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    膜分離工藝提高產(chǎn)品中高聚合度ε-聚賴氨酸含量

    2021-08-02 12:47:08趙星宇陳旭升張宏建張建華
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年14期
    關(guān)鍵詞:聚合度膜片膜分離

    趙星宇,陳旭升,張宏建,張建華*

    1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(江南大學,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

    ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由多個賴氨酸殘基通過α-COOH和ε-NH2連接而成的一種同型氨基酸聚合物[1],聚合度多為5~35,分子質(zhì)量一般在780~4 600 Da。ε-PL產(chǎn)品為淡黃色粉末,吸濕性強,極易溶于水,不溶于有機溶劑,熱穩(wěn)定性較好,水溶液可以在100 ℃加熱 30 min 或者在120 ℃條件下加熱20 min不降解[2]。由于其主鏈上存在許多游離氨基,在酸性到弱堿性環(huán)境中表現(xiàn)出多陽離子特性。它對多種微生物,包括大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、酵母、霉菌和噬菌體均有抑制作用[3-6]。ε-PL 作為一種綠色、安全生物食品防腐劑被廣泛使用[7-8]。

    研究表明,ε-PL的合成是在聚賴氨酸合成酶的催化作用下,以L-賴氨酸為前體,以非核糖體多肽合成方式聚合[9]。ε-PL的抑菌性能受其聚合度影響,日本學者SHIMA等[10]考察了ε-PL的抑菌性能,發(fā)現(xiàn)當ε-PL聚合度<9時,抑菌活性很低,ε-PL聚合度>25時,其抑菌性能最佳。在劉慶瑞等[11]的研究中,高聚合度ε-PL對革蘭氏陽性和陰性細菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)是發(fā)酵產(chǎn)生的ε-PL的1/2 ~1/4;聚合度<20的ε-PL的MIC 值是發(fā)酵產(chǎn)生的ε-PL 的2~4倍,ε-PL聚合度越高越有利于抑制細菌。KITO等[12]在Streptomycesalbulus細胞膜上發(fā)現(xiàn)了ε-PL降解酶(ε-poly-L-lysine-degrading enzyme,PLD)的存在,他們研究發(fā)現(xiàn)其最適pH值為7.0,在發(fā)酵過程中控制低pH可以避免ε-PL降解,從而積累高聚合度的ε-PL。NISHIKAWA等[13]在ε-PL合成過程中向培養(yǎng)基內(nèi)同時添加甘油和璜化ε-環(huán)糊精,使得ε-PL分子質(zhì)量由3.5~4.5 kDa減小到2.5 kDa,他們還提出了一種通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中多元醇濃度來控制ε-PL中賴氨酸殘基數(shù)量的方法?,F(xiàn)有的對于ε-PL聚合度控制的研究大多集中在菌株改造和發(fā)酵過程控制等環(huán)節(jié),通過下游分離工藝來控制商品ε-PL的聚合度卻尚未見報道。

    膜分離技術(shù)是以選擇性透過膜為介質(zhì),借助于外界能量或化學位差的推動,實現(xiàn)多組分混合物進行分離、分級、提純以及濃縮富集的技術(shù),其過程簡單,無相變,無二次污染且分離系數(shù)大[14-15]。本團隊前期篩選的鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的ε-PL聚合度主要分布在5~35,本研究旨在嘗試通過膜分離技術(shù),在下游分離提取環(huán)節(jié)部分分離去除低聚合度(<25)ε-PL,提高產(chǎn)品中高聚合度(25~35)ε-PL含量,以提高單位產(chǎn)品的抑菌性能。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    ε-PL,江蘇一鳴生物科技有限公司;乙腈(純度≥99%)、甲基橙、NaClO4·H2O等常規(guī)試劑,分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

    實驗用膜片,泰州星達膜科技有限公司,主要參數(shù)如表1所示。

    表1 膜片主要性能參數(shù)Table 1 Main parameters of membrane

    1.2 儀器與設(shè)備

    Synder小型超濾系統(tǒng),泰州星達膜科技有限公司;PHS3TC pH計,上海天達儀器有限公司;UV2100分光光度計,優(yōu)尼科儀器有限公司;AB204N分析天平,瑞士梅特勒公司;Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀,美國Agilent 公司。

    1.3 ε-PL的分析

    ε-PL濃度采用甲基橙比色法確定[16]。ε-PL聚合度通過離子對色譜[17-18]來測定。TSKgel ODS-80Ts色譜柱(4.6 mm×250 mm;Tosoh,Tokyo),流動相A:10 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaClO4·H2O, 10 mmol/L辛烷磺酸鈉,磷酸調(diào)pH值至2.6。流動相B:20 mmol/L NaH2PO4,200 mmol/L NaClO4·H2O,20 mmol/L辛烷磺酸鈉,磷酸調(diào)pH值至2.6,50%(體積分數(shù))乙腈。流動相梯度:50 ℃,85 min內(nèi),B從55%線性變化為90%,與A混合,0.4 mL/min。檢測波長:215 nm。該色譜條件下不同聚合度的ε-PL的校正因子相近,不同聚合度的ε-PL的含量由歸一化法來定量。

    1.4 膜的截留率與透過率

    膜的截留率如計算公式(1)所示:

    (1)

    式中:C0,原料液中的ε-PL質(zhì)量濃度,g/L;C1,截留液中ε-PL質(zhì)量濃度,g/L;V0、V1,料液、截留液的體積,L。

    膜的透過率計算如公式(2)所示:

    (2)

    式中:C2,透過液中ε-PL質(zhì)量濃度,g/L;V2,透過液的體積,L。

    1.5 膜通量的測定

    通過測定一定時間得到的透過液體積,根據(jù)公式(3)計算膜通量:

    (3)

    式中:V,透過液的體積,L;A,膜面積,m2;t,過濾的時間,h。

    1.6 透析過濾

    本研究使用的小型膜分離裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示。操作方式參考李芳良等[19]的間歇變?nèi)轁B濾。

    1.7 ε-PL的抑菌性能

    測定不同ε-PL產(chǎn)品的MIC,比較其抑菌性能[10]。細菌采用肉湯液體培養(yǎng)基,酵母菌采用YPD 液體培養(yǎng)基,霉菌采用PDA 液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)。向每個試管內(nèi)加入 1 mL稀釋后的ε-PL 溶液和1 mL培養(yǎng)基稀釋的菌液,使細菌菌液濃度約為 5×105CFU/mL,酵母菌、霉菌終濃度為0.5~2.5×103CFU/mL。其中,細菌第1~11管ε-PL質(zhì)量濃度分別為 1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20 μg/mL,酵母菌和霉菌第1~11管ε-PL質(zhì)量濃度分別為 1 200、1 100、1 000、900、800、700、600、500、400、200、100 μg/mL。細菌于37 ℃培養(yǎng)12 h,酵母菌、霉菌于37 ℃培養(yǎng)48 h后,肉眼觀察以完全抑制菌體生長的最低ε-PL濃度為最小抑菌濃度[11]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 膜片截留分子質(zhì)量的選擇

    ε-PL等電點約為9,在pH=9的溶液中,ε-PL接近電中性,選擇該pH條件對料液進行分離,可減少ε-PL帶電性在過膜過程中的干擾。選擇pH=9,質(zhì)量濃度為10 g/L的ε-PL水溶液作為待分離料液,在壓力為0.25 MPa的條件下進行膜片的預(yù)篩。由圖2-a 可知,在同樣的操作條件下,膜的截留分子質(zhì)量越大,其膜通量越大。膜MT(5 000 Da)對于ε-PL截留率較低,其他4種膜對ε-PL的截留率均達到80%以上。

    通過對不同型號膜的透過液進行聚合度分析(圖2-b),VT膜的綜合表現(xiàn)最好。VT膜透過液中低聚合度ε-PL含量最高,其低聚合度(<25)ε-PL含量為41.08%,聚合度在25~35的ε-PL含量為58.92%。VT膜標定的截留分子質(zhì)量為3 000 Da,而聚合度為25的ε-PL的分子質(zhì)量為3 348 Da,在后續(xù)的研究中,選擇VT膜進行研究。

    2.2 操作壓力對高低聚合度ε-PL分離效果的影響

    壓力會影響膜分離過程的體積通量,圖3-a可知體積通量隨著壓力的增加而增加。壓力基本上不會影響VT膜對高聚合度的ε-PL的透過率(圖3-b),但是壓力較小時,低聚合度ε-PL透過率相對較高,可見在分離過程中,低聚合度的ε-PL相對更容易通過膜。但由于循環(huán)液中低聚合度ε-PL的含量很低(17.73%),且高低聚合度的ε-PL分子質(zhì)量差異并不顯著,因此分離效果并不明顯。由于壓力較低時膜通量很低,選擇0.25 MPa(約0.25 MPa)作為后續(xù)實驗的操作壓力。

    2.3 pH對高低聚合度ε-PL分離效果的影響

    VT對不同pH溶液中的ε-PL存在不同的篩分效果。VT對ε-PL溶液的截留率隨著pH的增加減少,如圖4-a所示,而體積通量基本上穩(wěn)定。由圖4-b可知,隨著pH增加,透過液中的低聚合度ε-PL比例先增加后減少,在pH=6時,低聚合度ε-PL含量最高,為75.32%,在等電點附近,pH=9時,低聚合度ε-PL含量最低,為22.08%。

    由圖4-c可知,ε-PL的透過率隨著pH的增加而增加。在pH=3時,VT對低聚合度ε-PL透過率為2.89%。當料液pH=10時,對低聚合度ε-PL透過率為37.51%,高聚合度ε-PL透過率為21.67%。而在pH=6時,透過液中低聚合度ε-PL比例較高,在該pH下,低聚合度ε-PL透過速率與高聚合度ε-PL相比差值更大,更有利于高低聚合度ε-PL的分離。

    2.4 初始進料濃度對高低聚合度ε-PL分離效果的影響

    VT膜對ε-PL的篩分效果受料液濃度影響。體積通量會隨著料液濃度的增加而降低,越稀的溶液在VT上的透過速率越快,膜對ε-PL的截留率也隨料液濃度的增加而減小(圖5-a)。進料液質(zhì)量濃度為5 g/L的VT透過液中,低聚合度ε-PL的含量僅17.74%,VT膜基本上對溶液中高低聚合度的ε-PL沒有選擇性。而當進料液質(zhì)量濃度為20 g/L時,低聚合度ε-PL的含量為48.04%,之后隨著濃度的增加,透過液中低聚合度的ε-PL比例反而減少。由圖5-b可知,低聚合度ε-PL的透過率隨著濃度的增加而增大,當初始進料質(zhì)量濃度為30 g/L時,低聚合度ε-PL的透過率為25.25%。進料濃度會影響ε-PL的透過,隨著濃度增加,低聚合度ε-PL透過率得到提高,同時高聚合度ε-PL的透過率也會隨之增加,濃度增加到一定值時,膜對高低聚合度的ε-PL的選擇性降低。在本研究中,料液質(zhì)量濃度為20 g/L,透過液中低聚合度ε-PL的比例最高,綜合分離效果更好,選擇20 g/L作為后續(xù)研究中的初始料液濃度。

    2.5 透析前后產(chǎn)品聚合度變化

    ε-PL溶液經(jīng)VT透析后循環(huán)液和透過液色譜圖如圖6所示。循環(huán)液和透過液收集經(jīng)濃縮控制質(zhì)量濃度在10 g/L左右。經(jīng)過不斷加水循環(huán)透析,循環(huán)液中聚合度<25的ε-PL幾乎被去除,經(jīng)過歸一化處理,此時循環(huán)液中聚合度為25~35的ε-PL含量為91.22%。相對于原產(chǎn)品,25~35的ε-PL比例提高了8.38%。

    2.6 不同聚合度分布的ε-PL產(chǎn)品的抑菌活力

    通過VT透析后,我們比較了原產(chǎn)品與分離后產(chǎn)品的抑菌活力。由表2、表3可知,經(jīng)過透析之后,循環(huán)液中25~35聚合度的ε-PL比例增加,無論是對于大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌,其MIC值均低于原產(chǎn)品。而對于酵母和霉菌,透析后的產(chǎn)品與原來產(chǎn)品的抑菌活性無明顯差異??梢?,高聚合度的ε-PL更有利于抑制細菌。

    表2 VT透析前后聚合度比例Table 2 The ratio of polymerization degree before and after VT dialysis

    表3 不同ε-聚賴氨酸產(chǎn)品的最小抑菌濃度Table 3 The MIC of different ε-PL products

    2.7 高低聚合度 ε-PL透過VT膜的模型分析

    為了研究ε-PL透過膜VT的方式,我們分析了ε-PL的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果如表4所示。ε-PL主鏈是長的脂肪族烴鏈,幾乎不形成螺旋結(jié)構(gòu),主要為ε-折疊構(gòu)象[20]。ε-PL側(cè)鏈氨基的電離常數(shù)為8.0~9.0,當pH值低于電離常數(shù)時,氨基帶有強正電荷,這導(dǎo)致主鏈中的殘基相互排斥,無法形成氫鍵并自由膨脹,在pH<8~9的循環(huán)液和透過液中,ε-PL主要為β-折疊和無規(guī)卷曲構(gòu)型。

    表4 不同pH水溶液中ε-PL二級結(jié)構(gòu)Table 4 Structure of ε-PL in different pH aqueous solutions

    由圖7可知,與循環(huán)液相比,透過液中不同聚合度的ε-PL均有透過,而低聚合度ε-PL透過較多。VT由PES制成的表面活性層與支撐層2層組成,該膜的分離作用主要取決于表面活性層,活性層內(nèi)含有相互交聯(lián)的孔道。在pH<8~9的循環(huán)液和透過液中,不同分子質(zhì)量的ε-PL呈折疊線型分子結(jié)構(gòu)。當線型分子與膜面垂直時均能進入膜通道并透過,分子質(zhì)量>3 000 Da的ε-PL仍然可能通過膜內(nèi)的通道,分子質(zhì)量<3 000 Da的ε-PL也可能會因為在膜的表面“架橋”而被截留下來,如圖8所示。分子質(zhì)量越大,在膜表面“架橋”的幾率越大。在透析的過程中,分子質(zhì)量<3 000 Da的ε-PL更容易透過膜,導(dǎo)致了高低聚合度ε-PL透過速度的差異,通過不停地向循環(huán)液加水循環(huán),循環(huán)液中低聚合度ε-PL含量降低。但由于高低聚合度ε-PL分子質(zhì)量差異不大,且均能透過膜片,單純靠分子質(zhì)量的差異,并不能實現(xiàn)高低聚合度ε-PL的絕對分離。

    3 結(jié)論

    本研究嘗試在下游分離提取環(huán)節(jié)提高產(chǎn)品中高聚合度(25~35)ε-PL含量,篩選了截留分子質(zhì)量為3 000 Da的PES膜VT,確定了該膜片用來高低聚合度ε-PL的操作壓力、料液pH和初始料液濃度。在操作壓力0.25 MPa下,對pH=6,初始質(zhì)量濃度為20 g/L的料液進行了透析,透析之后的產(chǎn)品中聚合度在25~35的ε-PL含量達91.22%,較原產(chǎn)品提高了8.38%;比較透析前后產(chǎn)品的抑菌性能,透析之后產(chǎn)品更有利于細菌的抑制。最后,對于膜工藝分離ε-PL的分離過程進行了分析。膜分離工藝不能實現(xiàn)不同聚合度ε-PL的絕對分離,但可以提高產(chǎn)品中高聚合度ε-PL的比例,提高產(chǎn)品對細菌的抑菌性能,對于提高ε-PL應(yīng)用價值具有重要意義。

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