硝酸銀硅膠柱分離純化蛇鯔魚油中的EPA和DHA

張 良 劉美玲 董 強(qiáng) 劉書成 郝記明 張 靜

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院1，湛江 524025)

(廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，湛江 524025)

(西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院3，西安 474100)

硝酸銀硅膠柱分離純化蛇鯔魚油中的EPA和DHA

張 良1，2劉美玲1，2董 強(qiáng)3劉書成1，2郝記明1，2張 靜1，2

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院1，湛江 524025)

(廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，湛江 524025)

(西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院3，西安 474100)

采用NaOH－乙醇皂化再硫酸酸化的方法制備蛇鯔魚油混合脂肪酸，然后用硝酸銀硅膠柱色譜分離純化EPA和DHA。結(jié)果表明:15 g硅膠與1 g硝酸銀充分混合后裝柱，置于5℃的恒溫層析柜中，待色譜柱平衡后，上樣0.75 g混合脂肪酸，然后依次用100 mL石油醚，2%，4%，8%，10%無水乙醚－石油醚溶液各100 mL進(jìn)行洗脫，洗脫液流速為0.5～1.0 mL/min，收集200 mL以后的洗脫液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別從4.43%和13.94%提高至21.47%及70.13%，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)90%以上。

硝酸銀－硅膠 DHA EPA 分離

EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)等n－3 PUFA(n－3多不飽和脂肪酸)具有很多的生理功能，是制造預(yù)防心血管疾病和益智保健食品的良好基料［1］。硝酸銀硅膠柱層析法是20世紀(jì)60年代由De Vries等［2－3］首先用來分離脂肪酸及其脂類，目前已廣泛應(yīng)用于脂肪酸、甾體化合物、萜類化合物的分離純化［4］。該方法是基于吸附在硅膠上的銀離子與不飽和脂肪酸分子中的—CC—之間發(fā)生電子遷移形成絡(luò)合物，從而改變了各飽和度不同的脂肪酸在吸附劑(硝酸銀－硅膠)上的分配系數(shù)，使之得以分離［2－5］。

蛇鯔是南海重要經(jīng)濟(jì)魚類，天然的蛇鯔魚油中EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.90%，低于30%，不能滿足于生產(chǎn)保健魚油的要求。本研究以蛇鯔精制魚油為原料，采用硝酸銀硅膠柱層析技術(shù)分離純化EPA和DHA，考察硝酸銀用量、上樣量以及洗脫體系對(duì)分離純化效果的影響，并初步探討硝酸銀－硅膠對(duì)脂肪的吸附特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

蛇鯔(saurida elongate)精制魚油，從蛇鯔魚糜漂洗物下腳料(北海天鮮海洋食品有限公司提供)中提取，經(jīng)脫膠、脫酸、脫色和脫臭等精制而成。魚油中的主要脂肪酸含量見表1所示。

表1 精制蛇鯔魚油的主要脂肪酸含量

硝酸銀，薄層層析硅膠，無水乙醚，石油醚Ⅱ，正己烷，無水乙醇，95%乙醇，濃硫酸，甲醇，氫氧化鉀，氯化鈉等試劑均為分析純。脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品:含有C4～C24等多種脂肪酸甲酯，Sigma公司(商品號(hào)18919－1AMP)。

氣相色譜儀GC－14B:日本島津公司;電腦恒溫層析柜CXG－1:上海青浦滬西儀器廠;全溫振蕩培養(yǎng)箱:哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:托普儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備

稱取100 g魚油放入 500 mL燒瓶中，加入200 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉乙醇溶液，安裝好回流管，置于60℃恒溫水浴鍋中，并不斷攪拌，反應(yīng)2 h后，冷卻后加入適量石油醚除去非皂化物，然后用6 mol/L硫酸酸化至pH=1～2，然后加入石油醚萃取，收集石油醚層，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下脫出溶劑即得混合脂肪酸。

1.2.2 EPA 和 DHA 的分離純化［6－7］

硅膠柱規(guī)格(35 cm×1.6 cm)，分離效果以洗脫液中DHA和EPA相對(duì)百分含量為指標(biāo)。

硅膠的活化:稱取100 g硅膠，在120℃的真空干燥箱內(nèi)活化2 h后，取出冷卻后，放于干燥器中備用。銀化硅膠的制備:按比例稱取硝酸銀和硅膠放入研缽內(nèi)，混合研磨充分混勻。裝柱:取上述活化銀化硅膠，加入80 mL石油醚(沸程:60～90℃)，攪拌后勻漿靜置1 h，使其充分溶脹，在層析柱底部預(yù)先放入高約1 cm的石英砂，加入20 mL石油醚，將溶脹的銀化硅膠緩慢傾入，柱外用黑紙包裹，裝完后墊上一層濾紙，加適量無水硫酸鈉，打開旋塞，用石油醚洗柱平衡2 h后使用。上樣:待層析柱內(nèi)石油醚液面略高于硅膠面2 cm時(shí)，開始上樣。取一定質(zhì)量的脂肪酸用5 mL石油醚溶解，緩慢倒入柱內(nèi)，注意不要使硅膠面浮動(dòng)。洗脫:洗脫體系為含有無水乙醚的石油醚，洗脫液流速0.5～1 mL/min，每40 mL收集一次。脂肪酸回收:將收集到的各流分分別加入適量飽和氯化鈉水溶液和石油醚振搖1 min，靜置分層，除去下層殘?jiān)奥然y與廢液，再加入15%氯化鈉水溶液洗滌2遍，最后用水沖洗1～2次，取上層有機(jī)相，在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，即得分離的脂肪酸組分，用于分析DHA和EPA含量。

1.2.3 脂肪酸的分析

甲酯化:氫氧化鉀甲醇法。氣相分析條件:色譜柱，F(xiàn)FAP石英毛細(xì)管柱，30 m ×0.25 mm(內(nèi)徑)×0.25 μm(膜厚);檢測(cè)器為FID;進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器溫度250℃;色譜柱升溫程序200℃保留15 min，以5℃/min升至240℃，直到分析完成;載氣為氮?dú)猓瑝毫?00 kPa，空氣壓力50 kPa，氫氣壓力50 kPa，尾吹氣壓力200 kPa;分流方式進(jìn)樣，分流比為40∶1，進(jìn)樣量為1 μL。脂肪酸甲酯的定性采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法。脂肪酸甲酯定量采用面積歸一法。

1.2.4 游離脂肪酸吸附特性的研究［6］

準(zhǔn)確稱取銀化硅膠(硅膠∶硝酸銀 =15∶1)0.1 g，加入50 mL 50 mg/mL的脂肪酸－石油醚溶液，于30℃下恒溫振蕩，每隔0.5 h測(cè)定一次上清液中的總脂肪酸濃度(mg/mL)，測(cè)定混合脂肪酸的吸附量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，得到混合脂肪酸的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，同時(shí)計(jì)算相應(yīng)間隔時(shí)間內(nèi)FFA的平均吸附速率?？傊舅釢舛鹊臏y(cè)定參考GB/T 5530—2006。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸銀用量對(duì)EPA和DHA分離純化效果的影響

洗脫效果見圖1。

圖1 硝酸銀用量對(duì)EPA和DHA分離純化效果的影響

硝酸銀與硅膠用量的比值越大，則多不飽和脂肪酸與固定相結(jié)合的機(jī)會(huì)越多，其吸附將更完全。但一些單不飽和脂肪酸也可被吸附，在洗脫過程中，造成單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸難于分離或是需要更多的流動(dòng)相才能將EPA和DHA洗脫下來。本試驗(yàn)采用15 g活化過的硅膠按照硅膠與硝酸銀20∶1(圖1a)、15∶1(圖 1b)、10∶1(圖 1c)和 8∶1(圖1d)的比例混勻，進(jìn)行試驗(yàn)。

從圖1可看出，當(dāng)硝酸銀用量為1.00 g(硅膠∶硝酸銀=15∶1)時(shí)，DHA和EPA分離效果最好，DHA和EPA與飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的重合較少，流分中DHA和EPA的最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.29%;而當(dāng)硝酸銀用量分別為 0.75、1.50 和1.875 g時(shí)，雖然也可以獲得高純度的 DHA和EPA，但是與飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸并不能很好的分離(圖中有重疊)，或者是洗脫時(shí)間滯后，造成分離效果的不理想。因此，綜合考慮選擇以硅膠∶硝酸銀的比例為15∶1較合適，即硅膠用量15 g和硝酸銀用量1 g。

2.2 上樣量對(duì)EPA和DHA分離純化效果的影響

上樣量直接影響層析柱的分離性能，當(dāng)樣品過載程度過大，會(huì)嚴(yán)重降低分離效率，甚至使色譜柱失去分離能力;而上樣量不足，樣液濃度低，擴(kuò)散作用大，也可造成分離效率低。本試驗(yàn)稱取15 g活化過的硅膠與1 g硝酸銀，分別稱取1.0 g(圖2a)、0.75 g(圖2b)、0.6 g(圖2c)和0.5 g(圖2d)混合脂肪酸上樣，EPA和DHA分離純化效果見圖2。

從圖2可以看出，當(dāng)上樣量為1.0 g時(shí)，色譜柱過載，分離效果差;當(dāng)上樣量為0.6 g時(shí)，EPA和DHA與飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的分離有重疊，而且分離出的EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在75%左右;當(dāng)上樣量為0.5 g，脂肪酸濃度太低，EPA和DHA與固定相結(jié)合緊密，需要大量洗脫液才能將其洗脫下來;而當(dāng)上樣量為0.75g時(shí)，圖2b中的曲線幾乎沒有重疊，EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)99%左右，說明其分離效果較好。因此綜合考慮選擇在硅膠用量15 g和硝酸銀用量1 g的情況下上樣量為0.75 g。

圖2 脂肪酸上樣量對(duì)EPA和DHA分離純化效果的影響

2.3 洗脫體系對(duì)EPA和DHA分離純化效果的影響

石油醚的極性較小，對(duì)于飽和脂肪酸有較好的洗脫力，加入無水乙醚調(diào)節(jié)極性后，較適合DHA和EPA等不飽和脂肪酸的徹底洗脫。石油醚具有洗脫飽和脂肪酸時(shí)速度快，洗脫效果徹底等優(yōu)勢(shì)，而洗脫體系中無水乙醚含量的多少對(duì)EPA和DHA的洗脫效果有明顯影響。本試驗(yàn)采用硅膠用量15 g，硝酸銀用量1 g，上樣量0.75 g時(shí)，考察洗脫體系a(圖3a，500 mL 4%無水乙醚的石油醚溶液)、b(圖3b，500 mL 8%無水乙醚的石油醚溶液)、c(圖3c，500 mL 10%無水乙醚的石油醚溶液)、d(圖3d，依次用100 mL石油醚，2%，4%，8%，10%無水乙醚－石油醚溶液各100 mL)等對(duì)EPA和DHA分離純化效果的影響。

圖3 洗脫體系對(duì)EPA和DHA分離純化效果的影響

從圖3可以看出，當(dāng)洗脫體系為a、b、c時(shí)，EPA和DHA與飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的分離都不理想;而當(dāng)洗脫體系為d時(shí)，EPA和DHA的分離效果較好，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)99%左右。因此綜合考慮選擇洗脫體系為d，即依次用100 mL石油醚，2%，4%，8%，10%無水乙醚－石油醚溶液各100 mL進(jìn)行洗脫。

2.4 EPA和DHA的含量分析

采用15 g硅膠與1 g硝酸銀充分混合后裝柱，上樣0.75 g混合脂肪酸，然后依次用100 mL石油醚，2%，4%，8%，10%無水乙醚－石油醚溶液各100 mL進(jìn)行洗脫。對(duì)分離前后的脂肪酸組成進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果見圖4和圖5。

將圖4和圖5進(jìn)行比較分析可以看出，蛇鯔魚油經(jīng)硅膠－硝酸銀色譜柱分離后，EPA和DHA與飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸得到了有效的分離，分離產(chǎn)物中EPA和DHA的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)90%以上。因此，試驗(yàn)結(jié)果表明采用上述分離純化工藝可以獲得高含量的EPA和DHA產(chǎn)物。

2.3 洗脫體系對(duì)EPA和DHA分離純化效果的影響

2.5 FFA的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

準(zhǔn)確稱取銀化硅膠0.1 g加入50 mL 50 mg/mL的游離脂肪酸－石油醚溶液于30℃下恒溫避光振蕩，每隔0.5 h測(cè)定一次上清液中的總脂肪酸濃度(mg/mL)。測(cè)定混合脂肪酸的酸度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，得到混合脂肪酸的酸度變化曲線，結(jié)果見6，同時(shí)計(jì)算相應(yīng)間隔時(shí)間內(nèi)混合脂肪酸的平均吸附量，結(jié)果見7。

從游離脂肪酸的吸附動(dòng)力學(xué)曲線(圖6)可以看出，隨吸附時(shí)間的延長(zhǎng)吸附量增加，約2 h后達(dá)到平衡;從銀化硅膠對(duì)FFA的平均吸附速率曲線(圖7)可以看出，吸附速率在前2 h迅速降低，以后逐漸緩和至平衡后幾乎不再下降，基本符合單分子層吸附理論［6］。

3 結(jié)論

蛇鯔魚油經(jīng)過硅膠－硝酸銀柱色譜分離純化后，EPA和 DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別從 4.43%和13.94%提高至21.47%和70.13%，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)90%以上。因此，硝酸銀－硅膠柱層析法是一種較理想的分離純化EPA和DHA的方法，銀化硅膠對(duì)脂肪酸的吸附符合單分子層吸附理論。

［1］劉書成，章超樺，謝燕，等.脂肪酶水解低值魚油富集EPA和DHA甘油酯的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(3):79－83

［2］De Vries B.Quantitative separations of higher fatty acid methyl esters by adsorption chromatography on silica impregnated with silver nitrate［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，1963，40(5):184 －186

［3］De Vries B.Separation of triglycerides by column chromatography on silica impregnated with silver nitrate［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，1964，41(6):403 －406

［4］Williams C M，Mander L N.Chromatography with silver nitrate［J］.Tetrahedron，2001，57(3):425 －447

［5］邱榕，范維澄.銀離子絡(luò)合物萃取DHA乙酯的絡(luò)合機(jī)理研究.光譜學(xué)與光譜分析，2001，21(3):328－330

［6］張汆，闞建全，陳宗道.硝酸銀－硅膠純化α－亞麻酸的研究［J］.離子交換與吸附，2005，21(01):47 －54

［7］夏向東，呂飛杰，臺(tái)建祥，等.硅膠和硝酸銀硅膠柱層析分離生育酚與生育三烯酚［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，19(03):85－88.

Separation and Purification of EPA and DHA from Saurida elongate Oil by Silver Nitrate－Silica Gel Column

Zhang Liang1，2Liu Meiling1，2Dong Qiang3Liu Shucheng1，2Hao Jiming1，2Zhang Jing1，2
(College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University1，Zhanjiang 524088)
(Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Guangdong Ocean University2，Zhanjiang 524088)
(Product Quality Supervision and Inspection Institute of Xi'an3，Xi'an 474100)

Free fatty acids from saurida elongate oil were prepared by saponification of NaOH－alcohol and acidification of H2SO4.EPA and DHA were then separated and purified by using silver nitrate － silica gel column.The results showed that 15 g silica gel and 1 g silver nitrate were mixed thoroughly and put into the constant temperature chromatography cabinet at 5 ℃.After the balance of the chromatographic column，0.75 g free fatty acid was added and eluted respectively by 100 mL petroleum ether，100 mL petroleum ether of 2%diethyl ether，100 mL petroleum ether of 4%diethyl ether，100 mL petroleum ether of 8%diethyl ether，100 mL petroleum ether of 10%diethyl ether.The eluting speed was controlled at 0.5～1.0 mL/min;the elution was collected after 200 mL and evaporated by rotary evaporator.The contents of EPA and DHA were improved from 4.43 and 13.94%to 21.47%and 70.13%respectively.The total content of EPA and DHA was above 90%.

silver nitrate －silica gel，DHA，EPA，separation

TS254.9

A

1003－0174(2011)12－0063－06

2005粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破招標(biāo)項(xiàng)目(2005A203 01002)，2007年廣東省自然科學(xué)基金(7301127)，廣東海洋大學(xué)引進(jìn)人才基金(0612044)

2011－03－09

張良，男，1987年出生，碩士，水產(chǎn)品加工與貯藏工程

劉書成，男，1977年出生，副教授，碩士生導(dǎo)師，食品科學(xué)與工程