栽培結(jié)束后，盡管纖維素、半纖維素和木質(zhì)素被大量利用，但仍含有蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究前期的三角瓶固體發(fā)酵凝乳酶試驗(yàn)表明，在豆渣培養(yǎng)基中摻入一定數(shù)量的金針菇菌糠不僅可以阻止豆渣結(jié)團(tuán)，而且還能提高發(fā)酵酶活［5］。為了更加貼近生產(chǎn)實(shí)際，本文將在前期使用三角瓶進(jìn)行固體發(fā)酵的研究基礎(chǔ)上，改用醫(yī)用托盤(pán)模擬規(guī)模化固體淺盤(pán)發(fā)酵工藝，優(yōu)化參數(shù)，初步分離純化凝乳酶。

1 材料與方法

1．1 材料

豆渣:制作豆腐后的殘?jiān)?0℃烘干后低溫－20℃保存，其主要成分見(jiàn)表1。

金針菇菌糠:福州尖峰食用菌廠，60℃烘干后室溫保存，其主要成分見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵原料的化學(xué)成分分析(干基，%)

供試微小毛霉(Mucor pusillus)菌種:中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)為3．3445。

麥麩:福州市糧食市場(chǎng);考馬斯亮藍(lán)G－250、R－250染料:美國(guó)Sigma公司進(jìn)口分裝;酪蛋白:自制;其他試劑均為分析純。

1．2 主要設(shè)備

YX280B電熱手提高壓蒸汽消毒器:上海三申醫(yī)療器械有限公司;LHS－150SC恒溫恒濕箱:上海一恒科技有限公司;SW－CJ－2FD潔凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;GL10MD高速冷凍離心機(jī):湘儀離心機(jī)儀器有限公司;R205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海申生科技有限公司。

1．3 方法

1．3．1 化學(xué)成分分析方法

粗蛋白(凱氏定氮法):GB/T 5009．5—2003;粗脂肪(索氏抽提法):GB/T 5009．6—2003;粗纖維含量:GB/T 5009．10—2003;灰分:GB/T 5009．4—2003。

1．3．2 培養(yǎng)基配制

①PDA平板培養(yǎng)基。馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 自然。②對(duì)照麥麩發(fā)酵培養(yǎng)基。將麥麩和水以固液比1∶1(質(zhì)量比)均勻混合，平攤在醫(yī)用托盤(pán)上，加蓋后包裹4層紗布，121℃滅菌20 min，冷卻備用。③發(fā)酵試驗(yàn)組培養(yǎng)基配制。將干燥后的豆渣和干金針菇菌糠以1∶1(質(zhì)量比)比例混合，再以固液比1∶1(質(zhì)量比)加水混合，平攤在醫(yī)用托盤(pán)上，加蓋后包裹4層紗布，121℃滅菌20 min，冷卻備用。

1．3．3 接種及培養(yǎng)方法

①無(wú)菌條件下將少量無(wú)菌水加入到菌種試管斜面，用接種鏟刮出孢子，涂布于PDA平板，將平板置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)6 d。②無(wú)菌條件下往長(zhǎng)滿孢子的PDA平板加入10 mL無(wú)菌水，用接種鏟將孢子刮入水中，于顯微鏡下檢測(cè)孢子濃度，用無(wú)菌水將孢子懸浮液濃度稀釋到大約106個(gè)/mL，以2%體積將孢子懸浮液接種于上述盛裝于醫(yī)用托盤(pán)的滅菌培養(yǎng)基中，無(wú)菌操作將醫(yī)用托盤(pán)內(nèi)的培養(yǎng)料用接種鏟扒松，蓋上醫(yī)用托盤(pán)的蓋子，外層包裹4層紗布，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在35℃，相對(duì)濕度85%環(huán)境下靜止培養(yǎng)3 d。

1．3．4 酶提取

發(fā)酵結(jié)束后，從醫(yī)用托盤(pán)中取出培養(yǎng)基，以1∶10(體積比)加水，用組織搗碎機(jī)將加水后的培養(yǎng)基搗碎，放置0～4℃冰箱過(guò)夜，過(guò)濾提取液，檢測(cè)酶活力。

1．3．5 凝乳酶活檢測(cè)［6］

用0．01 mol/L的氯化鈣液配制10%脫脂奶粉液，此溶液配制后在室溫放置40 min以上使用，當(dāng)天使用有效，不宜冰箱放置。取5 mL 10%的脫脂奶粉液在35℃保溫10 min，加0．5 mL適當(dāng)稀釋的酶液(35℃保溫)，立即搖勻，開(kāi)始計(jì)時(shí)(凝乳時(shí)間控制在40～90 s)，并把試管傾斜45°以上。沿試管周旋轉(zhuǎn)，觀察壁上出現(xiàn)小顆粒為終點(diǎn)，記錄凝乳時(shí)間。依據(jù)Soxhlet酶活定義(SU)，SU=2 400/T ×5/0．5×D。式中:T為凝乳時(shí)間/s;D為稀釋倍數(shù)。

每g發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)生的酶活力(SU/g)=SU×V/g。式中:V為提取液體積，g為所用固體發(fā)酵培養(yǎng)基的克數(shù)。

1．3．6 單位發(fā)酵面積產(chǎn)酶量

計(jì)算公式為:單位發(fā)酵面積產(chǎn)酶量(SU/cm2)=醫(yī)用托盤(pán)單位面積裝料量(g/cm2)×每克發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)生的酶活力(SU/g)

1．3．7 水解酶活檢測(cè)［7］

使用pH 6．5磷酸緩沖液配制1 g/100 mL的酪蛋白溶液，取1．1 mL溶液加入4 mL離心管內(nèi)，再加入0．1 mL酶液，放入45℃水浴鍋中保溫2 min后加入1．8 mL質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，將離心管7 000×g離心20 min，取上清液測(cè)定280 nm吸光度，將1 min內(nèi)吸光度OD280nm=1所需酶量定義為1個(gè)單位水解酶活力，計(jì)算公式為:1 Ucas=OD280nm/2 min。

1．3．8 酶液中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定［8］

使用考馬斯亮藍(lán)G－250染料對(duì)酶液染色，以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)595 nm吸光度，計(jì)算蛋白含量。

1．3．9 凝乳酶鹽析曲線測(cè)定

取2 mL酶溶液加到4 mL離心管內(nèi)，加一定量的(NH4)2SO4或0℃乙醇使蛋白質(zhì)沉淀，7 000×g離心5 min后棄去上清液，往每支離心管中加入2 mL去離子水使用離心沉淀的蛋白質(zhì)重新溶解，檢測(cè)溶液酶活。以(NH4)2SO4或乙醇加入量為橫坐標(biāo)，以酶活為縱坐標(biāo)做圖，即為凝乳酶鹽析曲線。

1．3．10 凝膠電泳檢測(cè)凝乳酶純度［8］

采用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量化，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，染色劑為考馬斯亮藍(lán)R－250。

1．3．11 數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為2次平行試驗(yàn)的算術(shù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2．1 豆渣菌糠固體淺盤(pán)發(fā)酵工藝對(duì)產(chǎn)酶量的影響

豆渣菌渣1∶1(質(zhì)量比)混合固體淺盤(pán)發(fā)酵的單因素試驗(yàn)表明，最適發(fā)酵溫度為35℃、發(fā)酵天數(shù)為3 d、接種濃度≥106個(gè)/mL、接種量5%(體積比)，這些參數(shù)和前期三角瓶發(fā)酵結(jié)果［5］基本一致(數(shù)據(jù)略)。進(jìn)一步試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，固體淺盤(pán)發(fā)酵的裝料厚度對(duì)單位發(fā)酵面積產(chǎn)酶量具有較大的影響(圖1)。在低裝料量時(shí)(如:0．05 g/cm2時(shí))，單位面積產(chǎn)酶量高低次序?yàn)?對(duì)照麥麩＞對(duì)照豆渣＞豆渣+菌糠;而在高裝料量時(shí)(如:0．2 g/cm2時(shí))，單位面積產(chǎn)酶量高低次序則變成:豆渣+菌糠＞對(duì)照麥麩＞對(duì)照麥麩。其中，豆渣+菌糠組在裝料量為0．217 g/cm2時(shí)，最高單位發(fā)酵面積的產(chǎn)酶活力為1 860 SU/cm2，高于對(duì)照麥麩在裝料量為0．29 g/cm2時(shí)的1 618 SU/cm2的發(fā)酵水平。

圖1 淺盤(pán)發(fā)酵裝料厚度對(duì)單位發(fā)酵面積產(chǎn)酶量的影響

眾所周知，麥麩在發(fā)酵工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用，而豆渣在發(fā)酵中的應(yīng)用多數(shù)僅停留在研究層面上。豆渣含有大量的纖維，吸水性很強(qiáng)，容易結(jié)團(tuán)不利于發(fā)酵過(guò)程中通風(fēng)散熱。麥麩也含有一定量的纖維，但吸水性不如豆渣強(qiáng)，此外麥麩還含有10%的淀粉，因此，滅菌后的麥麩同樣存在結(jié)團(tuán)的問(wèn)題。豆渣中加入金針菇菌糠后，菌糠內(nèi)的大量木屑、麥麩和棉籽殼等不僅可以對(duì)豆渣培養(yǎng)基起到疏松的作用，而且其含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也能被微小毛霉利用，其單位面積產(chǎn)酶量超過(guò)了對(duì)照麥麩。這使得豆渣和菌糠這兩種廢棄資源都得到了較好的利用。

2．2 提取液濃縮工藝對(duì)凝乳酶活力的影響

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮酶提取液，濃縮至原體積的1/20需要耗時(shí)3～4 h。濃縮溫度越高越有利于水分蒸發(fā)，但過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致酶失活。由表2可見(jiàn)，在55℃下濃縮時(shí)，凝乳酶失去大部分酶活力，選擇52℃以下濃縮比較合適，該結(jié)果和參考文獻(xiàn)報(bào)道的微小毛霉凝乳酶變性溫度為55℃一致［9］。如使用膜過(guò)濾設(shè)備，可先采用微濾膜除去酶液中的孢子和雜質(zhì)，再用超濾膜截留濃縮，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或薄膜蒸發(fā)器對(duì)黏稠液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，這樣不僅可以加快濃縮速度，降低能耗，還可以縮短凝乳酶在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)受熱時(shí)間，減少酶活力損失。

表2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度對(duì)凝乳酶活力的影響

2．3 凝乳酶分離純化方法研究

微小毛霉具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用能力，它可利用豆渣和菌糠中的纖維素為發(fā)酵碳源，但其發(fā)酵產(chǎn)物成分復(fù)雜，含有可溶性多糖、纖維素酶、蛋白水解酶、脂肪酶等多種成分。其中，蛋白水解酶會(huì)分解乳蛋白產(chǎn)生苦味肽，使奶酪?guī)в锌辔?。此外，發(fā)酵產(chǎn)物中還可能含有危害健康的成分。因此，粗酶液的分離純化步驟顯得十分必要。

(NH4)2SO4和乙醇分級(jí)鹽析是初步純化蛋白質(zhì)的常用方法。依據(jù)(NH4)2SO4沉淀效果(圖2)，將酶濃縮液預(yù)冷到0℃，加入(NH4)2SO4固體，使酶液飽和度達(dá)到20%，5 000 r/min—10 min—0℃離心后收集上清液，再加入(NH4)2SO4固體使溶液飽和度由20%上升至70%，5 000 r/min—10 min—0℃離心后收集沉淀即為凝乳酶純化樣品。對(duì)于乙醇沉淀，根據(jù)其沉淀效果(圖3)，先加入0．8體積預(yù)冷到0℃的95%乙醇，5 000 r/min—10 min—0℃離心后棄去沉淀，然后再向上清液中加入0．6倍體積的0℃、95%乙醇，5 000 r/min—10 min—0℃離心后收集沉淀，采用0℃去離子水重新溶解沉淀，透析、冷凍干燥后成為凝乳酶粉末。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酶提取液(NH4)2SO4沉淀除去了大量的可溶性多糖，再經(jīng)過(guò)乙醇沉淀除去了大量深色物質(zhì)，同時(shí)乙醇沉淀還使發(fā)酵和菌糠帶來(lái)的異味幾乎完全脫除。

從表3可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)兩步沉淀后，凝乳酶得率為61．2%，凝乳酶比活由1 250 SU/mg提高到4 297 SU/mg，提高了3．4 倍，而水解活力從0．934 Ucas/mg下降到0．22 Ucas/mg。由參考文獻(xiàn)［10］可知，純微小毛霉凝乳酶的酶活力為8 800 SU/mg，據(jù)此可推算出本試驗(yàn)制備的凝乳酶純度為48．8%，該數(shù)值和電泳分析結(jié)果基本一致(圖4)。從圖4中還可以看出，粗酶提取液中凝乳酶占總蛋白質(zhì)的比例還不到20%(泳道2)，而純化后凝乳酶的純度得到大幅度提高，達(dá)到50%以上(泳道4)。豆渣中的蛋白質(zhì)7S及11S等組分基本沒(méi)有出現(xiàn)在酶提取液中，這說(shuō)明豆渣中的蛋白質(zhì)幾乎被微小毛霉高效轉(zhuǎn)化利用。菌糠中可溶性蛋白質(zhì)較少，電泳圖譜中幾乎檢測(cè)不到蛋白質(zhì)(泳道3)。

表3 微小毛霉凝乳酶的純化結(jié)果

圖4 豆渣、粗酶提取液、菌糠以及凝乳酶純化樣品的電泳圖

3 結(jié)論

濕豆渣容易結(jié)團(tuán)，因而不能直接用于固體淺盤(pán)發(fā)酵。豆渣中若以1∶1(質(zhì)量比)比例摻入金針菇菌糠，則其淺盤(pán)發(fā)酵性能得到明顯改善，最高單位面積產(chǎn)酶量可達(dá)到1 860 SU/cm2，超過(guò)對(duì)照麥麩1 618 SU/cm2的發(fā)酵水平。凝乳酶提取液濃縮后再經(jīng)過(guò)(NH4)2SO4和乙醇兩步驟分級(jí)沉淀，純度提高了3．4倍，達(dá)到48．8%，凝乳活力也提高到4 297 SU/mg，水解酶活力則由0．93 Ucas/mg降至 0．22 Ucas/mg，并且還去除了大量可溶性多糖和其他雜質(zhì)，使凝乳酶的氣味和食品安全性得到了提高，顯示了豆渣和菌糠資源在發(fā)酵轉(zhuǎn)化凝乳酶方面具有應(yīng)用前景。

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Study on Shallow Tray Fermentation for Fine Mucor Pusillus and Rennin with Bean Dregs and Germ Bran

Zheng Hengguang Chen Junchen Tang Baosha Zhang Yanzhuo
(Research Institute of Agri－ e ngineering Tech－nology，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350003)

In order to investigate the effect of the solid－state shallow tray fermination for fine mucor pusillus and rennin with bean dregs and Flammulina velutiper(Fr．)sing germ bran，a medical tray was used as a fermentation container，and the dried mixture of bead dregs and germ bran［1∶1(w∶w)］was used as a culture medium，which was wetted with water(the ratio between the solid and liquid was 1∶1，namely w∶w)．Then prepared culture medium was sterilized by virtue of a high temperature hitting 121℃ After the sterilization and cold－down，the prepared culture medium was inoculated with strains of fine Mucor pusillus for a 72－h(huán)our fermentation．Then water was added and enzyme was extracted and rennet powder was prepared after steps of concentration，salting out，dialysis and freeze drying．The result showed that the highest enzyme yield of each unit area reached 1 860 SU/cm2when the mixture of bean dregs and germ bran were used as culture medium．This yield value is a litter higher than that of the wheat bran group(1 618 SU/cm2)，which indicated that the mixture of beandregs and germ bran was promising as the wheat bran substitute in shallow tray fermentation of fine Mucor and rennet．In addition，after preliminary separation and purification，a rennet powder which had a milk－ clotting activity of 7 497 SU/mg，hydrolase activity of 0．22 Ucas/mg and purity over 50%was obtained．

bean dregs，germ bran，rennin，fine Mucor pusillus，solid－state shallow tray fermentation

TS214．2

A

1003－0174(2011)12－0088－05

福建省公益類科研院所專項(xiàng)(2010R1017－1)，福建農(nóng)科院“食品科學(xué)”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)基金(STIF－Y05)

2010－03－14

鄭恒光，男，1970年出生，助理研究員，糧食、油脂及植物蛋白工程

陳君琛，男，1959年出生，研究員，植物保護(hù)