南瓜多糖水解工藝優(yōu)化研究

杜秉健，李全宏

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083)

南瓜多糖水解工藝優(yōu)化研究

杜秉健，李全宏*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083)

南瓜資源豐富，本實(shí)驗(yàn)從利用南瓜中的重要成分南瓜多糖入手，研究了時(shí)間(x1)、溫度(x2)和酸濃度(x3)對(duì)酸水解南瓜多糖制備低聚糖工藝的影響，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳工藝為:時(shí)間171min;溫度64℃;硫酸濃度7.3%。在這個(gè)條件下獲得的總糖含量為33.362mg/mL，同時(shí)平均聚合度為3000，達(dá)到了保護(hù)多糖含量的同時(shí)實(shí)現(xiàn)南瓜多糖的可控降解的目的，為南瓜的深加工利用和提高附加值提供了新的途徑。

南瓜，多糖，酸水解，響應(yīng)面

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜 新鮮、無(wú)病蟲(chóng)害、充分成熟，市售;3，5-二硝基水楊酸顯色劑(DNS試劑) 取3，5-二硝基水楊酸6.3g，氫氧化鈉21g，溶于酒石酸鉀鈉的熱溶液(182g酒石酸鉀鈉溶于500mL熱水)中，再加5g苯酚，5g無(wú)水亞硫酸鈉，攪拌加熱溶解，冷卻后定容至1000mL，置棕色瓶?jī)?nèi)保存，7d后標(biāo)定和使用;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;其它試劑 均為分析純。

食物調(diào)理機(jī) 德國(guó)BROWN公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠; Hitachi Himac CR22g高速冷凍離心機(jī) 日本日立株式會(huì)社;S22-2磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器有限公司; DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 普析通用;高效液相色譜儀 德國(guó)KNAUER公司;冷凍干燥機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南瓜多糖的提取 新鮮南瓜，-18℃緩凍24h，洗凈，切塊，打磨成漿。以料液比1∶4(w/v)加入去離子水，于85℃水浴中浸提4h，4200r/min離心15min，收集上清液，殘?jiān)?∶4(w/v)的去離子水在85℃水浴中再浸提3h，離心，合并兩次上清液。向上清液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌30min，然后在4℃冰箱靜置12h，4800r/min離心10min，分離醇沉物，凍干作為多糖樣品［8］。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 時(shí)間對(duì)南瓜總糖含量和聚合度的影響 取1g多糖于20mL 7.5%(V/V)的硫酸溶液中，在70℃下分別水解 60、120、180、240、300、360min后，用0.5mol/L的NaOH溶液中和至中性，測(cè)定還原糖與總糖含量。

1.2.2.2 溫度對(duì)南瓜總糖含量和聚合度的影響 取1g多糖于20mL 7.5%(V/V)的硫酸溶液中，分別在40、50、60、70、80℃下水解180min后，用0.5mol/L的NaOH溶液中和至中性，測(cè)定還原糖與總糖含量。

1.2.2.3 硫酸濃度對(duì)南瓜總糖含量和聚合度的影響

取1g多糖分別于20mL 2.5、5.0、7.5、10.0的12.5% (V/V)硫酸溶液中，在70℃下水解180min后，用0.5mol/L的NaOH溶液中和至中性，測(cè)定還原糖與總糖含量。

1.2.3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù) Design Expert 7.0.0軟件，采用Central Composite Design建立數(shù)學(xué)模型，以時(shí)間X1、溫度X2和硫酸濃度X3三個(gè)因子為自變量。其中，Xi為自變量的真實(shí)值，xi為自變量的編碼值，按方程xi=(Xi-Xo)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼。Xo為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，ΔX為自變量的變化步長(zhǎng)。以平均聚合度和總糖含量為響應(yīng)值，建立回歸方程模型。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用三因素五水平的響應(yīng)面法，實(shí)驗(yàn)因子編碼及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面三因素五水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 總糖含量的測(cè)定［9］總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作如下:稱取葡萄糖1.00g溶于去離子水，定容至100mL，取1mL定容至100mL，即制得100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。分別移取配制的100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL于試管，以去離子水定容至1.0mL，即得不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL)，加入1.0mL的6%苯酚溶液，然后加入濃硫酸5.0mL，室溫靜置20min，以0管為空白，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其他各管溶液的吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以490nm吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為Y=0.00986x-0.0392。

將多糖水解液稀釋合適的倍數(shù)，取稀釋液1.0mL，按照上述步驟操作，測(cè)定吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總糖含量。

1.2.4.2 還原糖含量的測(cè)定［10］還原糖含量的測(cè)定采用DNS法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作如下:取8支干凈的試管分別加入0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0mL的1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、3.0mL DNS試劑，補(bǔ)充去離子水到4.0mL，沸水浴反應(yīng)10min后，迅速放入冰水浴中冷卻，稀釋至 20.0mL，以蒸餾水做空白，在540nm處測(cè)定溶液的吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以540nm吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為Y=0.8564x-0.0142。

將多糖水解液稀釋合適的倍數(shù)，取稀釋液1.0mL，按照上述步驟操作，測(cè)定吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算還原糖含量。

1.2.4.3 平均聚合度的計(jì)算［11］見(jiàn)下式:

平均聚合度=總糖/還原糖

1.2.4.4 軟件分析 本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析軟件采用SPSS16.0，作圖軟件采用Origin 8.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同水解程度南瓜多糖的平均聚合度

從圖1中可以看出，降解后得到的不同平均聚合度的糖樣品的分子量分布明顯不同。圖中a為未降解的南瓜多糖樣品，平均聚合度為24519;b、c、d為南瓜多糖經(jīng)酸水解制備的南瓜低聚糖樣品，平均聚合度分別為4977、3374、2945。

圖1 時(shí)間對(duì)總糖含量和平均聚合度的影響

樣品a分子量主要分布于5000Da以上，最大分子量延伸到2.7×105Da;經(jīng)過(guò)一定程度降解的樣品b其12000Da以上的分子量分布明顯減少，分子量在5000Da以下的產(chǎn)物明顯增多，其中低于麥芽糖的小分子單糖產(chǎn)物顯著增多;樣品c的降解程度更深，其5000Da以上的分子量分布較b明顯減少，低于麥芽糖的小分子單糖產(chǎn)物略為增多;樣品d的降解程度最深，其幾乎沒(méi)有高于麥芽糖以上的小分子單糖產(chǎn)物，樣品中主要組成物質(zhì)為單糖。

所以在南瓜多糖降解過(guò)程中，用平均聚合度的變化來(lái)描述分子量的分布變化是穩(wěn)定、可行的。

因此，為了充分降解南瓜多糖制備南瓜低聚糖，在高效液相色譜分析實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選取平均聚合度3000作為響應(yīng)值優(yōu)化的目標(biāo)值。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 時(shí)間對(duì)總糖含量和聚合度的影響 圖2結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為240min時(shí)，所得總糖含量最高，達(dá)到35.18mg/mL。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于240min時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)總糖含量逐漸增高;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于240min時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)總糖含量逐漸下降。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，聚合度逐漸下降。

圖2 時(shí)間對(duì)總糖含量和平均聚合度的影響

2.2.2 溫度對(duì)總糖含量和聚合度的影響 圖3結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，所得總糖含量最高，達(dá)到37.19mg/mL。當(dāng)反應(yīng)溫度小于60℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的增加總糖含量逐漸增高;當(dāng)反應(yīng)溫度大于60℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的增加總糖含量逐漸下降。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的延長(zhǎng)，聚合度逐漸下降。

圖3 溫度對(duì)總糖含量與平均聚合度的影響

2.2.3 硫酸濃度對(duì)總糖含量和聚合度的影響 圖4結(jié)果表明，當(dāng)硫酸濃度為7.5%時(shí)，所得總糖含量最高，達(dá)到34.6mg/mL。當(dāng)硫酸濃度小于7.5%時(shí)，隨著硫酸濃度的增加，總糖含量逐漸增高;當(dāng)硫酸濃度大于7.5%時(shí)，隨著硫酸濃度的增加總糖含量逐漸下降。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著硫酸濃度的增加，聚合度逐漸下降。

圖4 硫酸濃度對(duì)總糖含量和平均聚合度的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化南瓜低聚糖提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 表2中給出了總糖含量和平均聚合度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.1.1 總糖含量的分析 按照Design Expert軟件中的Central Composite Design模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各組的總糖含量進(jìn)行回歸分析，得回歸方程如下:Y1= 33.34-0.18x1-0.46x2-0.22x3-0.17x1x2+0.24x1x3+ 0.035x2x3-0.077-0.15-1.55(Y1為總糖含量，x1、 x2、x3分別為上述3個(gè)自變量的編碼值)。該模型的相關(guān)系數(shù)是0.8335(p＜0.05)，模型的擬合度良好，該模型是合適的，可以用此模型分析和預(yù)測(cè)不同水解條件下總糖含量的變化。對(duì)模型進(jìn)行回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(表3)，由此可知，溫度對(duì)總糖含量的影響顯著，硫酸濃度的二次項(xiàng)對(duì)總糖含量的影響極顯著。依據(jù)一次項(xiàng)回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小可知，因素的主效應(yīng)關(guān)系為:溫度＞硫酸濃度＞時(shí)間。

表3 回歸方程模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)模型的回歸方程，固定一個(gè)因素在編碼值0的水平，分析另外兩個(gè)因素對(duì)總糖含量的影響，Design Expert軟件生成3個(gè)三維響應(yīng)面(圖5～圖7)。從圖5可以看出，硫酸濃度在7.5%時(shí)，溫度和時(shí)間對(duì)總糖含量的影響。從圖6可以看出，溫度在60℃時(shí)，時(shí)間和硫酸濃度對(duì)總糖含量的影響。從圖7可以看出，時(shí)間在240min時(shí)，溫度和硫酸濃度對(duì)總糖含量的影響。

圖5 溫度和時(shí)間對(duì)總糖含量影響的響應(yīng)面

圖6 硫酸濃度和時(shí)間對(duì)總糖含量影響的響應(yīng)面

圖7 溫度和硫酸濃度對(duì)總糖含量影響的響應(yīng)面

2.3.1.2 平均聚合度的分析 按照Design Expert軟件中的Central Composite Design模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各組的平均聚合度進(jìn)行回歸分析，得回歸方程如下:Y2=3106.99-407.18x1-1797.52x2-406.01x3+140.26x1x2+73.90x1x3+204.91x2x3+74.45x+372.51x-266.67x(Y2為平均聚合度;x1、x2、x3分別為上述3個(gè)自變量的編碼值)。該模型的相關(guān)系數(shù)是0.9856 (p＜0.05)，模型的擬合度良好，該模型是合適的，可以用此模型分析和預(yù)測(cè)平均聚合度隨水解條件的變化。對(duì)模型進(jìn)行回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(表3)，由此可知，時(shí)間、溫度、硫酸濃度的一次項(xiàng)，溫度的二次項(xiàng)和硫酸濃度的二次項(xiàng)對(duì)平均聚合度的影響極顯著。依據(jù)一次項(xiàng)回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小可知，因素的主效應(yīng)關(guān)系為:溫度＞時(shí)間＞硫酸濃度。

根據(jù)模型的回歸方程，固定一個(gè)因素在編碼值0的水平，分析另外兩個(gè)因素對(duì)平均聚合度的影響，Design Expert軟件生成3個(gè)三維響應(yīng)面(圖8～圖10)。從圖8可以看出，硫酸濃度在7.5%時(shí)，溫度和時(shí)間對(duì)總糖含量的影響。從圖9可以看出，溫度在60℃時(shí)，時(shí)間和硫酸濃度對(duì)總糖含量的影響。從圖10可以看出，時(shí)間在240min時(shí)，溫度和硫酸濃度對(duì)總糖含量的影響。

圖8 溫度和時(shí)間對(duì)平均聚合度影響的響應(yīng)面

圖9 硫酸濃度和時(shí)間對(duì)平均聚合度影響的響應(yīng)面

圖10 硫酸濃度和溫度對(duì)平均聚合度影響的響應(yīng)面

2.3.2 優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)的目的在于保證快速、穩(wěn)定地降解到適當(dāng)?shù)钠骄酆隙鹊耐瑫r(shí)獲得最高的總糖含量，以獲得高的產(chǎn)率與活性，因此優(yōu)化方法選擇固定平均聚合度在 3000，同時(shí)取總糖含量最大。用Design Expert軟件進(jìn)行優(yōu)化，時(shí)間、溫度和硫酸濃度都選擇在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi);總糖含量的目標(biāo)選擇最大，重要性選擇+++++，最低值選擇29.6227mg/mL，最高值選擇34.2475mg/mL，權(quán)重選擇1;平均聚合度的目標(biāo)選擇3000，權(quán)重選擇1。

優(yōu)化的結(jié)果為:時(shí)間171min，溫度64℃，硫酸濃度7.3%。在這個(gè)條件下獲得的總糖含量為33.362mg/mL，同時(shí)平均聚合度為3000。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(如表4)得到的總糖含量為32.192mg/mL，平均聚合度為2906，接近且都略低于Design Expert軟件分析得到的預(yù)測(cè)值。由此證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ胶侠?，?shí)驗(yàn)結(jié)果理想。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)利用 Design Expert軟件，采用 Central Composite Design建立總糖含量回歸模型:Y1=33.34 -0.18x1-0.46x2-0.22x3-0.17x1x2+0.24x1x3+ 0.035x2x3-0.077-0.15-1.55以及平均聚合度回歸模型:Y2=3106.99-407.18x1-1797.52x2-406.01x3+140.26x1x2+73.90x1x3+204.91x2x3+74.45+ 372.51-266.67，兩個(gè)方程擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。

3.2 利用模型的響應(yīng)面及其等高線對(duì)影響總糖含量和平均聚合度的關(guān)鍵因子及其相互作用進(jìn)行探討，優(yōu)化出了在目標(biāo)平均聚合度下獲得最高總糖含量的條件為:時(shí)間171min，溫度64℃，硫酸濃度7.3%，所得到的總糖含量為 32.192mg/mL，平均聚合度為2906。

3.3 本實(shí)驗(yàn)將化學(xué)法測(cè)定平均聚合度與高效液相色譜法相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)該方法可以簡(jiǎn)便、快捷、穩(wěn)定地評(píng)價(jià)降解程度。

3.4 本實(shí)驗(yàn)在研究如何利用南瓜果肉資源，增加南瓜附加值的基礎(chǔ)上，探索了利用酸降解南瓜多糖制備低聚糖的方法及可能遇到的問(wèn)題，為后續(xù)研究應(yīng)用其他途徑降解南瓜多糖奠定了基礎(chǔ)。

［1］趙一鵬，李新崢，周俊國(guó).世界南瓜生產(chǎn)現(xiàn)狀及其種群多樣性特征［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(3):113.

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Optimization of pumpkin polysaccharide hydrolysis process

DU Bing-jian，LI Quan-hong*
(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University Engineering Research Centre for Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Education Key Laboratory of Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

Pumpkin is rich in resources.In this study，for the use of the pumpkin polysaccharides one of the main component of pumpkin，response surface methodology was applied to study the effect of time(x1)，temperature (x2)and acid concentration(x3)on the acidic hydrolysis of pumpkin polysaccharide oligosaccharide process on the preparation.A time of 171min，temperature of 64℃;sulfuric acid concentration of 7.3%were thought to be optimal.These conditions resulted in a total sugar concentration of 33.362mg/mL，while the average degree of polymerization of 3000，as a result to the protection of polysaccharide content of pumpkin polysaccharide while achieving the purpose of controllable degradation.These results help in the deep processing and utilization of pumpkin，and increasing the added value by a new way.

pumpkin;polysaccharide;acidic hydrolysis;response surface

TS255.1

B

1002-0306(2011)03-0232-05

南瓜屬于葫蘆科南瓜屬，發(fā)源于北美洲，在世界各地都有種植，亞洲種植面積最多［1］。我國(guó)每年利用南瓜籽數(shù)千噸，但對(duì)南瓜果肉資源利用十分有限。南瓜籽與果肉部分(扣除皮、瓤)質(zhì)量比為1∶30～1∶45，果肉部分作為粉劑或者廉價(jià)飼料利用不到30%，有近70%因得不到有效利用而被棄掉，造成了浪費(fèi)與污染［2］。南瓜的含水量接近90%，碳水化合物含量占干物質(zhì)2/3，其中以大分子的南瓜多糖為主，分子量從數(shù)萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)道爾頓不等，單糖組成包括半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖等。南瓜多糖聚合度高、分子空間體積大、生物利用度低，極大地限制了南瓜多糖在食品、醫(yī)藥和化工等產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用［3］。低聚糖具有多種生物活性，在日本、歐洲以及美國(guó)擁有巨大的市場(chǎng)［4-7］。通過(guò)可控的酸降解南瓜多糖，生產(chǎn)南瓜低聚糖，將有效推進(jìn)南瓜肉質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用，實(shí)現(xiàn)南瓜農(nóng)產(chǎn)品的深加工，增加其附加值。為了能高效的制備南瓜低聚糖，本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法研究了硫酸濃度、時(shí)間、溫度對(duì)總糖含量和平均聚合度的影響及交互作用，優(yōu)化了南瓜多糖酸水解的工藝。

2010-03-03 *通訊聯(lián)系人

杜秉健(1985-)，男，在讀碩士，主要從事天然產(chǎn)物提取與開(kāi)發(fā)的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30972047)。