不同鼠齡小鼠脾細胞對過氧化氫誘導(dǎo)DNA損傷的修復(fù)能力

李國棟 閻雪冬 童坦君 張宗玉 (北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部北京大學(xué)衰老研究中心,北京 100191)

DNA損傷修復(fù)學(xué)說是對衰老分子機制科學(xué)闡釋的眾多學(xué)說之一,該學(xué)說認為,生物衰老時修復(fù)損傷 DNA的能力下降,致使基因組損傷不斷積累,最終引起生物衰老。體內(nèi) (自由基)和體外 (紫外線、烷化劑等化學(xué)物質(zhì))多種理化因素均可以誘導(dǎo)細胞DNA的損傷,包括嘧啶二聚體形成、堿基損傷、單雙鏈斷裂和DNA交聯(lián)等。細胞具有多種 DNA修復(fù)方式,比如直接修復(fù)、切除修復(fù)、錯配修復(fù)和轉(zhuǎn)錄修復(fù)等。我中心在細胞 DNA損傷修復(fù)與細胞衰老方面進行了一系列的探索〔1～4〕。小鼠脾細胞對紫外線引起的DNA損傷的修復(fù)能力也隨年齡增長明顯下降〔2〕。甲基磺酸甲酯 (Methylmethanesulfonate,MMS)是一種烷化劑,可引起 DNA鏈斷裂。衰老 2BS細胞對MMS誘導(dǎo)的 DNA損傷修復(fù)能力較年輕細胞明顯下降〔3〕。為了進一步研究其他刺激因素與細胞衰老的關(guān)系,本文首次以 H2O2作為 DNA損傷誘導(dǎo)劑,觀察了不同鼠齡的小鼠脾細胞對 H2O2刺激的敏感性以及DNA修復(fù)能力的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 BALB/c純種小鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心,分青年鼠 (3～6月齡)及老年鼠 (28～32月齡)兩個年齡組,每組 3只小鼠,雌雄隨機。細胞培養(yǎng)基 RPM I 1640為G IBCO/BRL公司產(chǎn)品,胎牛血清為北京北郊農(nóng)場血液制品所產(chǎn)品,刀豆蛋白 A(ConA)為美國 Sigma公司產(chǎn)品,3H-TdR購自中國原子能科學(xué)研究所,H2O2為北京化工廠產(chǎn)品,其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純級。

1.2 脾細胞的制備 取小鼠脾臟,用 Hanks液洗 1次,然后換新的 Hanks液,在不銹鋼紗網(wǎng)上磨碎,濾過的脾細胞1 000 r/min離心 5 m in,棄上清液,按每 108細胞加入 3 ml Tris氯化銨紅細胞溶解緩沖液和 3 m l Hanks液,混合靜置5～10 m in,于1 000 r/m in離心 5 min,棄上清液,細胞沉淀用 Hanks液洗兩次后,重懸于含 10%胎牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)液,調(diào)整細胞濃度為 1×107細胞 /m l。加入 ConA至 3 mg/m l,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 S1核酸酶消化實驗 用 200μmol/L H2O2處理脾細胞,冰浴 1 h,然后提取細胞基因組 DNA。取上述基因組 DNA 30μg,加入 S1核酸酶 10μg,再加入 10×S1核酸酶緩沖液150μl(0.28 mol/L NaCl,50 mmol/L NaAc,4.5 mmol/L ZnSO4,pH4.5),補水至總體積 1.5 m l。于 37℃保溫1 h,冰浴驟冷后,加入 0.5 ml 2N的高氯酸 (PCA)終止反應(yīng),離心,收集上清液及沉淀。將沉淀的 DNA加入 0.5 m l 0.5 N的 PCA,在 90℃保溫15 m in,水解沉淀的 DNA。分別測定 S1核酸酶消化的上清液及沉淀水解液的 DNA含量,計算 S1核酸酶對 DNA的消化率,消化率 %=上清液的 DNA含量 /(上清液的 DNA含量 +沉淀水解液的 DNA含量)×100。

1.4 非程序性DNA合成 將脾細胞用 RPM I1640稀釋至 1×107細胞/m l,每個樣品取 1 m l細胞懸液。向培養(yǎng)液中加入5 mmo l/L羥基脲 (Hydroxyurea,HU)以抑制 DNA半保留復(fù)制,37℃培養(yǎng) 1 h后,再加入 200μmol/L H2O2處理 1 h(對照組只用 HU處理,不加 H2O2)。離心收集沉淀的細胞,然后用 Hanks液洗兩次,重新將細胞懸浮于含 5 mmol/L HU、2μCi/ml3H-TdR的培養(yǎng)液中,37℃繼續(xù)培養(yǎng)不同的時間。將上述細胞收集到玻璃纖維膜上,分別以 10 m l磷酸鹽緩沖液 (PBS),5 m三l氯乙酸 (TCA),5 ml無水乙醇洗膜,將膜 80℃干烤30 m in,放入8 m閃 l爍液中,以Beckman LS8000型液閃計數(shù)儀測定放射性計數(shù)率 (CPM)值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理,數(shù)據(jù)資料以表示,組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 單鏈DNA含量對比分析 S1核酸酶能夠高度特異的水解單鏈DNA,故可用于單鏈DNA含量的測定。未經(jīng) H2O2處理時,老年鼠脾細胞單鏈 DNA的基礎(chǔ)含量高于青年鼠 (P＜0.05),經(jīng) H2O2處理后,兩組小鼠的單鏈 DNA含量與處理前相比均有明顯提高 (P＜0.01)。提示無論老年鼠還是青年鼠的脾細胞 DNA均可被 H2O2氧化損傷,但最終的損傷程度兩組之間沒有明顯差別。在小鼠脾細胞的 DNA損傷修復(fù)實驗中,細胞經(jīng) H2O2處理后,更換正常培養(yǎng)液并于 37℃繼續(xù)培養(yǎng) 6 h,以使DNA進行修復(fù)。修復(fù)結(jié)果表明,老年鼠和青年鼠的單鏈 DNA含量均明顯下降,但青年鼠的下降比例 (13.4%)顯著大于老年鼠 (6.8%)(P＜0.05),小鼠脾細胞對單鏈 DNA損傷的修復(fù)能力隨年齡的增加而明顯下降。見表 1。

表 1 不同鼠齡小鼠脾細胞DNA修復(fù)前后的單鏈DNA含量

表 1 不同鼠齡小鼠脾細胞DNA修復(fù)前后的單鏈DNA含量

與青年鼠比較:1)P＜0.05,與未處理組比較:2)P＜0.01

青年鼠 6.6±2.1 31.9±4.82) 18.5±2.8老年鼠 12.7±3.11) 40.1±6.02) 33.3±4.51)

2.2 切除修復(fù)能力對比分析 與細胞 DNA復(fù)制不同,細胞損傷時修復(fù)性的 DNA合成主要存在于其他細胞周期,稱為非程序性 DNA合成 (Unscheduled DNA Synthesis,UDS),因此 UDS水平的高低常用于指示細胞對DNA損傷的切除修復(fù)能力。青年鼠在 H2O2刺激大約 12 h后3H-TdR摻入值 (CPM)達到高峰,盡管老年鼠此時也基本達到最大值,但其測量值的絕對水平大約只有青年鼠的 1/3(P＜0.01)。H2O2刺激導(dǎo)致脾細胞DNA損傷后,老年鼠DNA切除修復(fù)的啟動速度和修復(fù)程度均遠遠低于青年鼠。見表 2。

表 2 不同鼠齡小鼠脾細胞經(jīng) H2 O2處理后的切除修復(fù)能力

表 2 不同鼠齡小鼠脾細胞經(jīng) H2 O2處理后的切除修復(fù)能力

與青年鼠比較:1)P＜0.01

組別 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h青年鼠 43±12 174±21 207±25 360±40 348±38老年鼠 40±19 81±221) 91±141) 130±201) 139±231)

3 討 論

H2O2可由內(nèi)源性代謝產(chǎn)生,在 Fe2+的參與下通過 Fenton反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧化活性更強的羥基自由基,后者攻擊 DNA雙鏈結(jié)構(gòu),可使 DNA的單鏈和雙鏈斷裂,是加速細胞衰老進程的重要因素之一。既往研究顯示,H2O2可誘導(dǎo)人二倍體成纖維細胞(2BS細胞)的不可逆性早衰并伴隨 DNA修復(fù)能力的明顯下降〔4〕。本實驗首次研究了不同鼠齡小鼠脾細胞對 H2O2的敏感性并對比分析了它們的 DNA損傷修復(fù)能力。結(jié)果表明,老年鼠和青年鼠對 H2O2的刺激表現(xiàn)出了相似的敏感性,但 DNA的修復(fù)合成能力差異很大。

DNA損傷修復(fù)是個很復(fù)雜的過程,首先是共濟失調(diào)-毛細血管擴張突變基因 (AT M)、p53等蛋白分子對損傷部位的識別與信號傳遞,通過誘發(fā)蛋白激酶瀑布效應(yīng)引起細胞周期阻滯并最終啟動 DNA修復(fù)〔5〕。DNA修復(fù)包括直接修復(fù)、切除修復(fù)、錯配修復(fù)、重組修復(fù)等多種機制。H2O2導(dǎo)致的 DNA損傷以單鏈斷裂更為常見,出現(xiàn)頻率大約為雙鏈斷裂的 2 000倍。DNA單鏈斷裂的主要修復(fù)途徑是依賴 DNA連接酶的重接修復(fù),是DNA直接修復(fù)的一種。單鏈特異性的 S1核酸酶消化實驗顯示,H2O2刺激可以明顯增加不同年齡小鼠脾細胞的單鏈 DNA的含量,但是老年鼠對DNA單鏈斷裂的修復(fù)能力低于青年鼠。切除修復(fù)是一種多組分、多步驟的修復(fù)途徑,普遍存在于各種生物細胞中,是真核細胞最主要的 DNA修復(fù)機制。切除修復(fù)包括堿基切除修復(fù) (Base excision repair,BER)和核苷酸切除修復(fù) (Nucleotide excision repair,NER)兩種,可以修復(fù)包括嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂、DNA交聯(lián)等多種損傷。非程序性DNA合成 (UDS)是一種檢測切除修復(fù)的經(jīng)典方法,本試驗的結(jié)果顯示,老年鼠脾細胞在 H2O2刺激后,不僅單鏈斷裂的直接修復(fù)能力比青年鼠顯著下降,而且 DNA的切除修復(fù)能力也明顯降低。綜上,H2O2能夠誘導(dǎo)小鼠脾細胞的 DNA損傷,老年小鼠對該損傷的修復(fù)能力明顯低于青年鼠,從而為 DNA損傷積累參與衰老過程的科學(xué)論斷提供了新的實驗依據(jù)。

1 Tian F,Tong TJ,Zhang ZY,et a l.Age-dependent down-Regulation ofmitochondrial 8-oxoguanine DNA glycosylase in SAM-P/8 mouse brain and its effect on brain〔J〕.Rejuvenation Res,2009;12(3):209-15.

2 閆雪冬,張宗玉,童坦君 .老年小鼠脾細胞DNA修復(fù)能力的變化及gadd45和 gadd153基因的可誘導(dǎo)性改變〔J〕.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1999;31(4):289-92.

3 段建明,張宗玉,童坦君 .人衰老二倍體成纖維細胞對烷化劑損傷的應(yīng)答〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2003;22(5):288-91.

4 Duan J,Duan J,Zhang ZY,et a l.Irreversible cellular senescence induced by p rolonged exposure to H2O2involves DNA-damage-and-repair genes and telomere shortening〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2005;37(7):1407-20.

5 于廷曦,朱應(yīng)葆,童坦君 .DNA損傷與細胞周期調(diào)控〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進展,1999;26(4):350.

〔2010-05-10收稿 2010-07-16修回〕