干酪用牛凝乳酶替代品的研究進(jìn)展*

普燕，張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆烏魯木齊，830046)

凝乳酶(milk clotting enzyme，MCE)，廣義上講是指能使乳液凝固的一類酶，被廣泛用于干酪加工初期的凝乳過程。凝乳酶由于來源不同，為了便于區(qū)分，進(jìn)行如下定義:狹義上的凝乳酶(EC3.4.23.4)稱為chymosin，表示由哺乳動物體內(nèi)chymosin基因表達(dá)出的凝乳酶。從新生小動物(皺)胃中提取的天然的具有凝乳功能并用于干酪生產(chǎn)的酶制劑稱為rennet或皺胃酶粗提物，它的成分主要包括chymosin和胃蛋白酶，其中chymosin的含量約占50% ～95%［1］，這因不同提取純化工藝乃至提取動物年齡不同而有所差異，隨著純化工藝技術(shù)的革新，一般chymosin可達(dá)90%以上［2］。有很多來自植物和微生物的蛋白酶也具有凝乳功能，這些酶被稱為植物凝乳酶(plant coagulant，PC)和微生物(microbial coagulant，MC)(除特殊說明外，文中凝乳酶僅指chymosin)。

凝乳酶(chymosin)由未斷奶哺乳動物胃粘膜基底腺細(xì)胞分泌，起初是酶原(prochymosin)形式，沒有活性，在胃酸的酸性環(huán)境中，能夠自剪切形成有活性的成熟凝乳酶［2］，有效地凝固乳液，這對新生小動物是非常關(guān)鍵的，凝固的乳液可以在消化道存留更長的時間，有利于小動物對母乳營養(yǎng)的充分吸收［2］。凝乳酶能特異切割乳液中的κ酪蛋白肽鏈的Phe105和Met106 之間的肽鍵［1，2］，導(dǎo)致乳液中酪蛋白顆粒凝聚沉淀。利用其這一特性，凝乳酶很早就被應(yīng)用到干酪的制備中。凝乳酶一般具有高凝乳活性(clotting activity)和低非特異蛋白水解活性(nonspecific protease activity)，二者比率稱為c/p值，是評價凝乳酶制備干酪品質(zhì)優(yōu)劣的常用指標(biāo)，因為高c/p可以得到較高的干酪出品率，同時，蛋白水解活性也對干酪成熟期質(zhì)地和風(fēng)味的形成有重要影響。牛凝乳酶因為其有較高的c/p值以及制備干酪的品質(zhì)優(yōu)良［3］，一直以來被認(rèn)為是制備干酪的最佳凝乳酶。隨著干酪市場的增長，小牛rennet供應(yīng)不足，小牛凝乳酶的替代品應(yīng)運而生。這些替代品包括其他動物rennet、植物凝乳酶、微生物凝乳酶和重組凝乳酶(recombinant chymosin)。

本文著重從凝乳酶的結(jié)構(gòu)研究、重組凝乳酶的克隆、表達(dá)量和種類、植物與微生物凝乳酶在干酪加工中的應(yīng)用等方面闡述干酪用牛凝乳酶替代品的研究進(jìn)展。

1 凝乳酶的結(jié)構(gòu)研究

1.1 凝乳酶的結(jié)構(gòu)

目前已經(jīng)得到了凝乳酶的晶體結(jié)構(gòu)［4］。凝乳酶共含有323個氨基酸，1-175位和176-323位分別折疊成凝乳酶N端和C端兩個結(jié)構(gòu)域，其間通過氫鍵作用使凝乳酶整體構(gòu)成一個雙葉型的結(jié)構(gòu)，兩片葉瓣中央是酶與底物結(jié)合的裂隙，行使催化功能的兩個天冬氨酸Asp34和Asp216位于裂縫中間［4-5］。

1.2 凝乳酶原的活化

凝乳酶在體內(nèi)首先是合成凝乳酶原前體(pre-prochymosin)，以牛凝乳酶原前體為例，其編碼381個AA，N端的16個AA為信號肽，當(dāng)酶被分泌到胃中，該信號肽則被剪切除去，形成沒有活性的凝乳酶原。凝乳酶原包含365個AA，分子量為40.777 kDa。凝乳酶原在胃的酸性環(huán)境下，發(fā)生構(gòu)象改變并自剪切形成有活性的凝乳酶，同時釋放N端42個AA(被稱為激活片段，activation segment或propeptide)，故最后成熟的凝乳酶含有323個AA，分子量為35.6 kDa［2］。

目前認(rèn)為凝乳酶原的活化過程為:propeptide與酶的活性位點以靜電作用結(jié)合，propeptide的存在阻止了底物進(jìn)入酶活性中心，故酶原在中性環(huán)境中不具有催化作用;當(dāng)pH降低，propeptide與酶活性中心的靜電作用被破壞，此時propeptide的構(gòu)象發(fā)生改變，酶原的自剪切位點暴露并與酶活性中心結(jié)合，酶對該位點進(jìn)行切割，propeptide從酶活性中心解離，酶的N端發(fā)生構(gòu)象改變，形成一個反式β折疊位于底物與酶結(jié)合的裂隙處［6］。同時，Christensen 等［7］還發(fā)現(xiàn)酶原激活既可以是分子內(nèi)的，也可以是分子間的。

1.3 凝乳酶的進(jìn)化

凝乳酶本質(zhì)是一種胃消化酶，與其他胃消化酶都是以酶原的形式分泌，在胃液的酸性環(huán)境下自剪切形成有活性的酶。根據(jù)已測序確定的胃消化酶核酸序列分析得出:不同的消化酶均來自同一天冬氨酸蛋白酶祖先，胃亞蛋白酶原首先分化出來，然后是凝乳酶原，胃蛋白酶原A和胃蛋白酶原F親緣較近［8］。

根據(jù)genbank公布的動物凝乳酶氨基酸序列，利用MEGA4.0軟件構(gòu)建凝乳酶系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖1，可以看出凝乳酶的進(jìn)化與傳統(tǒng)的動物分類學(xué)極其吻合。

2 重組凝乳酶

重組凝乳酶(recombinant chymosin)，也被稱為發(fā)酵生產(chǎn)的凝乳酶(fermentation produced chymosin，F(xiàn)PC)，其過程是分離獲得動物凝乳酶mRNA，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，將其構(gòu)建到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化宿主進(jìn)行表達(dá)，再經(jīng)酶原活化和純化獲得有活性的重組凝乳酶。

美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)通過全面審查發(fā)表的文獻(xiàn)資料得出結(jié)論，大腸桿菌K-12表達(dá)的重組牛凝乳酶與天然凝乳酶在組分與純度方面沒有差異［2］，從而該酶成為第1個被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于食品的重組酶［9］。現(xiàn)在已有3個重組牛凝乳酶符合美國食品藥品管理局條例并認(rèn)為是安全(GRAS)的被用于干酪生產(chǎn)，它們是 Escherichia coli K-12(大腸桿菌 K-12)、kluyveromyces marxianus var.lactis(馬克斯克魯維酵母變種)和Aspergillus niger(黑曲霉)表達(dá)的重組牛凝乳酶［9］。目前，這些酶由美國輝瑞(Pfizer)、荷蘭帝斯曼食品配料部(DSM Food Specialties)、丹麥科漢森(Chr.Hansen)等公司生產(chǎn)。重組凝乳酶比較其他小牛凝乳酶的替代品有這樣一些優(yōu)勢:蛋白水解活性低、凝乳過程的可預(yù)測性、符合猶太教規(guī)、受到素食主義者歡迎、符合宗教情感和動物權(quán)益的保護(hù)，且重組凝乳酶的純度高(含100%凝乳酶)，產(chǎn)量高［2］，故重組凝乳酶已經(jīng)成為小牛rennet最佳替代品。

因為小牛rennet制作干酪品質(zhì)優(yōu)良且有一定傳統(tǒng)，利用基因工程手段生產(chǎn)的動物凝乳酶首先是從克隆表達(dá)小牛凝乳酶開始。其研究廣泛，積累了很多蛋白表達(dá)的經(jīng)驗，雖然重組牛凝乳酶已經(jīng)生產(chǎn)上市二十余年，但關(guān)于重組牛凝乳酶的表達(dá)一直沒有停止，選用新宿主、新表達(dá)載體、優(yōu)化培養(yǎng)基、突變宿主菌基因、融合蛋白表達(dá)等表達(dá)方法的研究，不僅提高了重組牛凝乳酶的表達(dá)量，同時也改進(jìn)了異源蛋白表達(dá)方法，對異源蛋白的高水平表達(dá)提供了有效的參考。

2.1 重組牛凝乳酶的表達(dá)研究

2.1.1 原核表達(dá)

Emtage等［10］利用大腸桿菌表達(dá)牛凝乳酶原，酶原以包涵體表達(dá)，占總菌蛋白的1% ～5%，通過溶解復(fù)性和激活步驟，最終獲得有活性的成熟的凝乳酶。小牛凝乳酶由此成為第一個通過原核表達(dá)并純化獲得的有活性的真核生物蛋白。Tichy等［11］提出了從包涵體中回收高產(chǎn)量有活性重組凝乳酶的最優(yōu)方案:包涵體用8 mol/L尿素(pH10.4)溶解，并放置31℃1 h。同時，如果要讓重組凝乳酶原正確復(fù)性，復(fù)性液中最終的尿素濃度不得超過0.32 mol/L，以及蛋白含量不超過0.275 mg/mL。這樣的溶解和復(fù)性條件可以使成熟凝乳酶的產(chǎn)量比其他方法獲得的產(chǎn)量提高8倍多。關(guān)于大腸桿菌中表達(dá)重組牛凝乳酶原的復(fù)性與純化方法還可以參見專利［12-13］。

2.1.2 真核表達(dá)

凝乳酶是真核生物基因，選用真核表達(dá)系統(tǒng)也獲得了有活性的重組牛凝乳酶，并且酶原以分泌形式表達(dá)，有的酶原分泌后自剪切形成有活性的凝乳酶，無需后續(xù)的活化處理。目前已經(jīng)成功表達(dá)出具活性的重組牛凝乳酶真核表達(dá)系統(tǒng)的有:釀酒酵母［14］、畢赤酵母［15-16］、克魯維酵母［17-18］、黑曲霉［19-20］、米黑根毛霉［21］、米曲霉［22-25］、泡盛曲霉［26-27］乃至轉(zhuǎn)基因羊的羊乳［28-29］。

圖1 動物凝乳酶基因序列進(jìn)化樹Fig.1 The evolutionary tree of the chymosin gene

Ward等［26］將牛凝乳酶融合到葡糖糖化酶(glucoamylase)的C端，在泡盛曲霉中表達(dá)，提高了凝乳酶的分泌量。同時融合蛋白分泌后自動剪切形成有活性的成熟凝乳酶。Tsuchiya等［22］用米曲霉絲狀真菌(Aspergillus oryzae)表達(dá)小牛凝乳酶原時，從上清液中獲得分泌的有活性凝乳酶，酶原自激活產(chǎn)生凝乳酶，產(chǎn)量為0.07 ～0.16 mg/L。Tsuchiya等［23］融合葡萄糖化酶到酶原N端，提高了小牛凝乳酶的分泌量。深層培養(yǎng)，融合有葡萄糖化酶(1-511位氨基酸)的牛凝乳酶原比較凝乳酶原基因直接構(gòu)建到glaA啟動子下游的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菌，牛凝乳酶的產(chǎn)量高出4倍。使用小麥麩固體培養(yǎng)系統(tǒng)比深層培養(yǎng)牛凝乳酶產(chǎn)量高500倍，可達(dá)150 mg/kg麥麩。Ohno等［24］在牛凝乳酶基因前融合1個內(nèi)源絲狀真菌分泌蛋白α-淀粉酶(α-amylase)作為運載體(carrier)，在米曲霉宿主中表達(dá)，結(jié)果牛凝乳酶的表達(dá)量約為對照的2倍?；蛐酒@示運載體的融合顯著上調(diào)了有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊和分泌的基因。

Mariani等［21］用米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)NRRL 3169表達(dá)重組牛凝乳酶，經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)條件，產(chǎn)量在168 h時達(dá)884 SU/mL，若機械攪動發(fā)酵罐，產(chǎn)量最高達(dá)1 160 SU/mL。

Harmsen等［14］在釀酒酵母中共表達(dá)凝乳酶識別的美洲駝單域抗體片段，刺激牛凝乳酶的分泌量增加了1.5～6倍。Kosalková等［27］用泡盛曲霉分泌表達(dá)凝乳酶時，在培養(yǎng)基中添加酪蛋白或酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，CPPs)，可以使凝乳酶的分泌量提高40到80倍，可能是CPPs造成了細(xì)胞代謝基因的重排，從而導(dǎo)致胞外蛋白的大量分泌。

Bodie［19］通過準(zhǔn)性重組提高黑曲霉(Aspergillus niger var.Awamori)凝乳酶表達(dá)量。van den Brink［20］通過糖基化提高凝乳酶在黑曲霉中的產(chǎn)量。在凝乳酶內(nèi)部糖基化，產(chǎn)量可提高1倍，在凝乳酶分子外部糖基化也提高了重組凝乳酶的產(chǎn)量。

Yoon等［25］通過缺陷絲狀真菌米曲霉的自噬基因從而提高牛凝乳酶的表達(dá)量3倍多。但是由于自噬基因缺陷導(dǎo)致分生孢子的產(chǎn)量降低，而分生孢子是大規(guī)模接種必需的，故作者構(gòu)建了1個條件缺陷自噬基因的菌株。該菌株的自噬基因啟動子區(qū)被替換為硫胺素控制的thiA啟動子。缺乏硫胺素時，分生孢子產(chǎn)生量明顯增加，當(dāng)存在硫胺素時，自噬基因被抑制，表現(xiàn)出凝乳酶產(chǎn)量的增加，這種調(diào)控自噬基因的方法能有效提高外源蛋白在米曲霉中的表達(dá)。

ZHANG等［15］第 1次在畢赤酵母中利用pPICZαA表達(dá)載體表達(dá)牛凝乳酶原，并獲得有活性的培養(yǎng)上清，活性為 12.2 SU/mL。Noseda等［16］將密碼子優(yōu)化的牛凝乳酶原序列構(gòu)建到pIC9K表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中表達(dá)，通過優(yōu)化表達(dá)條件，發(fā)酵可得到240 g/L菌體干重，凝乳酶(直接分泌出有活性的凝乳酶，無需激活)量為53 mg/L(甲醇誘導(dǎo)表達(dá)120 h)。通過3kDa的超濾和高效凝膠過濾層析純化，最終總活力回收率為56%。純化過程中出現(xiàn)酶活力提高的情況，被推測是去除了凝乳酶的假定的抑制劑或蛋白酶。FENG等［17］用克魯維酵母GG799表達(dá)重組牛凝乳酶，酶活達(dá)80 U/mL，對密碼子進(jìn)行優(yōu)化后，凝乳酶的產(chǎn)量提高了7倍多，達(dá)到575 U/mL。FENG［18］等通過將克魯維酵母 GG799中的PMR1基因致缺陷，使酵母分泌的凝乳酶產(chǎn)量提高，活性從80 U/mL提高到496 U/mL。

2.1.3 轉(zhuǎn)基因羊乳

Mezina等［28］用離子交換層析和生物親和層析分離轉(zhuǎn)基因羊乳中的牛凝乳酶，獲得了均質(zhì)有活性的凝乳酶，從氨基酸組成、分子量、pH值的穩(wěn)定性、蛋白底物的催化活性等方面進(jìn)行分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因羊乳中提取的牛凝乳酶與天然牛凝乳酶相同。Starovoitova等［29］檢測轉(zhuǎn)基因羊乳中提取的牛凝乳酶和克魯維酵母表達(dá)的重組牛凝乳酶催化熒光底物的情況，發(fā)現(xiàn)二者對低分子量的底物催化情況不同，但對蛋白底物的催化無差別。同時Pepstain抑制重組凝乳酶要比抑制天然凝乳酶效率低。

2.2 其他動物重組凝乳酶的表達(dá)研究

一般干酪加工原料牛乳居多，也有水牛乳、羊乳和駝乳等，故選擇水牛、羊、駱駝這些動物的凝乳酶進(jìn)行研究，一方面用于這些動物乳的干酪制作，另一方面，這些動物在系統(tǒng)分類學(xué)上與牛有比較近的親緣關(guān)系(從圖1也可看出)，可能會對牛乳有較好的凝固作用。

2.2.1 重組綿羊凝乳酶

Rogelj等［30］表達(dá)獲得了重組綿羊凝乳酶，同時與商品化重組牛凝乳酶、牛rennet和微生物凝乳酶比較凝乳活性和蛋白水解活力。結(jié)果:4種酶對pH反應(yīng)相似，最適凝乳溫度為重組綿羊凝乳酶為40℃，牛rennet和重組牛凝乳酶為45℃，微生物凝乳酶為60℃。水解活性比較，重組綿羊凝乳酶低于牛rennet，與重組牛凝乳酶無顯著差別。重組綿羊凝乳酶低蛋白水解活性沒有對干酪的感官特性產(chǎn)生負(fù)面影響，總體上看重組綿羊凝乳酶制備干酪至少比得上重組牛凝乳酶制備干酪，同時這兩種干酪又比牛rennet制備干酪得分高。

2.2.2 重組山羊凝乳酶

Vega-Hernández等［31］從小山羊的皺胃中克隆獲得了山羊凝乳酶原前體序列，并對序列進(jìn)行了鑒定，用克魯維酵母和釀酒酵母表達(dá)山羊凝乳酶原，經(jīng)體外酸化激活后有凝乳活性，且山羊凝乳酶能特異水解牛乳κ-酪蛋白。Eskandari等［32］同樣從小山羊的皺胃中克隆獲得了山羊凝乳酶原前體序列，并與其他學(xué)者克隆的序列進(jìn)行了比較。將山羊凝乳酶原cDNA克隆到pET28a上(表達(dá)的凝乳酶原帶his或不帶his標(biāo)簽)，在大腸桿菌中表達(dá)，酶原以包涵體形式表達(dá)，再通過后續(xù)的復(fù)性與激活，獲得有活性的重組山羊凝乳酶。這些原核表達(dá)復(fù)性與激活的過程與重組牛凝乳酶相似。作者還發(fā)現(xiàn)，帶his標(biāo)簽的酶原與不帶his標(biāo)簽酶原激活后的凝乳酶凝乳活力分別為416 U/mg和192 U/mg，可能是his標(biāo)簽影響了propeptide的電荷以及propeptide與酶之間的靜電作用，從而導(dǎo)致酶的折疊與活性的改變。

Vallejo等［33］比較了4種重組凝乳酶的酶學(xué)特性——牛、水牛、山羊和駱駝重組凝乳酶，認(rèn)為山羊重組凝乳酶最適合替代牛凝乳酶用于干酪工業(yè)，原因是其幾乎不被糖基化，在不同的pH條件下都能保留高的凝乳活力，同時該酶是這4種重組凝乳酶中催化效率最高且對牛κ-酪蛋白作用最特異的酶［33］。

2.2.3 重組水牛凝乳酶

Vallejo等［34］從哺乳小水牛的皺胃中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得凝乳酶原前體、凝乳酶原和凝乳酶的DNA序列，將這3條序列都克隆到pGAPZαA表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中表達(dá)，只有克隆了酶原的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母上清獲得了有活性的酶，且無需體外激活處理。同時表達(dá)的凝乳酶條帶在40和36 kDa處，用糖類內(nèi)切酶H(endoglycosidase H)處理，轉(zhuǎn)變?yōu)?6 kDa單一條帶，說明40 kDa是凝乳酶的糖基化形式。重組水牛凝乳酶的最適pH為4.5，最適作用溫度為37℃。Vallejo等認(rèn)為該畢赤酵母直接分泌表達(dá)出有活性的凝乳酶而無需后續(xù)的活化步驟，故該重組菌是干酪工業(yè)極好的候選重組凝乳酶的生產(chǎn)菌株。

2.2.4 重組駱駝凝乳酶

2006年，Kappeler等［3］首次從單峰駝(Camelus dromedarius)體內(nèi)克隆了凝乳酶基因序列，將凝乳酶原序列克隆到表達(dá)載體上轉(zhuǎn)入黑曲霉(Aspergillus niger)中表達(dá)，獲得的蛋白用N端測序證明蛋白長度和N端的G均與牛凝乳酶相同，SDS-PAGE電泳顯示分子量為40 kDa和少量36 kDa蛋白，說明該酶主要是糖基化形式。比較重組駱駝凝乳酶和重組牛凝乳酶，發(fā)現(xiàn)駱駝凝乳酶對牛乳的凝乳活力比牛凝乳酶高70%，但非特異蛋白水解活力才相當(dāng)于牛凝乳酶的20%，計算得出駱駝凝乳酶的c/p值是牛凝乳酶的7倍。

至此，駱駝凝乳酶是第一個被發(fā)現(xiàn)凝乳活力比牛凝乳酶高而蛋白水解活力比牛凝乳酶低的動物凝乳酶，故用駱駝凝乳酶制備干酪以及關(guān)于駱駝凝乳酶與底物的結(jié)合研究受到關(guān)注。目前重組駱駝凝乳酶已經(jīng)上市出售，成為牛凝乳酶的成功替代品。

3 植物和微生物凝乳酶

一般認(rèn)為植物凝乳酶和微生物凝乳酶的蛋白水解活性比牛凝乳酶高，故用于干酪制作可能導(dǎo)致過度水解使得干酪出品率低，質(zhì)地較差，甚至產(chǎn)生苦味。但是利用蛋白水解活性高的特點，研究發(fā)現(xiàn)有些酶可以添加到干酪中作為促熟劑，甚至可以對苦味肽進(jìn)行降解，同時有些酶還可以用于新乳品的開發(fā)或進(jìn)行干酪的固定化生產(chǎn)。

3.1 干酪促熟

JIANG等［35］在糯米酒中通過離子交換層析分離出一種類rennet酶(rennet-like enzyme)，研究其對乳酪蛋白、乳清蛋白的水解特性以及對 κ-、β-、α-酪蛋白的作用肽鍵，發(fā)現(xiàn)α-酪蛋白幾乎完全降解，而κ-、β-酪蛋白在12 h后仍部分降解，檢測發(fā)現(xiàn)該酶作用κ-酪蛋白的Thr94-Met95，不同于大多數(shù)凝乳酶作用的 Phe105-Met106。Jiang等［36］分析其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該酒rennet為無糖基化的單體，N端測序顯示與其他真菌凝乳酶有較高程度的相似性，其對氧化型牛胰島素B鏈(oxidized insulin B chain)的切割位點與毛霉菌凝乳酶(Mucor rennet)相似，與牛凝乳酶不同。比較酒rennet、牛凝乳酶和毛霉菌凝乳酶水解牛酪蛋白的作用情況，凝乳效果相似，但速率不同。在pH6.5，40℃時，酒rennet比其他兩種酶有更強的降解作用，因此，酒rennet可能作為小牛凝乳酶的輔劑或干酪成熟的促熟劑。

An等［37］用從解淀粉芽孢桿菌中提出的微生物凝乳酶和牛rennet制作微型切達(dá)干酪并進(jìn)行比較，除了pH，大體成分二者沒有差別。干酪成熟40 d和60 d檢測，牛rennet制作干酪的pH高，而微生物凝乳酶制作干酪的pH4.6可溶性氮高。兩種干酪的12%TCA可溶性氮含量相似。檢測乙醇可溶和不溶組分，微生物凝乳酶制備干酪的疏水/親水殘基的比率低，且質(zhì)地更軟，故桿菌凝乳酶有更高的蛋白水解率，能縮短干酪成熟時間。

Abellan等［38］用植物凝乳酶——朝鮮薊的提取物cyprosins替代動物凝乳酶來制作傳統(tǒng)西班牙和葡萄牙干酪，發(fā)現(xiàn)其可以提高成熟期的游離脂肪酸的含量，作者建議可以利用cyprosins在成熟期的高水解活性來加速Murcia al Vino羊乳干酪的成熟。

Mazorra-Manzano等［39］比較獼猴桃、甜瓜和生姜的提取物制作新鮮干酪的情況，結(jié)果顯示獼猴桃提取物制備的凝乳與商業(yè)化rennet制作的凝乳特性最相似，甜瓜提取物制作的凝乳質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)都很低，可能與其高水解活性以及低c/p值有關(guān)，不適合做新鮮干酪，但是它制備的凝乳具有柔軟似冰激凌的質(zhì)地，也許可以作為一種凝乳劑用于制備其他干酪，如奶油乳酪，或者用于開發(fā)新質(zhì)地的乳制品。

3.2 降低苦味

Rossano［40］等從亞得里亞海南部的甲殼動物(crustaceans)——刺鎧蝦屬(Munida)的肝胰腺提取的消化酶具有酪蛋白水解活性。該類酶包括幾種近似異胰蛋白酶(isotrypsin-like)、異胰凝乳酶蛋白酶(isochymotrypsin-like)以及氨肽酶、羧肽酶 A和 B。這些消化酶能降解β-酪蛋白來源的 f193-209肽，而該肽被認(rèn)為與干酪中的苦味相關(guān)，揭示其有潛力應(yīng)用到某些干酪工藝中以降低苦味。該酶來源充足，同時從深海動物中提取，具有低溫活性，故用于食品工業(yè)能避免細(xì)菌污染和有害的化學(xué)反應(yīng)［41］。

3.3 酶的固定

Pessela等［42］研究凝乳酶的固定化，其基于米黑毛霉(Mucor miehei)凝乳酶的糖鏈將酶共價連接到支持物上，該糖鏈作為天然的間隔臂，使凝乳酶保持較高活力，對小分子量底物(H-Leu-Ser-p-nitro-Phe-Nle-Ala-Leu-OMe)的切割效率為98%，對大分子量底物(κ-酪蛋白)的切割效率為78%。控制酶切反應(yīng)在4℃進(jìn)行，此時水解的酪蛋白不會沉淀，可以防止乳與酶未分離就凝固，再將水解乳液過濾，加熱到30℃，能得到相似于可溶rennet凝乳產(chǎn)生的凝乳塊。

4 展望

干酪市場的增長不斷推進(jìn)牛凝乳酶替代品的研發(fā)，同時這些酶的研究也促進(jìn)了干酪工業(yè)的進(jìn)步。例如，重組牛凝乳酶的高純度使得用其制備的干酪質(zhì)地比牛rennet更優(yōu)良;隨之發(fā)現(xiàn)重組駱駝凝乳酶，c/p比牛凝乳酶更高，制備干酪苦味更少，已經(jīng)用于低脂干酪的質(zhì)地與風(fēng)味改進(jìn)研究［43-46］;一些植物凝乳酶和微生物凝乳酶雖然不能替代牛凝乳酶，但是可以作為牛凝乳酶的輔劑或干酪的促熟劑，甚至有些可以用于開發(fā)新乳制品。

利用基因突變或蛋白質(zhì)工程手段可以對牛凝乳酶進(jìn)行人為改造，比如改變酶催化的最適pH［47-48］、改變酶的激活模式［49］，還可以改變底物與酶結(jié)合的親和力等［50］，使酶的特性更適合制備品質(zhì)優(yōu)良的干酪或乳制品。

［1］ Jacob M，Jaros D，Rohm H.Recent advances in milk clotting enzymes［J］.International Journal of Dairy Technology，2011，64(1):14-33.

［2］ Kumar A，Grover S，Sharma J，et al.Chymosin and other milk coagulants:sources and biotechnological interventions［J］.Critical Reviews in Biotechnology，2010，30(4):243-258.

［3］ Kappeler S R，van den Brink H M，Rahbek-Nielsen H，et al.Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，342:647-654.

［4］ Jensen J L，M?lgaard A，Poulsen J N，et al.Camel and bovine chymosin:the relationship between their structures and cheese-making properties［J］.Acta Cryst.，2013，D69:901-913.

［5］ M?ller K K，Rattray F P，S?rensen J C，et al.Comparison of the hydrolysis of bovine κ-casein by camel and bovine chymosin:a kinetic and specificity study［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60(21):5 454-5 460.

［6］ Richter C，Tanaka T，Yada R Y.Mechanism of activation of the gastric aspartic proteinases:pepsinogen，progastricsin and prochymosin［J］.The Biochemical Journal，1998，335:481-490.

［7］ Christensen K A，Pedersen V B，F(xiàn)oltmann B.Identification of an enzymatically active intermediate in the activation of porcine pepsinogen［J］.FEBS Letters，1977，76(2):214-218.

［8］ Kageyama T.Pepsinogens，progastricsins，and prochymosins:structure，function，evolution，and development［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2002，59(2):288-306.

［9］ Olempska-Beer Z S，Merker R I，Ditto M D，et al.Food-processing enzymes from recombinan microorganisms—a review［J］.Regulatory Toxicology and Pharmacology，2006，45(2):144-158.

［10］ Emtage J S，Angal S，Doel M T，et al.Synthesis of calf prochymosin(prorennin)in Escherichia coli［J］.Proc Nati Acad Sci，1983，80:3671-3675.

［11］ Tichy P J，Kapralek F，Jecmen，P.Improved procedure for a high-yield recovery of enzymatically active recombinant calf chymosin from Escherichia coli inclusion bodies［J］.Protein Expr Purif，1993，4(1):59-63.

［12］ Uren J R，Robinson D E，Scandella C J.Recovery and activation process for microbially produced calf prochymosin:United States，4721673［P］.1998-1-26.

［13］ Carey N H，Doel M T，Harris T J R，et al.Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate:United States，5332805［P］.1994-1-26.

［14］ Harmsen M M，Smits C B，de Geus B.Stimulation of chymosin secretion by simultaneous expression with chymosin-binding llama single-domain antibody fragments in yeast［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60(4):449-454.

［15］ 張莉，姜媛媛，張健，等.牛凝乳酶基因在畢赤酵母中的重組表達(dá)［J］.生物工程學(xué)報，2009，25(8):1 160-1 165.

［16］ Noseda D G，Recúperoa M N，Blasco M，et al.Cloning，expression and optimized production in a bioreactor of bovine chymosin B in Pichia(Komagataella)pastoris under AOX1 promoter［J］.Protein Expression and Purification，2013，92(2):235-244.

［17］ FENG Z，ZHANG L W，HAN X，et al.Codon optimization of the calf prochymosin gene and its expression in Kluyveromyces lactis［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26(5):895-901.

［18］ FENG Z，REN J，ZHANG H J，et al.Disruption of PMR1 in Kluyveromyces lactis improves secretion of calf prochymosin［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91(1):100-103.

［19］ Bodie E A，Armstrong G L，Dunn-Coleman N S.Strain improvement of chymosin-producing strains of Aspergillus niger var.awamori using parasexual recombination［J］.Enzyme Microb Technol，1994，16(5):376-382.

［20］ van den Brink H M，Petersen S G，Rahbek-Nielsen H，et al.Increased production of chymosin by glycosylation［J］.Biotechnol，2006，125(2):304-310.

［21］ Mariani D D，Lorda G S，Balatti A P.Rennet production by Rhizomucor miehei NRRL 3169［J］.Rev Argent Microbiol，2003，35(3):128-132.

［22］ Tsuchiya K，Gomi K，Kitamoto K，et al.Secretion of calf chymosin from the filamentous fungus Aspergillus oryzae［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1993，40(2-3):327-332.

［23］ Tsuchiya K，Nagashima T，Yamamoto Y，et al.High level secretion of calf chymosin using a glucoamylase-prochymosin fusion gene in Aspergillus oryzae［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1994，58(5):895-899.

［24］ Ohno A，Maruyama J，Nemoto T，et al.A carrier fusion significantly induces unfolded protein response in heterologous protein production by Aspergillus oryzae［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，92:1 197-1 206.

［25］ Yoon J Kikuma T，Maruyama J，et al.Enhanced production of bovine chymosin by autophagy deficiency in the filamentous fungus Aspergillus oryzae［J］.PLoS One，2013，8(4):e62512.

［26］ Ward M，Wilson L J，Kodama K H，et al.Improved pro-duction of chymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion［J］.Biotechnology(N Y)，1990，8(5):435-440.

［27］ Kosalková K，García-Estrada C，Barreiro C，et al.Casein phosphopeptides drastically increase the secretion of extracellular proteins in Aspergillus awamori.Proteomics studies reveal changes in the secretory pathway［J］.Microbial Cell Factories，2012，11(5):

［28］ Mezina M N，Lavrenova G I，Prokofev M I，et al.Isolation of milk-clotting enzyme from transgenic sheep milk and its comparison with calf chymosin［J］.Biochemistry(Mosc)，2001，66(4):378-383.

［29］ Starovoitova V V，Velichko T I，Baratova L A，et al.A comparative study of functional properties of calf chymosin and its recombinant forms［J］.Biochemistry(Mosc)，2006，71(3):320-324.

［30］ Rogelj I，Perko B，F(xiàn)rancky A，et al.Recombinant lamb chymosin as an alternative coagulating enzyme in cheese production［J］.Journal of Dairy Science，2001，84(5):1 020-1 026.

［31］ Vega-Hernández M C，Gómez-Coello A，Villar J，et al.Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin［J］.Journal of Biotechnology，2004，114(1-2):69-79.

［32］ Eskandari M H，Hosseini A，Zarasvand S A，et al.Cloning，expression，purification and refolding of Caprine prochymosin［J］.Food Biotechnology，2012，26(2):143-153.

［33］ Vallejo J A，Ageitos J M，Poza M，et al.Short communication:A comparative analysis of recombinant chymosins［J］.Journal of Dairy Science，2012，95(2):609-613.

［34］ Vallejo J A，Ageitos J M，Poza M，et al.Cloning and expression of buffalo active chymosin in Pichia pastoris［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(22):10 606-10 610.

［35］ JIANG T，CHEN L J，XUE L，et al.Study on milk-clotting mechanism of rennet-like enzyme from glutinous rice wine:proteolytic property and the cleavage site on kappacasein［J］.Journal of Dairy Science，2007，90(7):3 126-3 133.

［36］ JIANG T M，CHEN L J.Characterization of wine rennet and its kinetics by gel electrophoresis［J］.Journal of Dairy Science，2010，93(3):841-848.

［37］ AN Z G，HE X L，GAO W D，et al.Characteristics of miniature cheddar-type cheese made by microbial rennet from Bacillus amyloliquefaciens:a comparison with commercial calf rennet［J］.J Food Sci，2014，79(2):M214-M221.

［38］ Abellan A，Cayuela J M，Pino A，et al.Free amino acid content of goat's milk cheese made with animal rennet and plant coagulant［J］.J Sci Food Agric，2012，92(8):1 657-1 664.

［39］ Mazorra-Manzano M A，Perea-Gutiérrez T C，Lugo-Sánchez M E，et al.Comparison of the milk-clotting properties of three plant extracts［J］.Food Chemistry，2013，141:1 902-1 907.

［40］ Rossano R，Larocca M，Lamaina A，et al.The hepatopancreas enzymes of the crustaceans Munida and their potential application in cheese biotechnology［J］.Food Science and Technology，2011，44:173-180.

［41］ Rossano R，Larocca M，Riccio P.Digestive enzymes of the crustaceans Munida and their application in cheese manufacturing:a review［J］.Mar Drugs，2011，9(7):1 220-1 231.

［42］ Pessela B C，Torres R，F(xiàn)uentes M，et al.Immobilization of rennet from Mucor miehei via its sugar chain.Its use in milk coagulation［J］.Biomacromolecules，2004，5(5):2 029-2 033.

［43］ Moynihan A C，Govindasamy-Lucey S，Jaeggi J J，et al.Effect of camel chymosin on the texture，functionality，and sensory properties of low-moisture，part-skim Mozzarella cheese［J］.Journal of Dairy Science，2014，97(1):85-96.

［44］ M?ller K K，Rattray F P，Ard? Y.Application of selected lactic acid bacteria and coagulant for improving the quality of low-salt cheddar cheese:chemical，microbiological and rheological evaluation［J］.International Dairy Journal，2013，33(2):163-174.

［45］ B?rsting M W，Qvist K B，Rasmussen M，et al.Impact of selected coagulants and starters on primary proteolysis and amino acid release related to bitterness and structure of reduced-fat Cheddar cheese［J］.Dairy Science ＆ Technology，2012，92(5):593-612.

［46］ Govindasamy-Lucey S，Lu Y，Jaeggi J J，et al.Impact of camel chymosin on the texture and sensory properties of low-fat cheddar cheese［J］.Australian Journal of Dairy Technology，2010，65(3):139-142.

［47］ Mantafounis D，Pitts J.Protein engineering of chymosin;modification of the optimum pH of enzyme catalysis［J］.Protein Eng，1990，3(7):605-609.

［48］ Pitts J E，Uusitalo J M，Mantafounis D，et al.Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Trichoderma reesei［J］.J Biotechnol，1993，28(1):69-83.

［49］ McCaman M T，Cummings D B.A mutated bovine prochymosin zymogen can be activated without proteolytic processing at low pH［J］.The Journal of Biological Chemistry，1986，261(33):15 345-15 348.

［50］ S?rensen J，Palmer D S，Schi?tt B.Hot-spot mapping the interactions between chymosin and bovine kappa-casein［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61:7 949-7 959.