自主復(fù)制序列結(jié)合因子 1結(jié)合位點(diǎn)拷貝數(shù)對基因沉默的影響

張新民 于 群 畢 鑫 劉 楠 王浩天 成 巖 顏煒群 (吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春 300)

抗衰老的主要目的是控制過速衰老,預(yù)防與年齡相關(guān)的疾病的發(fā)生和發(fā)展,提高人的生活質(zhì)量〔1,2〕。目前,對人類生命健康危害最大的疾病是癌癥,癌癥一般是由細(xì)胞內(nèi)一些基因的異常表達(dá)尤其是一些本該沉默的基因表達(dá)引起的〔3～7〕,對于基因表達(dá)沉默的機(jī)制目前還沒研究清楚。真核生物DNA與組蛋白組成核小體進(jìn)而折疊形成染色質(zhì),整個染色質(zhì)分為結(jié)構(gòu)松散的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的常染色質(zhì)和高度濃縮的基因不表達(dá)異染色質(zhì)。釀酒酵母作為一種模式生物解決了許多遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等方面的難題。在釀酒酵母中,第三號染色質(zhì)的 (HML以及HMR)區(qū)域形成了與高等生物異染色質(zhì)相似的特性結(jié)構(gòu)的染色質(zhì)〔8,9〕。釀酒酵母的沉默子 HML-E和 HML-I對其第三號染色質(zhì)的 HML區(qū)域基因沉默起著決定作用,該沉默子由復(fù)制起點(diǎn)識別復(fù)合物 (Origin Recognition Comp lex,ORC)結(jié)合位點(diǎn),Rap1p(Rep resso rActivator Protein)結(jié)合位點(diǎn)和自主復(fù)制序列結(jié)合因子 1(Abf1)所組成,這些結(jié)合位點(diǎn)稱為原沉默子 (p rotosilencer)〔10〕。這些原沉默子獨(dú)自無法產(chǎn)生基因沉默作用,但是與沉默子相互作用下,能夠增強(qiáng)原沉默子或沉默子的基因沉默作用,但增加原沉默子拷貝數(shù)是否能增強(qiáng)基因沉默,甚至是產(chǎn)生基因沉默沒有相關(guān)研究。本研究用右側(cè)帶有報告基因乳清苷酸脫羧酶基因(URA3)的不同拷貝數(shù)的原沉默子 Abf1p結(jié)合位點(diǎn),以及不帶任何結(jié)合位點(diǎn)的序列替代酵母基因組 HML區(qū)域的 HML-I沉默子后發(fā)現(xiàn),Abf1p結(jié)合位點(diǎn)單獨(dú)存在無論拷貝數(shù)多少都無法對右側(cè)沉默基因,而在沉默子存在時,隨著 Abf1p拷貝數(shù)的增加基因沉默的能力逐漸增強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 材料 釀酒酵母菌種 YXB6〔MATa、HMRa、HMLa、ED79-113TSUP4-o、IΔ242、LEU2-GAL10-FLP1、ura3-52、ade2-1、lys1-1、his5-1、can1-100(ciro)〕,大腸桿菌 (DH5α)由本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA taq酶、蛋白胨、酵母提取物購自 Invitrogen公司,DNA T4連接酶,BstB I,Kpn I,HindⅢ,SnaB I等限制性內(nèi)切酶購自 NEB公司。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建 將釀酒酵母第三號染色質(zhì) AatⅡ和 BamH I之間 HML基因序列并插入到 pUC12 AatⅡ和 BamH I之間制成質(zhì)粒 pQY253,接著將 pQY253上的 HML-I沉默子替換成 HMRE沉默子構(gòu)建出 pQY254。接著在 pQY254的 EcoRV位點(diǎn)插入URA3制作出質(zhì)粒 pXZ8。使用點(diǎn)突變 PCR法將 pXZ8的 HMRE的三個結(jié)合位點(diǎn) ORC、Rap1、Abf1依次突變成 Kpn I、Spe I、Mfe I;kpn I、Spe I、Abf1p1p結(jié)合位點(diǎn) ;Kpn I、Abf1p1p 結(jié)合位點(diǎn)、Abf1p1p結(jié)合位點(diǎn);Abf1p1p結(jié)合位點(diǎn)、Abf1p1p結(jié)合位點(diǎn)、Abf1p1p結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒,依次命名為 pXZ10,pXZ11,pXZ12以及pXZ13。

1.3 酵母菌種的構(gòu)建以及 Southern印跡法鑒定 使用BspH I/NgoMⅣ兩個限制性內(nèi)切酶酶切 pXZ10,pXZ11,pXZ12,pXZ13這四個質(zhì)粒,LiAc法轉(zhuǎn)化到釀酒酵母 YXB6中,在缺失尿嘧啶合成缺陷型培養(yǎng)板 (-ura)上進(jìn)行篩選。挑取單克隆菌落,-ura培養(yǎng)液培養(yǎng),玻璃珠法提取基因組 DNA,使用 EcoRV以及BamHⅠ酶切 DNA,以 BglⅡ之間的 URA3基因 DNA為探針Southern印跡鑒定。最后獲得含有 0,1,2,3個 Abf1p結(jié)合位點(diǎn)的酵母菌種 YXZ75,YXZ79,YXZ80,YXZ81。然后再使用兩端帶有 HML-E兩側(cè)的同源序列的 KanMX基因分別替換掉上述菌種的 HML-E,采用 Southern印跡法鑒定菌種,最終依次得到不帶有 HML-E沉默子的酵母菌種 YXZ75DL,YXZ79DL,YXZ80DL,YXZ81DL。菌種構(gòu)建示意圖見圖 1。

1.4 利用URA3基因檢測不同拷貝數(shù) Abf1p結(jié)合位點(diǎn)的基因沉默表型 陽性克隆酵母菌 (YXZ75,YXZ79,YXZ80,YXZ81)在全合成培養(yǎng)基 (SC)中培養(yǎng) 24 h,在 96孔板對菌液進(jìn)行 10倍比稀釋,分別在 SC,-ura,SC+5-氟乳清酸 (FOA)上點(diǎn)樣,在 30℃培養(yǎng) 24 h,48 h,72 h,96 h時,使用掃描儀掃描菌生長狀態(tài)。

圖 1 菌種構(gòu)建示意圖

2 結(jié) 果

2.1 酵母菌種的構(gòu)建以及 Southern印跡法鑒定 pXZ10,pXZ11,pXZ12以及 pXZ13經(jīng) BspH I以及 NgoMⅣ酶切后轉(zhuǎn)化酵母菌種 YXB6,如果同源重組發(fā)生在 HML-I左側(cè),提取基因組DNA經(jīng) EcoRⅤ酶切,Southern印跡鑒定在圖譜上將看到2 384 bp,1 150 bp的兩條特異性的條帶;如果同源重組發(fā)生在HML-I右側(cè),HML-I序列中有一個 EcoRV位點(diǎn),會看到2 384 bp,982 bp兩條特異性條帶,酶切不徹底時還能在1 150 bp附近看到條帶。限制性內(nèi)切酶 EcoRV消化提取基因組DNA的 EtBr膠圖譜,可以看出 DNA條帶彌散,說明消化的比較完全。Southern印跡鑒定的結(jié)果,可以看到陰性對照及所有的菌株都有兩條非特異性的條帶,這是由于該菌種為-ura3-52的突變型菌株,基因組上仍存在一份突變無功能的-ura3基因,它與野生型-ura3基因相同的序列,在陰性對照組 YXB6和轉(zhuǎn)化菌種都會存在一些非特異的條帶;1、2號菌株的 2 384 bp、1 150和982 bp處有三條特異性條帶,這說明同源重組發(fā)生在 HML-I右側(cè) ,未能替代 HML-I。4、6、7、8、10、12、13、15、16 菌株在2 384 bp,1 150 bp的有兩條特異性條帶,說明他們是正確的陽性克隆。由于 YXZ79,YXZ80,YXZ81結(jié)果與 YXZ75相差不多,所以本文中沒有一一列出。見圖 2A～2C。

圖 2 YXZ75菌株的 Southern印跡鑒定結(jié)果

2.2 基因沉默表型的研究 URA3基因是一種在基因沉默研究中廣泛使用的報告基因,在生存環(huán)境中缺失尿嘧啶 (-ura)時,URA3可以被 pp rl1激活從而大量表達(dá),因此-ura培養(yǎng)板菌體生長狀態(tài)反映了URA3基因的激活轉(zhuǎn)錄狀態(tài),在 SC平板上尿嘧啶存在,URA3基因僅僅有少量正常表達(dá),URA3蛋白作用于嘧啶代謝途徑,使 FOA變成一種有毒的代謝產(chǎn)物,引起酵母細(xì)胞死亡,因此 SC+FOA平板上反映了基因沉默的情況。無論是HML-E存在與否,SC平板上酵母的生長狀態(tài)沒有任何區(qū)別,這說明替換 HML-E以及 HML-I沉默子對酵母的正常生命活動沒有影響。在 HML-E沉默子存在的條件下,在-ura培養(yǎng)板上生長狀態(tài)基本沒有區(qū)別,說明原沉默子 Abf1p結(jié)合位點(diǎn)的拷貝數(shù)對激活水平的表達(dá)影響不大;在 SC+FOA平板上,隨著拷貝數(shù)的增加,FOA平板上酵母的生長逐漸變多,說明基因沉默逐漸增強(qiáng)。在 KanMX替換了 HML-E情況下,無論是在-ura還是 SC+FOA平板上,酵母的生長狀態(tài)都沒有任何區(qū)別,說明 Abf1p獨(dú)自無法對右側(cè)的基因產(chǎn)生沉默作用,而且增加拷貝數(shù)也不能。見圖 3。

圖 3 Abf1p結(jié)合位點(diǎn)基因沉默表型示意圖

3 討 論

衰老以及癌癥的發(fā)生與遺傳信息的突變、基因組的重排、表觀遺傳學(xué)的改變?nèi)?DNA的甲基化、組蛋白的乙?；冗@些染色質(zhì)異常有關(guān),這些情況除了遺傳信息突變會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變化外,基本都是基因表達(dá)量發(fā)生了變化,對于這種變化的本質(zhì)目前還沒有研究清楚〔11,12〕。釀酒酵母是一種生物研究的模式生物,酵母基因組與高等生物的染色質(zhì)相似分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)域,基因不表達(dá)的異染色質(zhì) HML區(qū)域形成與沉默子密切相關(guān),沉默子由原沉默子組成,單獨(dú)的原沉默子可以增強(qiáng)沉默子基因沉默的能力,延長沉默子基因沉默的范圍,但是尚未有人研究原沉默子拷貝數(shù)對基因沉默的影響。Abf1是一種DNA位點(diǎn)特異性結(jié)合蛋白,它結(jié)合到 5-TnnCGTnnnnnnTGAT-3特定的保守序列〔13〕。在釀酒酵母基因組的沉默配型座位,復(fù)制子,端粒 X-區(qū)域,許多基因啟動子區(qū)域等許多位置都有Abf1p結(jié)合位點(diǎn)的分布。Abf1p結(jié)合到這些區(qū)域的位點(diǎn)上直接參與許多與染色質(zhì)相關(guān)的事件,例如 DNA復(fù)制,基因沉默,染色質(zhì)重構(gòu),核苷酸剪切,基因的激活與抑制等〔14,15〕。本研究研究了Abf1p在基因沉默中的作用,Abf1p結(jié)合位點(diǎn)單獨(dú)存在時,無論拷貝數(shù)是多少,都無法對外源基因進(jìn)行沉默,HML-E沉默子的存在時,Abf1p結(jié)合位點(diǎn)能對外源基因起沉默作用,并且隨著拷貝數(shù)的增加沉默作用增強(qiáng)。對于其他原沉默子如 Rap1p,ORC結(jié)合位點(diǎn)增加拷貝數(shù)是否能夠增強(qiáng)基因沉默,以及 Abf1p結(jié)合位點(diǎn)增強(qiáng)基因沉默的內(nèi)在機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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