• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成L-苯乳酸

    2021-08-02 12:49:18邵宇張顯胡孟凱魏玉霞楊套偉徐美娟邵明龍高敏杰饒志明
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年14期
    關(guān)鍵詞:菌體底物葡萄糖

    邵宇,張顯,胡孟凱,魏玉霞,楊套偉,徐美娟,邵明龍,高敏杰,饒志明

    (工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)

    苯乳酸(phenyllactic acid,PLA),即2-羥基-3-苯基丙酸[1],是一種小分子天然有機(jī)酸,廣泛存在于干酪、天然蜂蜜中。溶解性良好,具有耐酸、耐堿、耐高溫等特性[2],并能有效的抑制食腐性微生物[3]的生長(zhǎng),在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。L-苯乳酸(L-PLA)作為PLA兩種對(duì)映異構(gòu)體中的一種,是合成許多藥物制劑的前體[4]。

    合成L-PLA方法主要為化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵和生物催化合成?;瘜W(xué)合成法[5]技術(shù)路線復(fù)雜,反應(yīng)條件苛刻,易產(chǎn)生環(huán)境污染,后續(xù)分離困難,不易純化。微生物發(fā)酵法[6]通過(guò)微生物分解與合成代謝生產(chǎn)PLA。由于其發(fā)酵周期長(zhǎng),培養(yǎng)基利用率不高,生產(chǎn)效率低,不具工業(yè)利用價(jià)值?;蚬こ毯偷鞍踪|(zhì)工程[7]的發(fā)展使得生物催化技術(shù)得到廣泛的運(yùn)用。XU等[8]通過(guò)在大腸桿菌中共表達(dá)源于干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的酮酸還原酶(LcKAR)和葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH),以苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)為底物不對(duì)稱合成PLA,時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到10.12 g/(L·h)。LUO等[9]研究中以PPA為底物目前產(chǎn)量達(dá)到20.5 g/L。近幾年以PPA為底物合成PLA的研究較多,關(guān)于苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)一步合成PLA的報(bào)道相對(duì)較少,且PPA價(jià)格偏高,挖掘能夠成本低廉并高效轉(zhuǎn)化的生物催化合成PLA方法是未來(lái)研究亟待解決的問(wèn)題。

    L-氨基酸脫氨酶(L-amino acid deaminase,L-AAD)可以用來(lái)催化Phe生成PPA,L-AAD有廣泛的底物特異性[10],對(duì)疏水性氨基酸有顯著催化特性,L-AAD是膜蛋白[11],更有利于制備全細(xì)胞催化劑。苯丙酮酸還原酶(phenylpyruvate reductase,LaPPR)是一種還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide health,NADH)依賴型的氧化還原酶,具有對(duì)芳香族和脂肪族酮酸的底物偏好[12]。本研究首次將L-AAD和LaPPR用于催化L-苯丙氨酸(L-Phe)合成L-PLA??紤]到還原性輔酶NADH穩(wěn)定性差,價(jià)格昂貴,提高成本,不適合外源添加[13],其中,GDH和甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase , FDH)是構(gòu)建輔酶再生體系最常用的酶[14],通過(guò)對(duì)輔酶再生酶的篩選,制備全細(xì)胞催化劑轉(zhuǎn)化合成PLA。旨在為L(zhǎng)-PLA生產(chǎn)建立一種簡(jiǎn)潔、高效、經(jīng)濟(jì)的生物催化合成方法,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒

    大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)及質(zhì)粒pET-28a均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

    1.1.2 酶和試劑

    Hind Ⅲ、NotⅠ、XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶與DNA聚合酶,TaKaRa公司;小量質(zhì)粒提取試劑盒、同源重組試劑盒和膠回收試劑盒,南京諾維贊生物科技有限公司;L-Phe、L-苯丙酮酸、L-PLA,國(guó)藥集團(tuán);酵母提取物和胰蛋白胨,英國(guó)Oxoid 公司。所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    LB種子培養(yǎng)基(g/L)[15]:蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH 7.0。

    TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[15]:蛋白胨 12,酵母粉 24,甘油5,KH2PO42.31, K2HPO412.54。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)

    通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得編碼普通變形桿菌Proteusvulgaris來(lái)源的L-AAD基因、乳酸桿菌Lactobacillussp. CGMCC 9967苯丙酮酸還原酶的基因序列,選擇酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成多對(duì)引物,序列如表1所示。

    表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

    1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

    根據(jù)NCBI中公布的普通變形桿菌P.vulgaris來(lái)源的L-AAD基因laad(GenBank登錄號(hào):AB030003.1)、乳酸桿菌Lactobacillussp.CGMCC 9967來(lái)源的LaPPR基因[16]lappr(GenBank登錄號(hào):KP735960.1)、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis來(lái)源的GDH基因[16]gdh(GenBank登錄號(hào):938261)以及博伊丁假絲酵母Candidaboidinii的FDH基因[16]fdh(GenBank登錄號(hào):7657866)序列設(shè)計(jì)引物,分別以各自基因組為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物laad、lappr、gdh和fdh經(jīng)過(guò)試劑盒純化后,連接載體pET-28a,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)中。

    將gdh基因克隆到重組表達(dá)載體pET-28a-lappr的MCS位點(diǎn)上,引入限制性酶切位點(diǎn)NcoⅠ,用各自的T7啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá),構(gòu)建pET-28a-t7-gdh-t7-ppr共表達(dá)質(zhì)粒。選擇限制性酶切位點(diǎn)XhoⅠ,將laad基因克隆到重組質(zhì)粒上,構(gòu)建pET-28a-t7-gdh-t7-lappr-t7-laad共表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)中,涂布平板,并過(guò)夜培養(yǎng),挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,送至測(cè)序,若正確,即重組菌株E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh構(gòu)建成功。

    1.2.3 重組菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

    重組菌E.coliBL21/pET28a-laad、E.coliBL21/pET28a-lappr、E.coliBL21/pET28a-gdh、E.coliBL21/pET28a-fdh、E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh,1%的接種量轉(zhuǎn)接入含Kan 50 μg/mL的種子培養(yǎng)基,37 ℃、180 r/min,培養(yǎng)12 h。再按2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,37 ℃,菌體OD600值為0.4~0.5時(shí),加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度為0.5 mmol/L,24 ℃、180 r/min誘導(dǎo)12 h[15]。

    1.2.4 酶活測(cè)定

    誘導(dǎo)后的大腸桿菌發(fā)酵液于4 ℃離心(8 000 r/min,5 min)收集菌體,用PB緩沖液(0.1 mol/L,pH為8.0)重懸菌體沉淀,低溫超聲破碎,并在4 ℃條件下高速離心后,獲得破碎上清液,即為粗酶液,進(jìn)行SDS-PAGE分析及酶活力測(cè)定[17]。酶活力測(cè)定分別參考HOU等[12]、XU等[8]的報(bào)道。

    1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)

    酶最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH測(cè)定:在25、30、35、40、45、50 ℃下測(cè)定酶活力,分析確定酶反應(yīng)的最適溫度,設(shè)置酶活力最高組為100%對(duì)照[15]。在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下測(cè)定酶活力,分析確定酶反應(yīng)的最適溫度,設(shè)置酶活力最高組為100%對(duì)照[18]。

    酶溫度和pH穩(wěn)定性測(cè)定:取適量純化的酶置于不同溫度(25~45 ℃)下,在最適pH條件下定時(shí)取樣測(cè)定殘余酶活力,以最高殘余酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。取適量純化的酶置于不同pH(4.0~10.0)條件下,在最適溫度條件下定時(shí)取樣測(cè)定殘余酶活力,以最高殘余酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。

    1.2.6L-PLA的合成及條件優(yōu)化

    利用重組菌E.coli/pET28a-laad-lappr-gdh進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化環(huán)合成L-PLA,以L-Phe作為底物,同時(shí)加入輔底物葡萄糖及5%(體積分?jǐn)?shù))的甘油,轉(zhuǎn)化體系為20 mL,轉(zhuǎn)速220 r/min進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)添加適量的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH。

    全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化:在不同的溫度(25~45 ℃)、初始pH(6.0~9.0)、菌體量OD600(10~50)、底物質(zhì)量濃度(20~50 g/L)、輔底物與底物摩爾質(zhì)量比(0.5∶1~4∶1)的條件下進(jìn)行L-PLA的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。HPLC法檢測(cè)產(chǎn)物L(fēng)-PLA的產(chǎn)量的具體方法參考黃國(guó)昌等[19]的檢測(cè)方法。

    2 結(jié)果與分析

    2.1laad,lappr,gdh及fdh基因的克隆與表達(dá)

    從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到L-AAD、LaPPR、GDH、FDH的序列,長(zhǎng)度分別為1 416、1 047、789、1 197 bp,分別作為模板,進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,電泳結(jié)果如圖1所示,可見(jiàn)特異性條帶位置與目標(biāo)基本一致。

    M-DL 10 000 marker;1、2-基因 gdh;3、4基因 lappr;5~7-基因laad圖1 基因的克隆Fig.1 The result of gene cloning

    2.2 溫度和pH對(duì)L-AAD及LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

    2.2.1 溫度對(duì)L-AAD和LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

    在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定L-AAD酶活力,如圖2-a,L-AAD的最適反應(yīng)溫度為35 ℃,存在較高酶活力,溫度高于40 ℃,酶活力下降。圖2-b中顯示,L-AAD在30~40 ℃較穩(wěn)定,酶活力保持在75%以上,而在45、50 ℃條件下,則迅速降到40%以下,可見(jiàn)在30~40 ℃有較好的穩(wěn)定性。

    在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定LaPPR酶活力,如圖2-c,LaPPR的最適反應(yīng)溫度為30 ℃,并具有較高酶活力,溫度高于35 ℃,酶活力下降。圖2-d中顯示,LaPPR在25~35 ℃比較穩(wěn)定,酶活力保持在80%以上,而在40~45 ℃條件下,相對(duì)酶活力迅速降到20%以下,這表明在25~35 ℃有較好的催化性能和熱穩(wěn)定性。

    2.2.2 pH對(duì)L-AAD和LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

    在不同pH條件下測(cè)定L-AAD酶活力,結(jié)果如圖3-a所示,隨著反應(yīng)體系pH的逐漸提高,L-AAD 的相對(duì)酶活力也逐漸提高,L-AAD的最適反應(yīng)pH值為8.0,在pH 7.0~9.0具有較高酶活力。圖3-b中顯示,當(dāng)處于偏酸性環(huán)境中時(shí),L-AAD穩(wěn)定性較差,相對(duì)酶活力降到50%以下;在pH 7.0~9.0偏中性范圍內(nèi)比較穩(wěn)定,酶活力保持在80%以上,有利于其在生物催化工業(yè)上的應(yīng)用。

    a-L-AAD的最適溫度;b-L-AAD溫度穩(wěn)定性;c-LaPPR的最適溫度;d-LaPPR溫度穩(wěn)定性圖2 溫度對(duì)L-AAD和LaPPR的影響Fig.2 The influence of temperature on L-AAD and LaPPR

    在不同反應(yīng)pH下測(cè)定LaPPR酶活力,結(jié)果如圖3-c所示,LaPPR的最適反應(yīng)pH為7.0,在pH 7.0~8.0具有較高酶活力,當(dāng)pH值低于7.0,酶活力迅速下降。圖3-d中顯示,在pH 7.0~8.0比較穩(wěn)定,酶活力保持在80%以上,而偏酸性條件下,相對(duì)酶活力迅速降到40%以下,這表明在pH 7.0~8.0有較好的穩(wěn)定性。本研究中使用的L-AAD和LaPPR具有良好的兼容性,為后續(xù)多酶級(jí)聯(lián)奠定基礎(chǔ)。

    2.3 輔酶自循環(huán)體系的篩選及優(yōu)化

    2.3.1 輔酶自循環(huán)體系的優(yōu)化

    LaPPR催化PPA過(guò)程中需要消耗NADH,而NADH穩(wěn)定性差,成本高[18],在工業(yè)生產(chǎn)中添加昂貴的輔因子會(huì)大大增加生產(chǎn)成本,不符合綠色經(jīng)濟(jì)。輔酶再生是解決其價(jià)格昂貴的有效方法,現(xiàn)主要有葡萄糖脫氫酶和甲酸脫氫酶再生系統(tǒng),通過(guò)分別催化葡萄糖和甲酸來(lái)再生NADH。

    首先對(duì)來(lái)源于Lactobacillussp.CGMCC 9967的LaPPR轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)GDH和FDH進(jìn)行篩選比較。20 mL的轉(zhuǎn)化體系中包含PPA 10 g/L、1.5倍摩爾量的輔底物,分別加入LaPPR和GDH,以及LaPPR和FDH的粗酶液,并以LaPPR和原始菌株粗酶液組作為對(duì)照,各粗酶液在轉(zhuǎn)化體系中的終濃度均為1 U/mL,轉(zhuǎn)化反應(yīng)于pH值為7.5, 220 r/min、30 ℃ 條件下進(jìn)行[16]。結(jié)果如表2所示,通過(guò)比較兩者酶活力以及計(jì)算其初始反應(yīng)速率,GDH初始反應(yīng)速率為16.16 mg/(L·min),F(xiàn)DH初始反應(yīng)速率為8.78 mg/(L·min),因此選擇GDH為下一步構(gòu)建重組菌作鋪墊。

    2.3.2 LaPPR和GDH的酶量配比優(yōu)化

    在多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)中,酶的添加比例能夠影響催化反應(yīng)速率的平衡[20]。LaPPR和GDH作為參與還原反應(yīng)中的重要酶,為了保證催化速率達(dá)到平衡,減少中間產(chǎn)物PPA積累,須對(duì)LaPPR和GDH的添加比例進(jìn)行優(yōu)化。

    20 mL的反應(yīng)體系中包含10 g/L的底物PPA,保持LaPPR終濃度為1 U/mL,GDH的添加量高于LaPPR,設(shè)定GDH與LaPPR不同添加比例,酶活力優(yōu)化范圍設(shè)定為1∶1~5∶1,按照不同添加比例催化底物,計(jì)算產(chǎn)物L(fēng)-PLA的生成速率[16]。如圖4所示,隨著GDH的逐步增加,初始反應(yīng)速率不斷增加,當(dāng)m(GDH)∶m(LaPPR)=4∶1時(shí),初始反應(yīng)速率達(dá)到最大值,為27.63 mg/(L·min)。

    圖4 LaPPR和GDH添加比例優(yōu)化Fig.4 Optimization of dosage of LaPPR and GDH

    2.4 共表達(dá)重組菌的構(gòu)建及優(yōu)化

    按照方法1.2.2構(gòu)建重組菌株E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh,超聲破碎并離心,取上清液進(jìn)行SDS-PAGE 分析,結(jié)果見(jiàn)圖5,在約52.05、37、29.8 kDa位置處有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶,大小一致,各基因成功在大腸桿菌中表達(dá)。

    M-蛋白質(zhì)marker;1- E.coil BL21/pET-28a crude enzyme;2~4-E.coil BL21/pET-28a-laad-lappr-gdh圖5 基因的表達(dá)及分析Fig.5 The result of gene expression and purification

    利用上述共表達(dá)重組菌進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,結(jié)果如圖6所示,當(dāng)提供足夠的Phe和葡萄糖時(shí),底物Phe可大量被消耗,此時(shí)中間產(chǎn)物PPA大量積累,質(zhì)量濃度達(dá)到27.89 g/L,而最終產(chǎn)物L(fēng)-PLA產(chǎn)生速率較為緩慢。中間產(chǎn)物積累濃度較高,影響整個(gè)反應(yīng)順利進(jìn)行??赡苁怯捎贚aPPR和GDH兩個(gè)關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化過(guò)程不平衡,從而影響PPA轉(zhuǎn)化至L-PLA的催化速率。經(jīng)酶活力測(cè)定,結(jié)果如表2所示,在重組菌中,LaPPR酶活力為12.89 U/mL,GDH為7.64 U/mL,GDH酶活力較低,從而影響反應(yīng)使其不能相互協(xié)調(diào),導(dǎo)致PPA不能被快速催化,造成中間產(chǎn)物的積累,影響L-PLA的生產(chǎn)。這一限速步驟對(duì)L-PLA產(chǎn)量的影響是亟需解決的問(wèn)題。

    圖6 重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLAFig.6 The recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh whole cells catalyze the synthesis of L-PLA

    2.5 限速步驟的解除

    為了協(xié)調(diào)具有一個(gè)載體的共表達(dá)菌株中LaPPR和GDH的表達(dá)水平,通過(guò)對(duì)LaPPR和GDH的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)節(jié)優(yōu)化,增加GDH的拷貝量,其酶活力情況如表2所示。通過(guò)調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)全細(xì)胞生物催化劑中酶的表達(dá),當(dāng)GDH為2個(gè)拷貝量時(shí),中間產(chǎn)物PPA的積累減少,減少了84.60%,L-PLA產(chǎn)量有較大的提高,產(chǎn)量增加了3倍多。

    表2 LaPPR、FDH及GDH在大腸桿菌中的酶活力 單位:U/mL

    2.6 重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的條件優(yōu)化

    2.6.1 溫度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    反應(yīng)體系的溫度會(huì)直接影響酶的催化活性和穩(wěn)定性[15],從而影響最終產(chǎn)物PLA的產(chǎn)量。例如L-AAD和LaPPR最適反應(yīng)溫度分別為37、30 ℃,為了能夠達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)化效果,需要對(duì)轉(zhuǎn)化的溫度進(jìn)行優(yōu)化??刂瞥跏挤磻?yīng)pH值為8.0,底物質(zhì)量濃度30 g/L,菌體量OD600為30,輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量,在不同溫度(25~45 ℃)下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

    如圖7-a所示,溫度為30 ℃時(shí),L-PLA產(chǎn)量達(dá)到最高,20.24 g/L,轉(zhuǎn)化率為67.49%,而當(dāng)溫度增加到45 ℃時(shí),L-PLA產(chǎn)量顯著下降,說(shuō)明此時(shí)某種酶活力受到影響,無(wú)法維持反應(yīng)的進(jìn)行。

    2.6.2 初始pH對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    在多酶催化反應(yīng)體系中,pH通過(guò)影響菌體狀態(tài)和酶促反應(yīng)的效率而影響L-PLA的合成,例如L-AAD和LaPPR最適反應(yīng)pH值分別為8.0和7.0,為了使反應(yīng)高效進(jìn)行,對(duì)轉(zhuǎn)化初始pH進(jìn)行了優(yōu)化。維持反應(yīng)溫度30 ℃,底物質(zhì)量濃度30 g/L,菌體量OD600為30,輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量,在初始反應(yīng)體系pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

    如圖7-b所示,隨著pH的升高,L-PLA產(chǎn)量增加,且8.0時(shí)達(dá)到最高21.02 g/L,轉(zhuǎn)化率為70.09%,偏堿性環(huán)境可以實(shí)現(xiàn)3種酶的良好催化。

    2.6.3 菌體量對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    實(shí)際應(yīng)用中為了滿足生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本,控制菌體濃度在適宜范圍內(nèi)也是至關(guān)重要的。控制初始反應(yīng)pH值為8.0,反應(yīng)溫度30 ℃,底物質(zhì)量濃度30 g/L,輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量,菌體OD600為10~50,進(jìn)行催化反應(yīng)。

    如圖7-c所示,轉(zhuǎn)化體系菌體OD600為30時(shí),L-PLA產(chǎn)量達(dá)到最高,為21.20 g/L,轉(zhuǎn)化率為70.66%。

    2.6.4 底物濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    為了提高L-PLA的產(chǎn)量,在前期優(yōu)化的最佳轉(zhuǎn)化條件下(溫度30 ℃,初始pH值為8.0,菌體量OD600,輔底物葡萄糖添加量為1倍摩爾當(dāng)量)合成L-PLA,底物Phe質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 g/L 進(jìn)行催化反應(yīng)。

    如圖7-d所示,底物質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí),產(chǎn)量達(dá)到最大值,為21.36 g/L,轉(zhuǎn)化率為71.22%,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為50 g/L時(shí),轉(zhuǎn)化率也能維持在40.29%左右??赡苡捎赑he溶解度低,反應(yīng)體系中還有其他物質(zhì),體系無(wú)法承載過(guò)多底物,從而產(chǎn)量有所下降[19]。

    2.6.5 輔底物與底物比例對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    葡萄糖在GDH作用下生成輔酶NADH,隨著NADH的增加,重組菌合成L-PLA產(chǎn)量越高,對(duì)反應(yīng)體系中葡萄糖的添加量進(jìn)行了優(yōu)化。控制反應(yīng)溫度30 ℃,初始反應(yīng)pH值為8.0,菌體量OD600為30,底物Phe質(zhì)量濃度30 g/L,添加0、0.5、1、1.5、2、2.5倍摩爾當(dāng)量的葡萄糖進(jìn)行全細(xì)胞催化。

    如圖7-e示,未添加葡萄糖時(shí),由于大腸桿菌本身含有一定的輔酶NADH,但不能支撐整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)行,可生成少量L-PLA。當(dāng)葡萄糖添加量為1、1.5、2、2.5倍摩爾當(dāng)量時(shí),L-PLA產(chǎn)量無(wú)明顯差異變化,表明輔底物添加量≥1倍摩爾量時(shí)即可滿足反應(yīng)需求,選擇葡萄糖添加量為1倍摩爾當(dāng)量最為合適。

    a-溫度;b-初始pH;c-菌體濃度;d-底物濃度;e-輔底物添加量圖7 轉(zhuǎn)化條件對(duì)重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響Fig.7 Effect of transformation conditions on the transformation and synthesis of L-PLA by recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh

    2.7 1 L放大全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-PLA

    為利用重組大腸桿菌E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-PLA,按照上述優(yōu)化后全細(xì)胞催化條件研究重組菌在大體系中的轉(zhuǎn)化水平。用1 L 0.1 mol/L 的PB緩沖液懸浮菌體,控制反應(yīng)溫度30 ℃,初始pH值為8.0,底物Phe 30 g/L,甘油2.5 mol/L,輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量,菌體OD600為30的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化,液相檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中各組分含量情況。

    如圖8所示,30 g/L底物質(zhì)量濃度下,共生成21.39 g/LL-PLA,轉(zhuǎn)化率為71.33%。反應(yīng)后期延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間,轉(zhuǎn)化率變化不明顯,可能是反應(yīng)趨于平衡。

    圖8 重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLAFig.8 The recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh whole cells catalyze the synthesis of L-PLA

    3 結(jié)論與討論

    本研究通過(guò)構(gòu)建高效便捷的多酶級(jí)聯(lián)催化體系,利用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化Phe合成L-PLA。首先分別對(duì)L-AAD和LaPPR分別進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,以此為基礎(chǔ)篩選比較構(gòu)建輔酶自循環(huán)體系,解決中間產(chǎn)物積累問(wèn)題,從而實(shí)現(xiàn)Phe到L-PLA的直接轉(zhuǎn)化,最終產(chǎn)量達(dá)到21.39 g/L,摩爾轉(zhuǎn)化率為71.33%。然而本研究所制備的產(chǎn)量仍有提升空間,導(dǎo)致產(chǎn)量無(wú)法進(jìn)一步提高的原因是由于Phe溶解度低,反應(yīng)體系無(wú)法承載過(guò)多底物,且有結(jié)晶存在,因此轉(zhuǎn)化率無(wú)法進(jìn)一步提高,增加了轉(zhuǎn)化體系的傳質(zhì)阻力[21],同時(shí)影響酶的催化特性。本研究提供了一種新型的L-PLA合成途徑,因PPA價(jià)格較高,由Phe為底物,大大減少了生產(chǎn)成本,縮短了工藝流程,采用全細(xì)胞催化合成L-PLA,操作工藝便捷,轉(zhuǎn)化效率高。對(duì)提供挖掘成本低廉并能高效轉(zhuǎn)化的生物催化合成L-PLA的方法具有借鑒作用,同時(shí)對(duì)其在食品及合成藥物行業(yè)生產(chǎn)具有廣泛的指導(dǎo)意義。

    猜你喜歡
    菌體底物葡萄糖
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    兩種品牌大腸菌群酶底物法檢測(cè)試劑性能的比較
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:30:56
    東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中菌體的分離與鑒定
    葡萄糖漫反射三級(jí)近紅外光譜研究
    解析參與植物脅迫應(yīng)答的蛋白激酶—底物網(wǎng)絡(luò)
    科學(xué)(2020年2期)2020-08-24 07:57:00
    糖耐量試驗(yàn)對(duì)葡萄糖用量的要求
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    黃芩苷對(duì)一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內(nèi)外抗菌作用的研究
    葡萄糖對(duì)Lactobacillus casei KDL22發(fā)酵及貯藏性能的影響
    多發(fā)性肺硬化性血管瘤18~F-脫氧葡萄糖PET/CT顯像1例
    久久久久久久久久久免费av| 91狼人影院| 少妇高潮的动态图| 人人妻人人澡欧美一区二区| 床上黄色一级片| 岛国在线免费视频观看| 久久久国产成人精品二区| 午夜视频国产福利| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品一区二区三区四区久久| 日韩av在线大香蕉| 欧美3d第一页| 国产精品不卡视频一区二区| 午夜福利在线在线| 日本免费a在线| 国产美女午夜福利| 午夜视频国产福利| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲欧洲日产国产| 青春草国产在线视频| av专区在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品乱久久久久久| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜视频国产福利| 国产三级在线视频| 亚洲av熟女| 久久草成人影院| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 乱人视频在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费观看a级毛片全部| 免费大片18禁| 亚洲精品456在线播放app| 国产伦理片在线播放av一区| 91aial.com中文字幕在线观看| 综合色av麻豆| 久久精品国产亚洲网站| a级一级毛片免费在线观看| 1000部很黄的大片| 日韩强制内射视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 我要搜黄色片| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品1区2区在线观看.| 热99在线观看视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99热6这里只有精品| 国产在线男女| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av不卡在线观看| 搞女人的毛片| 午夜a级毛片| 免费搜索国产男女视频| 观看免费一级毛片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成年免费大片在线观看| 中文资源天堂在线| 少妇丰满av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 桃色一区二区三区在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久亚洲精品不卡| 亚洲欧美日韩高清专用| 波多野结衣巨乳人妻| 男女啪啪激烈高潮av片| 舔av片在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 只有这里有精品99| 精品一区二区三区视频在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲国产欧美人成| 欧美成人免费av一区二区三区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 男插女下体视频免费在线播放| 国产色爽女视频免费观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产视频首页在线观看| 美女高潮的动态| 搞女人的毛片| 国产精品久久久久久精品电影| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产在视频线在精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 最新中文字幕久久久久| 一本久久精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品久久久久久久久亚洲| 99国产精品一区二区蜜桃av| av黄色大香蕉| 又粗又爽又猛毛片免费看| 我要看日韩黄色一级片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 最近中文字幕2019免费版| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产成人aa在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产av一区在线观看免费| 亚洲电影在线观看av| 国产一区二区在线av高清观看| 99热6这里只有精品| 搞女人的毛片| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 人妻系列 视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 美女大奶头视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产成人精品久久久久久| 久久久久久国产a免费观看| 99热6这里只有精品| 一个人看视频在线观看www免费| 黄片wwwwww| 一区二区三区免费毛片| 99热精品在线国产| 国产精品国产三级专区第一集| 精品免费久久久久久久清纯| 十八禁国产超污无遮挡网站| av在线观看视频网站免费| 成人午夜高清在线视频| 国产 一区 欧美 日韩| 1000部很黄的大片| 欧美激情在线99| 国产 一区 欧美 日韩| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 舔av片在线| 中文字幕免费在线视频6| 欧美区成人在线视频| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品国产三级国产专区5o | 国产精华一区二区三区| 欧美+日韩+精品| av国产免费在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产一区二区三区av在线| 毛片一级片免费看久久久久| 99久久精品一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 91精品伊人久久大香线蕉| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产三级在线视频| 精品欧美国产一区二区三| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 国产乱来视频区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 床上黄色一级片| 又爽又黄无遮挡网站| .国产精品久久| 变态另类丝袜制服| 如何舔出高潮| 亚洲欧美精品自产自拍| av视频在线观看入口| 观看免费一级毛片| av国产免费在线观看| 午夜免费激情av| 秋霞伦理黄片| 亚洲第一区二区三区不卡| 神马国产精品三级电影在线观看| 99热网站在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 中文字幕亚洲精品专区| 尾随美女入室| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 舔av片在线| 水蜜桃什么品种好| 中文在线观看免费www的网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 舔av片在线| 精品一区二区三区视频在线| 高清在线视频一区二区三区 | 成人三级黄色视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 在线免费观看不下载黄p国产| 大香蕉久久网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 一级黄片播放器| 亚洲色图av天堂| 97在线视频观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av天堂中文字幕网| 日本wwww免费看| 男插女下体视频免费在线播放| 免费人成在线观看视频色| 免费看a级黄色片| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲国产精品成人综合色| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | av国产免费在线观看| 免费搜索国产男女视频| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲色图av天堂| eeuss影院久久| 免费观看人在逋| 水蜜桃什么品种好| 免费看日本二区| 九九爱精品视频在线观看| 女人久久www免费人成看片 | 欧美丝袜亚洲另类| 97超碰精品成人国产| 日韩人妻高清精品专区| 欧美精品国产亚洲| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品野战在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩av在线大香蕉| 一级二级三级毛片免费看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 特级一级黄色大片| 久久久久久伊人网av| 久久99热这里只频精品6学生 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲欧美日韩东京热| 只有这里有精品99| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品一区二区三区视频在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美精品国产亚洲| 精品一区二区三区视频在线| videos熟女内射| 男的添女的下面高潮视频| 欧美激情在线99| 免费人成在线观看视频色| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产av不卡久久| 99热这里只有精品一区| 国产精品国产三级专区第一集| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美一区二区亚洲| 国产免费又黄又爽又色| 少妇丰满av| 人妻系列 视频| 亚洲av日韩在线播放| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久久欧美国产精品| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品蜜桃在线观看| 男人舔奶头视频| 男人和女人高潮做爰伦理| www.av在线官网国产| 激情 狠狠 欧美| 亚洲在线观看片| 久久这里只有精品中国| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲真实伦在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲经典国产精华液单| 免费搜索国产男女视频| 国产精品国产高清国产av| 中文字幕熟女人妻在线| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av免费在线观看| 成年av动漫网址| 免费看a级黄色片| av女优亚洲男人天堂| .国产精品久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 午夜视频国产福利| 长腿黑丝高跟| 亚洲在线自拍视频| 热99在线观看视频| 中文字幕亚洲精品专区| 黄片wwwwww| 久久精品久久久久久久性| 成人毛片60女人毛片免费| 丰满少妇做爰视频| 一个人看的www免费观看视频| 成年女人永久免费观看视频| 国产av一区在线观看免费| www日本黄色视频网| 桃色一区二区三区在线观看| 免费看a级黄色片| 国产成人aa在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 午夜福利在线观看吧| 亚洲国产精品合色在线| 欧美激情在线99| 伦精品一区二区三区| or卡值多少钱| 97超碰精品成人国产| 有码 亚洲区| 精品久久久噜噜| 国产精品一及| 久久人妻av系列| www.色视频.com| 国产精品蜜桃在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一级黄片播放器| 精品人妻偷拍中文字幕| 最近的中文字幕免费完整| 国产高潮美女av| 亚洲av免费高清在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲国产欧美在线一区| 国产淫语在线视频| 久久精品综合一区二区三区| 久久这里有精品视频免费| 亚洲av成人av| 联通29元200g的流量卡| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av男天堂| 观看免费一级毛片| 国产高清视频在线观看网站| 国产淫语在线视频| 国国产精品蜜臀av免费| 麻豆一二三区av精品| 色哟哟·www| 中文字幕久久专区| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品人妻久久久久久| 丰满乱子伦码专区| 亚洲成av人片在线播放无| 97在线视频观看| 99久久精品一区二区三区| 床上黄色一级片| 免费人成在线观看视频色| 一级黄色大片毛片| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品国产高清国产av| av视频在线观看入口| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美zozozo另类| 精品酒店卫生间| 一区二区三区四区激情视频| 看十八女毛片水多多多| av国产久精品久网站免费入址| 老司机影院毛片| 日韩欧美精品免费久久| av.在线天堂| 国产精华一区二区三区| 边亲边吃奶的免费视频| 51国产日韩欧美| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 日本与韩国留学比较| 桃色一区二区三区在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 99久久人妻综合| www日本黄色视频网| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 最新中文字幕久久久久| videos熟女内射| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 欧美97在线视频| 少妇的逼好多水| 看片在线看免费视频| 亚洲精品国产成人久久av| kizo精华| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品野战在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 乱系列少妇在线播放| 在线观看66精品国产| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 黄片wwwwww| 一级黄片播放器| 免费观看在线日韩| 免费观看性生交大片5| 午夜视频国产福利| 国产精品,欧美在线| 亚洲精品456在线播放app| 午夜福利高清视频| 丝袜美腿在线中文| 日韩在线高清观看一区二区三区| 美女黄网站色视频| 中文字幕制服av| 午夜福利在线在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜视频国产福利| 日韩三级伦理在线观看| 精品久久久久久成人av| 国产一区二区三区av在线| 午夜激情欧美在线| 永久免费av网站大全| 能在线免费看毛片的网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 又爽又黄无遮挡网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 人妻少妇偷人精品九色| 男的添女的下面高潮视频| 国产人妻一区二区三区在| 国产免费一级a男人的天堂| 在现免费观看毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 插逼视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| 欧美最新免费一区二区三区| 嫩草影院入口| 亚洲av二区三区四区| 国产精品久久视频播放| 免费av不卡在线播放| av视频在线观看入口| 国产精品乱码一区二三区的特点| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品日韩av在线免费观看| 成年av动漫网址| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲国产精品国产精品| 麻豆国产97在线/欧美| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产午夜精品论理片| 丝袜美腿在线中文| 寂寞人妻少妇视频99o| 午夜激情福利司机影院| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲久久久久久中文字幕| 七月丁香在线播放| a级一级毛片免费在线观看| 综合色丁香网| 国产av码专区亚洲av| 乱系列少妇在线播放| 欧美日韩在线观看h| 国产精品久久电影中文字幕| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲欧美成人精品一区二区| av卡一久久| 大话2 男鬼变身卡| 一级毛片我不卡| 亚洲电影在线观看av| 午夜爱爱视频在线播放| 国产爱豆传媒在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 村上凉子中文字幕在线| 99久久人妻综合| 亚洲av成人av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一本久久精品| 国产极品天堂在线| 九九爱精品视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 尾随美女入室| 丰满少妇做爰视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲av免费在线观看| 免费av观看视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 身体一侧抽搐| 婷婷色av中文字幕| 日韩欧美三级三区| av在线亚洲专区| 欧美成人一区二区免费高清观看| ponron亚洲| 又爽又黄无遮挡网站| 高清日韩中文字幕在线| 在线播放无遮挡| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲18禁久久av| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 中文字幕av成人在线电影| 中文字幕亚洲精品专区| 天堂√8在线中文| 国产伦一二天堂av在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 亚洲国产精品国产精品| 男女国产视频网站| 亚洲经典国产精华液单| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲欧洲国产日韩| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本黄大片高清| 欧美3d第一页| 国产成年人精品一区二区| 尾随美女入室| 男插女下体视频免费在线播放| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产av一区在线观看免费| 九九热线精品视视频播放| 女人久久www免费人成看片 | 色噜噜av男人的天堂激情| 免费观看精品视频网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品久久久久久久电影| 国产69精品久久久久777片| 美女黄网站色视频| 亚洲,欧美,日韩| 午夜免费激情av| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲人成网站高清观看| 天美传媒精品一区二区| 免费观看在线日韩| 国产69精品久久久久777片| 亚洲综合色惰| 国产午夜精品论理片| 禁无遮挡网站| 精品人妻视频免费看| 99热这里只有是精品50| 免费观看人在逋| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产乱人偷精品视频| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲中文字幕日韩| 国产单亲对白刺激| 国产av不卡久久| 女人久久www免费人成看片 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av在线蜜桃| 亚洲国产成人一精品久久久| 成年女人永久免费观看视频| 免费av不卡在线播放| 国产精品国产三级国产专区5o | 亚洲丝袜综合中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 99久久成人亚洲精品观看| 中国国产av一级| 精品熟女少妇av免费看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品1区2区在线观看.| 人妻系列 视频| 亚洲自偷自拍三级| 看免费成人av毛片| 简卡轻食公司| 免费av毛片视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久99精品国语久久久| 国产色婷婷99| 久久99热这里只频精品6学生 | 国产黄色小视频在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 99热这里只有是精品50| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜福利在线在线| 亚洲在线自拍视频| 免费搜索国产男女视频| 亚洲精品,欧美精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产高清有码在线观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲图色成人| 综合色丁香网| 久久热精品热| 高清在线视频一区二区三区 | 麻豆一二三区av精品| 插阴视频在线观看视频| 日韩中字成人| 联通29元200g的流量卡| 成人无遮挡网站| av在线观看视频网站免费| 欧美97在线视频| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一级毛片aaaaaa免费看小| videossex国产| 亚洲欧美精品专区久久| 国产成人a区在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲av成人精品一区久久| 一夜夜www| 神马国产精品三级电影在线观看| 精品久久久噜噜|