蟲花 Isaria farinosa 04-1產(chǎn)糖條件優(yōu)化及其胞外多糖活性研究*

孫灑灑，沈照鵬，孟蕾，江曉路，3

1(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266003)2(中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東青島，266003)3(青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島，266071)

蟲花Isaria farinosa 04-1是蟲草的一種，其無(wú)性型為粉質(zhì)擬青霉 Paecilomyces farinosus，所含營(yíng)養(yǎng)與藥用成分與野生蟲草的種類相同，含量相當(dāng)甚至更高［1］，是冬蟲夏草的潛在替代品。

蟲草液態(tài)培養(yǎng)能產(chǎn)生蟲草素、蟲草酸、腺苷和蟲草多糖等物質(zhì)，其中蟲草多糖是最重要、最豐富的藥理活性成分，有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功效［2］，它在抗氧化方面的作用越來(lái)越受到關(guān)注［3］。生物活性多糖具有營(yíng)養(yǎng)和保濕雙重功能，作為功效性添加劑應(yīng)用于化妝品中，符合保濕劑的發(fā)展方向和市場(chǎng)需要，有較高的研究?jī)r(jià)值［4］，但蟲草多糖在此方面的應(yīng)用研究較少。已有報(bào)道表明蟲花菌絲體和發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)對(duì)細(xì)菌有廣譜抗性，胞外糖蛋白有一定的抑瘤作用［5］，但國(guó)內(nèi)外對(duì)蟲花液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖及胞外多糖(EPS)活性的研究較少。本文探討了蟲花培養(yǎng)過(guò)程中菌體生物量、發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖能力。此外，還考察了EPS的吸濕保濕性、清除羥自由基及螯合鐵離子的能力，旨在確定蟲花液體培養(yǎng)的最佳條件及EPS的生物活性，探討其在化妝品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

由中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院江曉路教授提供，經(jīng)形態(tài)學(xué)與ITS序列分析鑒定命名為Isaria farinosa 04-1［6］。

1.1.2 試劑

苯酚、濃 H2SO4、FeSO4、水楊酸、H2O2、VC、EDTA、菲洛嗪等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.1.1 碳源的確定

選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為碳源。

1.2.1.2 氮源的篩選

以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3為不同氮源進(jìn)行篩選。

1.2.1.3 最佳初始pH的確定

按基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，以確定的適宜碳、氮源，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的初始 pH 為 4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0來(lái)確定最佳條件。

1.2.1.4 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

用選出的適宜碳、氮源及 pH，設(shè)置 23、25、28、30、32℃探討溫度的影響。

1.2.1.5 正交試驗(yàn)

以菌絲體干重及EPS含量為指標(biāo)，利用L9(34)正交表確定單因素篩選出的4個(gè)因素的水平范圍(見表1)，根據(jù)因素水平表進(jìn)行試驗(yàn)操作。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平表Table 1 Experimental factors and their levels for orthogonal design

以上試驗(yàn)均采用5% 的接種量，轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

1.2.2 蟲花生物量及EPS含量測(cè)定

蟲花生物量:以菌絲體干重來(lái)衡量，取發(fā)酵液離心(4 800 r/min，10 min)，菌絲體沉淀放在干燥潔凈的平板中烘干(50℃)至恒重后稱重。

EPS含量測(cè)定:取發(fā)酵液離心(4 800 r/min，10 min)后的上清液，添加5倍乙醇，振蕩混勻后，離心(4 800 r/min，10 min)取沉淀，加水復(fù)溶后得糖溶液，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)苯酚-硫酸法［7］進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 多糖活性探索

1.2.3.1 多糖的吸濕保濕能力

參照 ZHAO［8］的方法以甘油(Glycerol)和透明質(zhì)酸(HA)為對(duì)照。

1.2.3.2 多糖清除羥自由基的能力

Fenton法［9-10］:VC和蒸餾水分別為陽(yáng)性和空白對(duì)照。EC50是清除率為50% 時(shí)的樣品濃度，值越大，表明清除活性越弱;反之，越強(qiáng)［11］。

1.2.3.3 多糖螯合鐵離子的能力

菲洛嗪法:EDTA和蒸餾水分別為陽(yáng)性和空白對(duì)照［12］。螯合能力以螯合率達(dá)50% 時(shí)的樣品濃度即EC50來(lái)衡量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 19進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 不同碳源對(duì)菌絲體干重和糖含量的影響

如圖1a所示，相對(duì)葡萄糖和麥芽糖，蔗糖的作用效果較顯著，轉(zhuǎn)化合成的多糖較多，達(dá)1.368 g/L，菌體生長(zhǎng)較好，菌絲體干重達(dá)10.790 g/L;而且蔗糖比葡萄糖和麥芽糖穩(wěn)定，不易被氧化，能提高發(fā)酵培養(yǎng)基的穩(wěn)定性［13］，因此選用蔗糖為最佳碳源。

2.1.2 不同氮源對(duì)菌絲體干重和糖含量的影響

從圖1b可看出，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源作用效果好，菌體生長(zhǎng)較好且轉(zhuǎn)化成的EPS較多。因此，蟲花液體培養(yǎng)的適宜氮源為牛肉膏、蛋白胨和酵母膏。當(dāng)使用蛋白胨做氮源時(shí)，菌絲體干重比牛肉膏做氮源時(shí)略高，但糖含量(2.065 g/L)相對(duì)牛肉膏(2.283 g/L)較低，因此，當(dāng)以獲得EPS為目的時(shí)，選用牛肉膏為最佳氮源。

圖1 不同條件對(duì)菌絲體干重和糖含量的影響Fig.1 The effect of different conditions on dry weight of mycelium and polysaccharide content

2.1.3 不同初始pH對(duì)菌絲體干重和糖含量的影響

由圖1c可知，不同初始pH對(duì)菌絲體干重的影響較小，中性偏酸的環(huán)境有利于產(chǎn)糖，隨pH值的增加，糖含量呈下降趨勢(shì)。以糖含量為指標(biāo)，參考菌絲體量，以pH值為6.0較適宜。

2.1.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲體干重和糖含量的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲體干重和糖含量的影響較明顯(如圖1d所示)。25℃時(shí)的菌絲體干重和糖含量都比其他溫度高，可見，25℃比較有利于菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)糖。此外，當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)迅速變慢，可見，高溫對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的積累均有一定的抑制作用，適當(dāng)控制培養(yǎng)溫度可以提高產(chǎn)量并降低能耗［14］。

2.1.5 正交試驗(yàn)分析

2.1.5.1 直觀分析

以菌絲體干重(g/L)和 EPS含量(g/L)為指標(biāo)的均值及極差分析如表2所示。由極差大小可知決定菌絲體干重和 EPS含量的因子主次順序?yàn)?蔗糖＞牛肉膏 ＞初始 pH值 ＞溫度，最佳組合均為A3B3C3D1，即100 mL培養(yǎng)基中含蔗糖2.5 g，牛肉膏0.8 g，初始pH值為4.0，培養(yǎng)溫度為28℃。因素間的交互作用使得最佳組合與單因素確定的最優(yōu)條件略有差異。

表2 菌絲體干重和EPS含量的正交試驗(yàn)分析Table 2 Application of L9(34)orthogonal design to dry weight of mycelium and EPS production

2.1.5.2 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

按正交試驗(yàn)選出的最佳組合配制培養(yǎng)基并在相應(yīng)條件下培養(yǎng)蟲花，優(yōu)化前后的結(jié)果如表 3所示。由表3可知，菌絲體干重和EPS含量分別比優(yōu)化前提高了13.05%和37.66%。

表3 優(yōu)化前后菌絲體干重及EPS含量比較Table 3 Dry weight of mycelium and EPS production comparison of optimization

2.2 多糖的吸濕保濕能力

2.2.1 多糖的吸濕能力

在飽和硫酸銨溶液(相對(duì)濕度RH=81%)環(huán)境下，由圖2a所示，前12 h內(nèi)，EPS比HA的吸濕率高，經(jīng)緩慢增加后逐漸平衡。120 h后，最大吸濕率分別為:甘油(71.39%)＞透明質(zhì)酸(16.81%)＞EPS(10.94%)。由圖2b可知，在飽和碳酸鈉溶液(RH=43%)環(huán)境下的吸濕率與在RH為81% 的環(huán)境中有相同的趨勢(shì)。120 h后，最大吸濕率分別為:甘油(98.11%)＞透明質(zhì)酸(26.13%)＞EPS(18.54%)。兩種濕度下多糖的吸濕率持久穩(wěn)定且無(wú)明顯下降，在同一時(shí)段，RH大的環(huán)境下多糖吸濕率反而小，說(shuō)明吸濕率與濕度沒(méi)有必然關(guān)系，這與陳剛等［15］的研究結(jié)果一致。

2.2.2 多糖的保濕能力

在干硅膠(RH=0)環(huán)境下，由圖2c可知，0～24 h內(nèi)，EPS與甘油的水分殘存率相當(dāng)。120 h后，各樣品的最大水分殘存率分別為:HA(24.31%)＞甘油(12.33%)＞EPS(2.02%)。如圖2d所示，RH=43%時(shí)，0～72 h內(nèi)，EPS與HA的水分殘存率相當(dāng)。120 h后，各樣品的最大水分殘存率分別為:甘油(85.70%)＞EPS(81.16%)＞HA(78.87%)。由此可知，該糖具備較好的吸濕保濕能力，有開發(fā)應(yīng)用的潛力。

圖2 不同RH下樣品的吸濕和保濕能力Fig.2 Moisture absorption and retention abilities of samples at different RH

2.3 多糖對(duì)羥自由基的清除作用

蟲花EPS對(duì)羥自由基的清除作用較明顯，如圖3所示，隨糖濃度的增加而增加并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其EC50為1.285 mg/mL，羥基清除率大于同等濃度下張小強(qiáng)等［16］的研究結(jié)果。

圖3 EPS對(duì)羥自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of EPS on hydroxyl radicals

2.4 多糖的螯合作用

在過(guò)渡金屬中，鐵因其高活性而被稱為最重要的脂質(zhì)過(guò)氧化促氧化劑，有效的亞鐵離子絡(luò)合劑可以避免脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致的損傷［17］。蟲花 EPS因螯合Fe2+干擾了Fe2+-菲洛嗪復(fù)合物的形成，螯合能力跟糖濃度呈正相關(guān)，EC50值為2.606 mg/mL(見圖4)。

圖4 EPS對(duì)Fe2+的螯合作用Fig.4 Chelating ability of EPS on Fe2+

3 討論

本文對(duì)1株蟲花(Isaria farinosa 04-1)的產(chǎn)糖條件進(jìn)行了優(yōu)化，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，菌絲體量跟EPS含量并不呈現(xiàn)嚴(yán)格正相關(guān)，因此在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)具體所需有側(cè)重地調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，以更大限度地得到目標(biāo)產(chǎn)物。經(jīng)正交優(yōu)化后，蟲花菌絲體量比優(yōu)化前提高了13.05%，高于已有報(bào)道［18］的冬蟲夏草菌絲體量(10.200 g/L);EPS產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了37.66%，比趙明文等［19］研究的蛹蟲草EPS產(chǎn)量(1.830 g/L)高38.13%。這些研究為今后蟲花多糖的生產(chǎn)應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

從天然物質(zhì)中提取的具有營(yíng)養(yǎng)和保濕雙重功能的天然保濕劑符合保濕劑的發(fā)展趨勢(shì)，天然多糖正是一類不可多得的天然保濕材料［20］。對(duì)蟲花多糖的研究表明，其吸濕性優(yōu)于透明質(zhì)酸;在飽和碳酸鈉環(huán)境中，具有與透明質(zhì)酸相當(dāng)?shù)谋衲芰?，可作為透明質(zhì)酸代用品，用于醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域。此外，天然多糖是一類非常有前途的食藥用抗氧化劑［21］。該蟲花胞外多糖具有優(yōu)異的羥自由基清除能力及良好的螯合鐵離子能力，能減少脂質(zhì)過(guò)氧化帶來(lái)的損傷，為其成為新型抗氧化劑并以高檔保健品形式滿足市場(chǎng)需求提供了可能。

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