Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的研究

劉 淳 張海英 韓 濤 卞 科

Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的研究

劉 淳1張海英1韓 濤1卞 科2

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院1，北京 102206)
(河南工業(yè)大學(xué)2，鄭州 450052)

蠶豆經(jīng)去皮、粉碎、除淀粉后，得到蠶豆粗蛋白。采用Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白制備蠶豆蛋白水解物。通過單因素試驗(yàn)，調(diào)查了pH、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量(E∶S)和酶解溫度等因素對(duì)Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白效果的影響。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白適宜的工藝參數(shù):酶解溫度60℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，酶用量(E∶S)8%，pH 9．0，此條件下，蠶豆蛋白水解度(DH)達(dá)最大，為21．67%。該結(jié)果與Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白、綠豆蛋白和小麥蛋白等適宜條件參數(shù)接近。

蠶豆蛋白 Alcalase堿性蛋白酶 水解度

蠶豆(Vicia Faba L．)，豆科，野豌豆屬，別名胡豆、南豆、羅漢豆。我國(guó)是世界上蠶豆栽培面積最大、產(chǎn)量最多的國(guó)家，在世界蠶豆生產(chǎn)中所占比重分別為48．82%和51．19%，是除大豆和花生之外種植面積和產(chǎn)量最多的食用豆類作物［1－2］。蠶豆含有蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)25% ～35%，是蛋白含量?jī)H次于大豆的一種重要植物蛋白資源。目前，我國(guó)食品加工業(yè)主要利用蠶豆生產(chǎn)粉絲、粉皮等，僅利用其中的淀粉部分，而作為重要營(yíng)養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)未被合理利用，蠶豆多肽的研究還處于空白。

植物源多肽具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)力、抗衰老、抗氧化和降血壓等作用。大豆蛋白酶解物和大米蛋白酶解物均具有刺激巨噬細(xì)胞吞噬的功能，可激發(fā)非特異的免疫防御系統(tǒng);大豆肽對(duì)·OH自由基具有清除能力，清除率為56．5%;燕麥蛋白酶解物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)移酶活性(ACE)抑制率為 85．40%［3－6］。劉淳等［7］發(fā)現(xiàn)蠶豆蛋白酶解物具有一定的抗氧化活性。

目前，生產(chǎn)多肽的方法有分離提取法、化學(xué)合成法、基因重組法和酶解法等［8－13］。酶解法具有條件溫和，易除雜質(zhì)和水解度高等優(yōu)點(diǎn)。Alcalase堿性蛋白酶主要成分為枯草芽孢桿菌活菌蛋白酶A，屬于內(nèi)切蛋白酶，應(yīng)用于水解大豆蛋白、綠豆蛋白和小麥蛋白等，水解度(DH)分別為 18．79%，35．86% 和18．63%［14－16］。Alcalase 堿性蛋白酶具有高度操作安全性，符合FAO/WHO/JECFA/FCC推薦的食品級(jí)酶制劑標(biāo)準(zhǔn)［17］。目前，尚未見蠶豆蛋白應(yīng)用Alcalase堿性蛋白酶進(jìn)行水解的研究報(bào)道。本研究調(diào)查了Alcalase堿性蛋白酶對(duì)蠶豆蛋白酶解的影響因素，包括pH、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量(E∶S)和酶解溫度，初步確定酶解工藝參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)蠶豆多肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料及儀器

蠶豆:市售;Alcalase堿性蛋白酶(液態(tài)，活力為160 000 U/mL):Novo公司。

Anke TDL－40B型離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;SJ－5型pH計(jì):上海精科有限公司;B－260型恒溫水浴鍋、RE52CS－1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;DHG－9036型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 蠶豆蛋白的提取

取一定量干蠶豆，采用 0．50%Na2SO3，0．01%NaOH溶液浸泡6～7 h，去皮，45℃烘箱干燥備用。粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。稱取適量蠶豆粉，按固液比(g/mL)1∶15加入 Ca(OH)2并攪拌，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液至pH 8，50℃浸提20 min。浸提液經(jīng)過濾后，收集濾液。用1 mol/L HCl將濾液調(diào)至蠶豆蛋白等電點(diǎn)pH 4．2，邊加酸邊攪拌，3 000 r/min離心15 min，收集沉淀物，低溫烘干，沉淀物即蠶豆蛋白［18－21］。

1．2．2 蠶豆蛋白酶解工藝

蠶豆蛋白分別溶于磷酸緩沖液(pH:7．0、8．0、8．5、9．0、10．0)制備(底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%、3%、5%、7%、9%)溶液，90℃水浴10 min，冷卻至酶解溫度。準(zhǔn)確加入Alcalase堿性蛋白酶(2%、4%、5%、6%、8%)，在低溫水浴振蕩器中進(jìn)行恒溫酶解(溫度50、55、60、65、70℃)，同時(shí)用pH計(jì)測(cè)定反應(yīng)體系中pH，開始計(jì)時(shí)。反應(yīng)過程中用1 mol/L NaOH溶液滴定，使系統(tǒng)pH維持恒定(±0．10)，每隔一定時(shí)間記錄一次NaOH體積讀數(shù)，時(shí)間300 min。用6 mol/L HCl將水解液調(diào)至蠶豆蛋白等電點(diǎn)pH 4．2。90℃水浴15 min滅酶。10℃，12 000 r/min離心10 min，去除未水解蠶豆蛋白和其他非溶性物質(zhì)。上清液置于4℃ 冷藏保存。計(jì)算水解度。

1．2．3 蠶豆蛋白水解單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)以pH、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量(E∶S)和酶解溫度為影響因素，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，各因素的試驗(yàn)范圍為 pH:7．0、8．0、8．5、9．0、10．0;底物質(zhì)量分?jǐn)?shù):2%、3%、5%、7%、9%;酶用量(E∶S):2% 、4% 、5% 、6% 、8%;酶解溫度:50、55、60、65、70℃;時(shí)間300 min。試驗(yàn)以水解度(DH)為指標(biāo)，研究Alcalase堿性蛋白酶水解蠶豆蛋白的工藝參數(shù)。試驗(yàn)按照單元操作進(jìn)行，除所研究因素，其他各因素參考文獻(xiàn)［14－16，22－24］:pH 9．0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5% ，酶用量(E∶S)10%，酶解溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間300 min。

1．2．4 蠶豆蛋白水解工藝正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，采用L9(34)正交表(表1)，考察4個(gè)因素，即溫度，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，酶用量(E∶S)，pH對(duì)水解度(DH)的影響。

表1 蠶豆蛋白水解工藝正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)L9(34)

1．2．5 蠶豆蛋白水解度測(cè)定

蠶豆蛋白水解度(DH)測(cè)定與控制采用pH－stat法［25－28］。蛋白質(zhì)的水解程度常以蛋白中的肽鍵被斷裂的百分率表示。pH－stat法具有操作簡(jiǎn)單，可連續(xù)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。其原理是在一定條件下，酶解過程中1 mol肽鍵的斷裂會(huì)導(dǎo)致α摩爾(解離常數(shù))H+的凈釋放，導(dǎo)致體系pH降低，而維持恒定pH需消耗相同量的OH－，所以可通過測(cè)定OH－消耗量計(jì)算水解度。

式中:V為消耗堿量/mL;c為氫氧化鈉物質(zhì)的量濃度/mol/L;α為蠶豆蛋白氨基的平均解離度，試驗(yàn)條件下為0．89;m為底物蛋白的總質(zhì)量/g;h為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，h=7．92(取h大豆=8．38，h燕麥=7．31，h杏仁=7．58，h大米=8．40 的平均值)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平行3次結(jié)果的平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SE);正交試驗(yàn)結(jié)果采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 pH對(duì)蠶豆蛋白水解效果的影響

pH對(duì)酶解反應(yīng)影響的原因是多方面的。根據(jù)過酸或過堿的程度不同，酶會(huì)發(fā)生可逆或不可逆失活，并且pH可改變底物分子及酶的解離狀態(tài)，影響它們的結(jié)合，從而降低酶的活性。

圖1 不同pH下蠶豆蛋白不同時(shí)間的水解度

蠶豆蛋白水解度在不同pH下有明顯差異(圖1)。pH 為 7．0、10．0的水解度在 0～10 min有一定增加，10 min后，水解度幾乎不再明顯變化;pH為9．0的水解度在0～30 min迅速增加，30 min后，水解度不再明顯變化;pH為8．0、8．5的水解度在0～120 min迅速增加，120 min后，水解度不再明顯變化。pH為9．0，蠶豆蛋白水解度最高，其次是pH 8．5、8．0、7．0、10．0，且各 pH 下水解度差異顯著。表明蠶豆蛋白的水解宜在弱堿性條件下進(jìn)行。

2．2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蠶豆蛋白水解效果的影響

選取2．1中水解度最大值對(duì)應(yīng)的pH 9．0，考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、3%、5%、7%、9%對(duì)蠶豆蛋白水解效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下蠶豆蛋白不同時(shí)間的水解度

蠶豆蛋白水解度在不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下有一定差異。底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、7%的水解度在0～30 min迅速增加，30 min后，水解度幾乎不再明顯變化;底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、9%的水解度在0～70 min迅速增加，70 min后，水解度不再明顯變化;底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的水解度在0～120 min迅速變化，120 min后，水解度基本不再變化。底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的蠶豆蛋白水解度為最高，其次是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、9%、7%、2%。達(dá)穩(wěn)定水解度后，3%和5%之間、7%和9%之間均差異不顯著，但3%和5%的水解度明顯高于7%和9%，后者又明顯高于2%。

2．3 酶用量(E∶S)對(duì)蠶豆蛋白水解效果的影響

選取2．2中水解度最大值對(duì)應(yīng)的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，考察酶用量(E∶S)分別為2%、4%、5%、6%、8%對(duì)蠶豆蛋白水解效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同酶用量(E∶S)下蠶豆蛋白不同時(shí)間的水解度

蠶豆蛋白水解度在不同酶用量(E∶S)下有明顯差異。酶用量(E∶S)為2%的水解度在0～10 min迅速增加，10 min后，水解度幾乎不再明顯變化;酶用量(E∶S)為4%、8%的水解度在0～70 min迅速增加，70 min后，水解度基本沒有變化;酶用量(E∶S)為5%、6%的水解度在0～120 min迅速變化，120 min后，水解度沒有明顯變化。酶用量(E∶S)以6%的蠶豆蛋白水解度最高，其次是酶用量(E∶S)為8%、4%、2%、5%;除2%外，水解30 min后，各酶用量(E∶S)之間差異明顯。

2．4 溫度對(duì)蠶豆蛋白水解效果的影響

選取2．3中水解度最大值對(duì)應(yīng)的酶用量(E∶S)6%，考察酶解溫度分別為50、55、60、65、70 ℃對(duì)蠶豆蛋白水解效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同溫度下蠶豆蛋白不同時(shí)間水解度

蠶豆蛋白水解度在不同溫度下有明顯差異。溫度為60、65、70℃的水解度在0～10 min迅速增加，10 min后，水解度略有上升;溫度為50、55℃的水解度在0～120 min迅速增加，120 min后，水解度也略有上升。55℃下蠶豆蛋白水解度最高，其次是60、50、65、70 ℃，各溫度下水解度差異基本明顯，50、55、60℃的水解度幾乎是65、70℃的2倍。表明蠶豆蛋白的水解不宜高于60℃。

2．5 蠶豆蛋白水解工藝正交試驗(yàn)結(jié)果分析

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量(E∶S)、pH為主要因素，以水解度作為指標(biāo)，通過L9(34)正交試驗(yàn)，確定Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的適宜工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

由極差分析(表2)可知，各試驗(yàn)因素對(duì)蠶豆蛋白水解度的影響主次順序?yàn)锽＞D＞C＞A，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蠶豆蛋白水解度影響最大，其次為pH，酶用量(E∶S)，溫度對(duì)蠶豆蛋白水解度影響較小。Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白適宜工藝參數(shù)為B1D3C3A2，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3%，pH 9．0，酶用量(E∶S)8%，溫度60 ℃。

表2 Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表

由方差分析(表3)可知，顯著水平α=0．05，總變異系數(shù)的 P 值 =0．011 7 ＜0．05，說明A、B、C、D 因素，即溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量(E∶S)、pH對(duì)水解度產(chǎn)生顯著影響;B因素的P值=0．011 2＜0．05，說明B因素對(duì)水解度影響顯著，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響水解度主要因素，與表2極差分析結(jié)果一致。

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn):溫度60℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、3%、5%，酶用量(E∶S)8%，pH 9．0。從表4中可知，通過驗(yàn)證試驗(yàn)確定Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的適宜工藝參數(shù)是正確的。

表4 Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

綜合以上分析，Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白適宜工藝條參數(shù)為:酶解溫度60℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，酶用量(E∶S)8%，pH 9．0，水解度為21．67%。

3 討論與結(jié)論

本研究調(diào)查了酶解溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量(E∶S)、pH對(duì)Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白效果的影響，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到Alcalase堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白適宜的工藝參數(shù)及影響蠶豆蛋白水解度主要因素:酶解溫度60℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，酶用量(E∶S)8%，pH 9．0，水解度為21．67%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響蠶豆蛋白水解度主要因素。

Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白、綠豆蛋白和小麥蛋白的水解度為18．63% ～35．85%，酶解溫度為58～65℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% ～9%，pH為8．0～9．6。本試驗(yàn)結(jié)果的水解度、溫度、pH 均在上述范圍內(nèi)，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍有差異。

Alcalase堿性蛋白酶能較有效水解蠶豆蛋白。Alcalase堿性蛋白酶來源廣泛，國(guó)內(nèi)可工業(yè)化生產(chǎn)，其產(chǎn)品安全可靠，價(jià)格低廉，因此采用Alcalase堿性蛋白酶作為蠶豆蛋白水解酶是可行的。

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Study on Hydrolyzing of Protein from Broad Bean by Alcalase Protease

Liu Chun1Zhang Haiying1Han Tao1Bian Ke2
(Institute of Food Science，Beijing University of Angriculture1，Beijing 102206)
(Henan University of Tech－nology2，Zhengzhou 450052)

Broad bean was peeled and smashed to separate starch and then to obtain crude proteins．Alcalase protease was used to hydrolyze isolated broad bean protein for investigating the degree of hydrolysis of the protein．The effects of main parameters，including pH value，substrate mass fraction，enzyme dosage(E∶S)and hydrolysis temperature，were observed．The suitable conditions obtained by single － factor and orthogonal tests，i．e．hydrolysis temperature 60℃，substrate mass fraction 3%，enzyme dosage(E∶S)8%，pH 9．0，and the degree of hydrolysis was21．67%under the condition．The result was close to those from the hydrolyzations in soybean protein，green bean protein and wheat protein by Alcalase protease．

broad bean protein，alcalase protease，degree of hydrolysis

A

1003－0174(2011)12－0029－05

北京市重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科資助(PXM2009－014207－078 172)

2010－01－13

劉淳，女，1986年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程

韓濤，男，1963年出生，教授，碩士生導(dǎo)師，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程