豬戊型肝炎病毒swCH189株衣殼蛋白基因CP239片段原核表達(dá)條件的優(yōu)化

郝寶成 梁劍平 蘭喜 刑小勇 項海濤 溫峰琴 胡永浩 柳紀(jì)省

摘要：為了提高豬戊型肝炎病毒ｓｗＣＨ１８９株衣殼蛋白基因ＣＰ２３９片段在大腸桿菌中的表達(dá)量，研究了載體、溫度、轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)時間以及誘導(dǎo)劑ＩＰＴＧ濃度等不同條件對衣殼蛋白基因ＣＰ２３９片段融合蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，用ＬＢ培養(yǎng)基于３７ ℃培養(yǎng)３．５ ｈ后，采用終濃度為０．３ ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ在３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ誘導(dǎo)培養(yǎng)４ ｈ，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白表達(dá)量最大；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結(jié)果表明ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致，約為４５．３ ｋｕ；Ｗｅｓｔｅｒｎ blotting結(jié)果表明，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白可以與抗－ＨＥＶ陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，并具有良好的反應(yīng)原性，說明衣殼蛋白基因ＣＰ２３９片段蛋白得到正確表達(dá)。

關(guān)鍵詞：豬戊型肝炎病毒；衣殼蛋白；ＣＰ２３９片段；原核表達(dá)

中圖分類號：Ｑ７８６文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3116-04

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｎｅ ＣＰ２３９ ｉｎ ｔｈｅ ｓｗＣＨ１８９ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Vｉｒｕｓ

ＨＡＯ Ｂａｏ－ｃｈｅｎｇ１，２，ＬＩＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ１，３，ＬＡＮ Ｘｉ２，ＸＩＮＧ Ｘｉａｏ－ｙｏｎｇ３，ＸＩＡＮＧ Ｈａｉ－ｔａｏ３，ＷＥＮ Ｆｅｎｇ－ｑｉｎ３，

ＨＵ Ｙｏｎｇ－ｈａｏ３，ＬＩＵ Ｊｉ－ｘｉｎｇ２，３

（１． Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｉｍａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｊｅｃｔ／Ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｉｍａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０，Ｃｈｉｎａ；２． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａｎｚｈｏｕ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ／Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ ｐｌａｎｔ－ｅａｔｉｎｇ ａｎｉｍａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎ Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００４６， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： To improve ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｇｅｎｅｓ ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ ｓｗＣＨ１８９ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．， ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｒｏｔａｔｉｎｇ ｓｐｅｅｄ， ｉｎｄｕｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ was ａｎａｌｙｓｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ ｗａｓ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ３．５ ｈ ｗｉｔｈ ＬＢ ａｔ ３７ ℃ ａｎｄ ４ ｈ ｉｎｄｕｃｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ａｔ ３７ ℃，２００ ｒ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ４５．３ ｋｕ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ Ａｎｔｉ－ＨＥＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｗｉｔｈ ｗｅｌｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗａｓ ｐｒｏｐｅｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．

Ｋｅｙ wｏｒｄｓ： sｗｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ； cａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＣＰ２３９ ｆｒａｇｍｅｎｔ； pｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

戊型肝炎病毒（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ，ＨＥＶ）過去曾被認(rèn)為是一種經(jīng)腸道傳播的非甲非乙型肝炎病毒。Ｂａｌａｇａｎ等［１］用免疫電鏡技術(shù)從一名志愿受試者糞便中觀察到直徑為２７～３０ ｎｍ的病毒樣顆粒，從而證實該病毒為新型的肝炎病毒，并對人類健康具有嚴(yán)重的危害性。ＨＥＶ基因組為單股正鏈ＲＮＡ，約７．３ ｋｂ，具有３個開放讀碼框（ＯＲＦ）。病毒基因組的５′端到３′端依次為５′端非編碼區(qū)、ＯＲＦ１、ＯＲＦ３、ＯＲＦ２、３′端非編碼區(qū)及ｐｏｌｙＡ 尾。

ＨＥＶ ＯＲＦ２編碼蛋白（ＰＯＲＦ２）抗原表位數(shù)量多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除Ｎ端２５－３８ ａａ外，大多數(shù)分布在Ｃ端２／３部分，包括了ＰＯＲＦ２ ２５－３８ ａａ、３１９－３４０ ａａ、３４１－３５４ ａａ、３９０－４７０ ａａ、４２２－４３７ ａａ、５１７－５３０ ａａ、５４６－５８０ ａａ、６３１－６４８ ａａ、６４１－６６０ ａａ等９個抗原活性區(qū)，研究還證實在３９４－４７０ ａａ之間至少含有５個不同免疫活性的抗原表位［２－４］。本試驗利用ｐｒｏｔｅａｎ軟件對ＨＥＶ ｓｗＣＨ１８９株的ＯＲＦ２進(jìn)行潛在抗原位點分析。在ＯＲＦ２ Ｃ端２／３處選?。茫校玻常蛊危ǎ常福保叮玻?ａａ）進(jìn)行了原核表達(dá)，在克隆和表達(dá)了ＣＰ２３９片段的基礎(chǔ)上對其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得最大產(chǎn)量的融合蛋白用于建立快速診斷方法。

１材料與方法

１．１病毒株

經(jīng)ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＨＥＶ ＲＮＡ為陽性的ｓｗＣＨ１８９株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所傳染病實驗室保存。

１．２菌種和載體

菌種為大腸桿菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，表達(dá)菌Rｏｓｅｔｔａ及表達(dá)載體ｐＥＴ２８ａ（＋）、ｐＥＴ３２ａ（＋）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所傳染病實驗室保存?？寺≥d體ｐＭＤ１８－Ｔ載體購自大連寶生物工程公司。

１．３試劑

辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬ＩｇＧ抗體、ＤＡＢ為鵬程公司產(chǎn)品。ＲＮａｓｅ、低分子蛋白質(zhì)Ｍａｒｋｅｒ、瓊脂糖購自聯(lián)創(chuàng)公司。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 蛋白Ｍａｒｋer購自鵬程公司。其余試劑均為分析純或生化試劑。

１．４融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

含ＣＰ２３９基因的重組質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ－ＣＰ２３９、ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９和ｐＥＴ２８ａ、ｐＥＴ３２ａ空載體分別導(dǎo)入表達(dá)受體菌Ｒｏｓｅｔｔａ中，挑取單菌落于３７ ℃培養(yǎng)至ＯＤ６００nm≈０．６，加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)一定時間，并以空菌、空載體和未加ＩＰＴＧ的培養(yǎng)物作為對照；菌體離心后棄上清液，沉淀重懸于１０ ｍＬ含２％ ＤＯＣ的細(xì)菌裂解液，振蕩混勻，室溫放置１５ ｍｉｎ，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。取沉淀再重復(fù)上述步驟２次，上清液均留樣。使用最小體積的４ mol/L的尿素將沉淀溶解，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ。沉淀中若仍有透明未溶解物質(zhì)，再用８ mol/L的尿素溶解，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，棄沉淀。重懸后加入２倍ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上樣緩沖液混勻，沸水煮５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ/ｍｉｎ離心１ ｍｉｎ后取上清液進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測，鑒定目的基因的表達(dá)情況。

１．５融合蛋白的鑒定

Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌotting鑒定融合蛋白，即樣品經(jīng)１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離后，按Ｂｉｏ．Ｒａｄ濕轉(zhuǎn)使用說明將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，２００ ｍＡ，１０５ ｍｉｎ完成濕轉(zhuǎn)。用５％牛血清３７ ℃封閉液室溫封閉２ ｈ。將硝酸纖維素膜放入干凈的塑料袋中，加用封閉液稀釋的人抗－ＨＥＶ陽性血清（１ ０００倍稀釋），封閉塑料袋，室溫?fù)u擺平臺過夜。１００ ｍＬ ＰＢＳＴ洗膜５次，每次１５ ｍｉｎ。加入用封閉液以１ ０００倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬ＩｇＧ抗體，室溫溫育２ ｈ。１００ ｍＬ ＰＢＳＴ洗膜５次，每次１５ ｍｉｎ，ＡＥＣ（３－氨基－９－乙基卡唑，３－ａｍｉｎｏ－９－ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｚｏｌｅ）顯色１５ ｍｉｎ，用濾紙吸干膜上殘余液體，拍照保存。

２結(jié)果與分析

２．１不同表達(dá)載體對ＣＰ２３９表達(dá)量的影響

分別將ｐＥＴ２８ａ－ＣＰ２３９、ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９的重組菌１％接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養(yǎng)基中，３７ ℃ 搖床培養(yǎng)３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，３７ ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)４ ｈ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 檢測結(jié)果表明ｐＥＴ３２ａ中ＣＰ２３９表達(dá)量較高， ｐＥＴ２８ａ中表達(dá)量較低，因此ｐＥＴ３２ａ是比較適合ＣＰ２３９表達(dá)的載體。

２．２溫度對重組菌生長和ｐＥＴ３２a－ＣＰ２３９表達(dá)量的影響

重組菌１％ 接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養(yǎng)基中，３７ ℃培養(yǎng)３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，分別在２２、３０、３７ ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結(jié)果表明，３７ ℃時ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達(dá)量最高，30 ℃時表達(dá)量稍低，而在２2 ℃時表達(dá)量更低。

２．３轉(zhuǎn)速對重組菌生長和ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達(dá)量的影響

重組菌１％接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養(yǎng)基中，３７ ℃培養(yǎng)３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ， 分別在３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ和３７ ℃、１００ ｒ／ｍｉｎ誘導(dǎo)培養(yǎng)４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速對ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９的影響很大，３７ ℃、１００ ｒ／ｍｉｎ誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達(dá)量較低。

２．４ＩＰＴＧ使用濃度對重組菌生長和ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達(dá)量的影響

ＩＰＴＧ是重組菌表達(dá)目的蛋白的誘導(dǎo)劑，將重組菌１％的接種量接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養(yǎng)基中，３７ ℃培養(yǎng)３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，分別加入不同終濃度的ＩＰＴＧ（０．１、０．３、０．５、０．７、１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ）誘導(dǎo)表達(dá)。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結(jié)果表明，ＩＰＴＧ對ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的表達(dá)量有明顯影響，加ＩＰＴＧ前基本不表達(dá)； 在濃度小于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ時表達(dá)量較小，在濃度等于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ時能完全表達(dá)，在濃度大于０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ時也能完全表達(dá)，因此，在濃度為０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ時，表達(dá)最優(yōu)（圖１）。

２．５ＩＰＴＧ誘導(dǎo)時間對ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９表達(dá)量的影響

重組菌１％ 接種于含氨芐西林抗性的ＬＢ培養(yǎng)基中，３７ ℃培養(yǎng)３．５ ｈ至ＯＤ６００nm≈０．６，加入終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，誘導(dǎo)時間分別從１ ｈ至８ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳結(jié)果表明，ＩＰＴＧ誘導(dǎo)培養(yǎng)４ ｈ時ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白的表達(dá)量較高，大于４ ｈ后表達(dá)量已沒有明顯差別。

２．６Ｗｅｓｔｅｒｎ blotting鑒定結(jié)果

在優(yōu)化條件下，將含重組質(zhì)粒ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９ 的大腸桿菌菌株Ｒｏｓｅｔｔａ在３７ ℃培養(yǎng)３．５ ｈ后，使用終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ在３７ ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)４ ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結(jié)果表明，融合后的目的蛋白為單一條帶，大小約為４５．３ ｋｕ，與預(yù)計的分子質(zhì)量大小相符合（圖２）；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂlotting結(jié)果表明，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９融合蛋白可以與抗－ＨＥＶ陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，并具有良好的反應(yīng)原性。

３討論

大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉，可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點［５］，而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其他基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的３０％，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)［６］。

目前人們運用基因工程技術(shù)已在大腸桿菌中成功地表達(dá)了許多重要的生物活性蛋白基因，但是由于目的基因結(jié)構(gòu)的多樣性及其與大腸桿菌基因的差異，不同的外源基因在表達(dá)效率上有很大的差異。表達(dá)系統(tǒng)的核心是表達(dá)載體。用來在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的載體有很多種，一般來說，這些載體應(yīng)滿足以下要求：重組質(zhì)?？截悢?shù)多，表達(dá)量高；適用范圍廣；表達(dá)產(chǎn)物容易純化；在菌體內(nèi)穩(wěn)定性好。不同載體的特點不同，主要的差別有啟動子類型、質(zhì)?？截悢?shù)、基因本身的因素、密碼子的偏愛性等，宿主菌的特點也很重要，融合表達(dá)策略也有利于順利表達(dá)外源蛋白。這些就決定了對某一個特定的基因而言，并非所有的表達(dá)載體都適合。因此在本試驗中，通過不同表達(dá)載體與宿主菌﹑培養(yǎng)條件適宜的組合來使目的蛋白獲得最大量的表達(dá)。

從實驗結(jié)果看溫度對目的蛋白表達(dá)量的高低影響較小。試驗選擇３７ ℃作為誘導(dǎo)溫度，是因為目的基因在低溫時表達(dá)稍低，在高溫時又常常會使一些蛋白積累形成包涵體［７］。誘導(dǎo)溫度對表達(dá)量有影響，主要體現(xiàn)在對宿主后續(xù)生長的影響上。

異丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而且十分穩(wěn)定，因此ＩＰＴＧ是實驗室常用的乳糖操縱子誘導(dǎo)劑，能與ｌａｃ?譙編碼的阻遏蛋白特異性結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，從而誘導(dǎo)Ｔ７啟動子驅(qū)動重組基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，是一種十分有效的誘導(dǎo)劑［８］。Ｆａｓｓ等［９］早在１９９１年的研究表明ＩＰＴＧ的劑量有一定范圍，濃度過低影響目的蛋白的表達(dá)，濃度過高則抑制細(xì)菌的生長，在培養(yǎng)基中少量存在時就可進(jìn)入菌體內(nèi)部發(fā)揮作用，是一種非代謝的誘導(dǎo)物。試驗采用ＩＰＴＧ作誘導(dǎo)劑，從圖１可以看出，ＩＰＴＧ對基因的表達(dá)有關(guān)鍵性的影響。與誘導(dǎo)前相比，加入ＩＰＴＧ后目的基因表達(dá)條帶明顯增加，但不同終濃度ＩＰＴＧ對融合蛋白的表達(dá)量影響較小。當(dāng)ＩＰＴＧ濃度增加到１ ｍｍｏｌ／Ｌ時，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表達(dá)量較大，繼續(xù)增加ＩＰＴＧ的濃度，ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表達(dá)量不增加反而略有下降，這可能是由于較高濃度的乳糖提高了細(xì)菌的生長速度，當(dāng)細(xì)菌過快生長時，質(zhì)粒的拷貝數(shù)降低，導(dǎo)致表達(dá)量下降。在本試驗中ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)的最佳終濃度為０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ。

誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)量有一定影響，誘導(dǎo)時間太短，菌體量少，目的蛋白量也少；誘導(dǎo)時間太長，則菌體老化，酶體系統(tǒng)活性減弱，代謝速度減慢，轉(zhuǎn)錄翻譯遲鈍，不利于目的蛋白的表達(dá)。從試驗中發(fā)現(xiàn)，３７ ℃誘導(dǎo)４ ｈ時ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ２３９蛋白的表達(dá)量最大，誘導(dǎo)時間過短蛋白表達(dá)量稍低，誘導(dǎo)時間過長，表達(dá)量已經(jīng)恒定，延長時間表達(dá)已沒有意義，且誘導(dǎo)時間達(dá)７ ｈ以上時，蛋白的表達(dá)量反而降低。原因可能是由于細(xì)菌生長接近飽和而老齡菌體增加所致，有研究報道如果再更換等體積新鮮培養(yǎng)基誘導(dǎo)或可獲得更高的蛋白表達(dá)量［１０］。

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