碳源對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)條件優(yōu)化

閻賀靜，劉暢，時(shí)月，李潤豐

(河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北昌黎，066600)

殼聚糖降解后理化性質(zhì)和生理活性都發(fā)生了變化，所得殼寡糖不僅易于被人體吸收利用，還具有許多獨(dú)特的生理活性和功能，例如:能提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長、活化增殖人體腸道內(nèi)雙歧桿菌等［1-2］。同時(shí)還具有抗菌防腐、保水保濕等功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品、保健品等方面的應(yīng)用前景令人矚目［3-4］。由殼聚糖制備殼寡糖可通過化學(xué)降解、物理降解和酶降解進(jìn)行［5-6］。與目前常用的化學(xué)降解法相比，酶法生產(chǎn)殼寡糖的反應(yīng)條件溫和易控，寡糖得率高、功能性更強(qiáng)，不易造成環(huán)境污染，是殼寡糖最理想的制備方法。

殼聚糖酶(chitosanase)又稱殼聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶，對(duì)殼聚糖降解具有專一性是殼聚糖制備殼寡糖最理想的酶制劑［7-8］，在工業(yè)上已有用于制備殼寡聚糖(Chitooligosaccharides，簡稱 COSs)的實(shí)例。雖然目前殼聚糖酶已經(jīng)商品化，但由于原始菌株產(chǎn)殼聚糖酶能力仍然普遍偏低，使得殼聚糖酶的來源有限，生產(chǎn)成本高，導(dǎo)致商品殼聚糖酶價(jià)格居高不下［9-10］。同時(shí)目前的商品殼聚糖酶在熱穩(wěn)定性等方面還不足以適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化降解殼聚糖的生產(chǎn)。目前的研究重點(diǎn)是采用不同的生物技術(shù)來提高殼聚糖酶生產(chǎn)菌的產(chǎn)酶能力。

本實(shí)驗(yàn)首先確定了煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶受碳源的誘導(dǎo)，通過不同碳源對(duì)煙曲霉WHSW-01細(xì)胞生長和產(chǎn)酶的影響，確定對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶起最佳誘導(dǎo)作用的碳源，并進(jìn)一步確定該最佳誘導(dǎo)碳源的添加量和添加時(shí)間來提高煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的能量，在節(jié)約成本的前提下提高殼聚糖酶的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

菌種:煙曲霉WHSW-01(由武漢生物工程學(xué)院酶工程教研室提供)［11］;

試劑:瓊脂粉，NaCl、MgSO4·7H2O 等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面(平板)培養(yǎng)基:膠體殼聚糖 1%，(NH4)2SO40.5%，K2HPO40.2%，NaCl 0.5%，Mg-SO4·7H2O 0.1%，瓊脂2.0%，pH6.5。1%膠體殼聚糖的配制:每100 mL pH5.0的醋酸緩沖液中溶解1 g粉末殼聚糖。

搖瓶發(fā)酵基本培養(yǎng)基:NH4NO31.0%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.5%，酵母提取物0.5%，碳源(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而變)。

1.3 研究方法

1.3.1 殼聚糖酶的搖瓶發(fā)酵

培養(yǎng)基為自然pH，搖瓶裝液量70 mL/250 mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 還原糖的測定

采用 3，5-二硝基水楊酸(DNS)法［12］。

1.3.3 DNS法測殼聚糖酶活力

先將加有1 mL的pH 5.6醋酸緩沖液和0.9 mL的1%標(biāo)準(zhǔn)膠體殼聚糖溶液的試管在50℃保溫5 min，再加入0.1 mL的4 000 r/min離心15 min后的初酶液，于50℃下水浴保溫15 min，加入1.5 mL的DNS終止酶促反應(yīng)，顯色沸水浴5 min，自然冷卻，然后加入21.5 mL的蒸餾水，平衡后于4 000 r/min離心15 min，取上清液在可見光520 nm處測吸光度，根據(jù)氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線求出反應(yīng)液中的還原糖含量。酶活定義:1 mL酶液1 min催化產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)單位(U/mL)。

1.3.4 殼聚糖水解液的制備

用1%膠體殼聚糖作搖瓶發(fā)酵基本培養(yǎng)基的碳源，取發(fā)酵到第3天的粗酶液10 mL，于50℃下水解450 mL的1%標(biāo)準(zhǔn)殼聚糖溶液50 min。

1.3.5 殼聚糖酶生物合成調(diào)節(jié)模式的考察

分別以1%殼聚糖膠體、0.5%膠體殼聚糖和0.5%葡萄糖、1%葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的基本碳源進(jìn)行殼聚糖酶的搖瓶發(fā)酵，每隔24 h測發(fā)酵液中殼聚糖酶的酶活。

1.3.6 不同碳源對(duì)WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響

在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以1%葡萄糖和1%氨基葡萄糖鹽酸鹽、2%氨基葡萄糖鹽酸鹽、1%葡萄糖和1%殼聚糖膠體、1%葡萄糖和1%粉末殼聚糖、2%葡萄糖、1%葡萄糖和1%殼聚糖水解液為碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h測發(fā)酵液中殼聚糖酶酶活，考察不同碳源對(duì)WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響。

1.3.7 最佳誘導(dǎo)劑添加量對(duì)WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響

將最佳誘導(dǎo)劑按照發(fā)酵液總體積的10%、20%、40%、60%的量在發(fā)酵初始添加，每隔24 h測殼聚糖酶的酶活和細(xì)胞生物量，考察最佳誘導(dǎo)劑的不同添加量對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響。

1.3.8 最佳誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響

將最佳劑量的誘導(dǎo)劑分別在發(fā)酵進(jìn)行的0、12、24、48、72、96 h 添加到發(fā)酵液中，每隔 24 h 測發(fā)酵液中殼聚糖酶的酶活和細(xì)胞的生物量，考察最佳誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響。

1.3.9 生物量的測定方法

采用細(xì)胞干重測量法［13］。

2 結(jié)果和分析

2.1 煙曲霉WHSW-01中殼聚糖酶生物合成的調(diào)節(jié)模式

酶生物合成的調(diào)節(jié)模式主要有分解代謝物阻遏作用、誘導(dǎo)作用、反饋?zhàn)瓒糇饔茫?4］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)真菌中殼聚糖酶的合成模式以誘導(dǎo)型為主［15］。按照1.3.5方法確定煙曲霉WHSW-01合成殼聚糖酶是否受殼聚糖誘導(dǎo)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳源對(duì)殼聚糖酶生物合成的影響Fig.1 Effects of different carbon on chitosanase biosynthesis

由圖1可見，不同碳源對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響不同。當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，殼聚糖酶的合成量較低，最高酶活為0.89 U/mL。當(dāng)培養(yǎng)基中存在膠體殼聚糖時(shí)，煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的量較高。例如，以膠體殼聚糖為唯一碳源以及以葡萄糖和殼聚糖為碳源時(shí)，殼聚糖酶酶活最高分別為2.3 U/mL和2.89 U/mL。由此可見，煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶是受殼聚糖的誘導(dǎo)的。僅以葡萄糖作為碳源，不利于殼聚糖酶的合成，以葡萄糖為基礎(chǔ)碳源，添加殼聚糖有利于該煙曲霉的產(chǎn)生。

2.2 不同誘導(dǎo)劑對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用

以不同物質(zhì)及不同形式的殼聚糖作為碳源，對(duì)微生物的生長和產(chǎn)酶有不同的影響。按1.3.6所示的方法分別添加不同碳源進(jìn)行發(fā)酵。每隔24 h測發(fā)酵液中殼聚糖酶的酶活，考察不同碳源對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，不同碳源對(duì)殼聚糖酶的合成有不同的影響。分別以葡萄糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽以及葡萄糖和氨基葡萄糖鹽酸鹽為碳源時(shí)，最高酶活分別為0.95、3.4和1.6 U/mL;分別以葡萄糖和殼聚糖水解液、葡萄糖和殼聚糖粉末以及葡萄糖和膠體殼聚糖為碳源時(shí)，最高酶活分別為4.75、1.59和2.81 U/mL。并且碳源不同，該曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶周期不同，以氨基葡萄糖鹽酸鹽及葡萄糖和殼聚糖粉末為碳源時(shí)，產(chǎn)酶高峰期出現(xiàn)在發(fā)酵的96 h，其他碳源發(fā)酵至120 h達(dá)產(chǎn)酶高峰期。由此可見，碳源不僅影響產(chǎn)酶酶量的高低，同時(shí)影響產(chǎn)酶周期，其中以殼聚糖水解液為碳源時(shí)殼聚糖酶產(chǎn)量最高。推測可能是由于殼聚糖水解液中含有某低聚殼寡糖對(duì)該曲霉的生長和產(chǎn)酶都有促進(jìn)作用。但由于殼聚糖水解液由殼聚糖水解獲得，水解液組成成份十分復(fù)雜，對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的具體原因需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖2 不同碳源對(duì)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用Fig.2 Induction of different carbon resources on chitosnase production

圖3 殼聚糖水解液添加量對(duì)煙曲霉生長和產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of different chitosan hydrozate amount on A.fumigates WHSW-01growth and chitosanase production

2.3 殼聚糖水解液對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用

為進(jìn)一步提高該煙曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的量，需要進(jìn)一步確定殼聚糖水解液添加量，按照1.3.7的方法進(jìn)行發(fā)酵，每隔24 h測發(fā)酵液中細(xì)胞干重和殼聚糖的酶活力，結(jié)果如圖3a和圖3b所示。

由圖3b可知，殼聚糖水解液添加量不同，對(duì)殼聚糖酶的合成影響也不同。其中添加占發(fā)酵液總體積40%的殼聚糖水解液進(jìn)行發(fā)酵，其殼聚糖酶酶活產(chǎn)量最高，發(fā)酵至120 h達(dá)最高酶活4.88 U/mL。當(dāng)繼續(xù)增加殼聚糖水解液添加量至60%殼聚糖酶產(chǎn)量降低(圖3b所示)。分析原因可能是由于殼聚糖水解液添加量較高時(shí)，某種殼聚糖水解產(chǎn)物含量較高，對(duì)殼聚糖酶的合成產(chǎn)生了抑制作用。此外，根據(jù)圖3a和3b所示，發(fā)現(xiàn)煙曲霉WHSW-01發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的開始時(shí)間與細(xì)胞的生長同步，但當(dāng)發(fā)酵至72 h后細(xì)胞生物量開始減少，而殼聚糖的酶活卻繼續(xù)增加，直至發(fā)酵至120 h酶活達(dá)到最大值。由此可以說明，以殼聚糖水解液為誘導(dǎo)碳源時(shí)，煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的合成模式為延續(xù)合成型。此類型的合成模式特點(diǎn)是細(xì)胞停止生長而酶仍在繼續(xù)合成，因此會(huì)積累大量的目的酶，這是酶生物合成的最佳合成模式［14］。

2.4 殼聚糖水解液添加時(shí)間對(duì)煙曲霉WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用

為進(jìn)一步提高殼聚糖酶的產(chǎn)量，按照1.3.8所示的方法考察了殼聚糖水解液的添加時(shí)間，每隔24 h測殼聚糖酶的活力，結(jié)果如圖4所示。

圖4 殼聚糖水解液加時(shí)間對(duì)煙曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.4 Effects of chitosan hydrozate addition time on chitosanase production

由圖4可見，在不同時(shí)間添加殼聚糖水解液，對(duì)WHSW-01產(chǎn)殼聚糖酶的影響不同。其中發(fā)酵0 h和12 h時(shí)添加殼聚糖水解液產(chǎn)酶效果最佳。兩者在發(fā)酵至120 h均達(dá)到產(chǎn)酶高峰，最高酶活分別為5.25 U/mL和6.78 U/mL。隨著殼聚糖水解液添加時(shí)間的滯后，該菌株的產(chǎn)酶量逐漸降低，由此可見殼聚糖水解液的添加最好在發(fā)酵初期進(jìn)行。

圖5為發(fā)酵12 h時(shí)添加殼聚糖水解液時(shí)細(xì)胞生長和產(chǎn)酶情況。在發(fā)酵至48 h時(shí)細(xì)胞生物量達(dá)到最大，即細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵至72 h以后細(xì)胞生長進(jìn)入了衰亡期。然而發(fā)酵產(chǎn)酶高峰期卻出現(xiàn)在發(fā)酵進(jìn)行至120 h時(shí)，最高酶活達(dá)到6.78 U/mL。分析酶產(chǎn)量增加的原因可能如下，(1)發(fā)酵進(jìn)行至12 h添加殼聚糖水解液，有利于發(fā)酵初期煙曲霉利用速效碳源迅速繁殖，使細(xì)胞大量積累，而后誘導(dǎo)劑的添加使細(xì)胞大量產(chǎn)酶;(2)由圖5可以判斷，此條件下煙曲霉WHSW-01殼聚糖酶的合成模式為延續(xù)合成型，即細(xì)胞停止生長后酶繼續(xù)合成，酶的合成時(shí)間較其他類型的合成模式長，因此殼聚糖酶的產(chǎn)量增加;(3)由于煙曲霉為絲狀真菌，搖瓶振蕩發(fā)酵時(shí)，菌絲相互纏繞而形成菌絲球，發(fā)酵期間菌絲球內(nèi)會(huì)包裹大量的酶液，當(dāng)發(fā)酵后期菌絲球出現(xiàn)自溶，包裹在菌絲球中的殼聚糖酶被釋放到發(fā)酵也中，這在表觀上體現(xiàn)在發(fā)酵液酶活的提高［15］。綜上所述，煙曲霉 WHSW-01在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(基礎(chǔ)碳源為1%的葡萄糖)發(fā)酵至12 h時(shí)間添加殼聚糖水解液最佳，有利于微生物細(xì)胞的繁殖和積累，殼聚糖酶的合成模式為延續(xù)合成型，合成時(shí)間比較長，產(chǎn)酶量較高。

圖5 發(fā)酵12 h添加殼聚糖水解液條件下細(xì)胞生長及產(chǎn)酶Fig.5 Curves of A.fumigates WHSW-01growth and chitosanase production in condition of chitosan hydrozate additon after fermentation continued 12 h

3 討論與結(jié)論

殼聚糖酶是高效、特異降解殼聚糖的酶。關(guān)于殼聚糖酶的研究，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的工作。一方面利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)挖掘新型殼聚糖酶基因并進(jìn)行高效表達(dá)［16-19］;另一方面通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化［20-25］，在一定程度上提高了殼聚糖酶的產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉WHSW-01在只含有葡萄糖的培養(yǎng)基中細(xì)胞生長較好，但產(chǎn)酶量極低;而在含有葡萄糖和殼聚糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)酶量大大增加，說明該菌種產(chǎn)殼聚糖酶受殼聚糖的誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖水解液對(duì)殼聚糖酶的產(chǎn)生具有更大的誘導(dǎo)作用，比使用膠體殼聚糖做誘導(dǎo)劑時(shí)最高酶活提高1.35倍。本文研究確定，WHSW-01在基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵至12 h時(shí)添加占發(fā)酵液總體積40%的殼聚糖水解液產(chǎn)酶量最高為6.78 U/mL，與前期煙曲霉WHSW-01基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下最高酶活3.7 U/mL相比提高了83.24%［26］。其實(shí)，對(duì)于酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在確定基本培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，還可通過多種手段提高細(xì)胞產(chǎn)酶能力。曾有學(xué)者在培養(yǎng)過程中采用熱激作用提高了殼聚糖酶的產(chǎn)量［27-28］。Sinha等利用蝦蟹殼來源的幾丁質(zhì)水解物作培養(yǎng)基進(jìn)行殼聚糖酶發(fā)酵生產(chǎn)，也達(dá)到了提高殼聚糖酶產(chǎn)量的目的［29］。也有人在發(fā)酵過程中通過分階段控制營養(yǎng)物質(zhì)、pH等策略提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，確實(shí)得到了不錯(cuò)的效果［30-31］。有研究表明，微生物產(chǎn)殼聚糖酶受不同碳源的誘導(dǎo)作用［15，32］。對(duì)于既定的殼聚糖酶生產(chǎn)菌，考察誘導(dǎo)物及其誘導(dǎo)條件，在一定程度上可以提高酶的產(chǎn)量。本文的研究正是基于此目的進(jìn)行的，結(jié)果表明使用殼聚糖水解液可以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量。雖然本研究并未使酶產(chǎn)量提高很大，與基因工程菌殼聚糖酶的產(chǎn)量無法相比［18］，但與菌種誘變及發(fā)酵基本條件優(yōu)化等對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)量的提高相比［21-24］，本研究中殼聚糖酶產(chǎn)量的提高還是比較明顯的;此外，碳源的誘導(dǎo)策略應(yīng)用于基因工程菌，也很有可能使產(chǎn)酶有較大的提高;同時(shí)本研究也為下一步的研究提供了方向，例如:可以進(jìn)一步考察殼聚糖水解成分如低聚合度殼聚糖對(duì)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用，由此進(jìn)一步提高產(chǎn)酶;此外還可以展開低聚殼聚糖對(duì)煙曲霉誘導(dǎo)作用機(jī)理的研究，為煙曲霉產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵過程的進(jìn)一步優(yōu)化提供參考。

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