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    重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成L-苯乳酸

    2021-08-02 12:49:18邵宇張顯胡孟凱魏玉霞楊套偉徐美娟邵明龍高敏杰饒志明
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年14期
    關(guān)鍵詞:菌體底物葡萄糖

    邵宇,張顯,胡孟凱,魏玉霞,楊套偉,徐美娟,邵明龍,高敏杰,饒志明

    (工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)

    苯乳酸(phenyllactic acid,PLA),即2-羥基-3-苯基丙酸[1],是一種小分子天然有機(jī)酸,廣泛存在于干酪、天然蜂蜜中。溶解性良好,具有耐酸、耐堿、耐高溫等特性[2],并能有效的抑制食腐性微生物[3]的生長(zhǎng),在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。L-苯乳酸(L-PLA)作為PLA兩種對(duì)映異構(gòu)體中的一種,是合成許多藥物制劑的前體[4]。

    合成L-PLA方法主要為化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵和生物催化合成?;瘜W(xué)合成法[5]技術(shù)路線復(fù)雜,反應(yīng)條件苛刻,易產(chǎn)生環(huán)境污染,后續(xù)分離困難,不易純化。微生物發(fā)酵法[6]通過(guò)微生物分解與合成代謝生產(chǎn)PLA。由于其發(fā)酵周期長(zhǎng),培養(yǎng)基利用率不高,生產(chǎn)效率低,不具工業(yè)利用價(jià)值?;蚬こ毯偷鞍踪|(zhì)工程[7]的發(fā)展使得生物催化技術(shù)得到廣泛的運(yùn)用。XU等[8]通過(guò)在大腸桿菌中共表達(dá)源于干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的酮酸還原酶(LcKAR)和葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH),以苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)為底物不對(duì)稱合成PLA,時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到10.12 g/(L·h)。LUO等[9]研究中以PPA為底物目前產(chǎn)量達(dá)到20.5 g/L。近幾年以PPA為底物合成PLA的研究較多,關(guān)于苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)一步合成PLA的報(bào)道相對(duì)較少,且PPA價(jià)格偏高,挖掘能夠成本低廉并高效轉(zhuǎn)化的生物催化合成PLA方法是未來(lái)研究亟待解決的問(wèn)題。

    L-氨基酸脫氨酶(L-amino acid deaminase,L-AAD)可以用來(lái)催化Phe生成PPA,L-AAD有廣泛的底物特異性[10],對(duì)疏水性氨基酸有顯著催化特性,L-AAD是膜蛋白[11],更有利于制備全細(xì)胞催化劑。苯丙酮酸還原酶(phenylpyruvate reductase,LaPPR)是一種還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide health,NADH)依賴型的氧化還原酶,具有對(duì)芳香族和脂肪族酮酸的底物偏好[12]。本研究首次將L-AAD和LaPPR用于催化L-苯丙氨酸(L-Phe)合成L-PLA??紤]到還原性輔酶NADH穩(wěn)定性差,價(jià)格昂貴,提高成本,不適合外源添加[13],其中,GDH和甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase , FDH)是構(gòu)建輔酶再生體系最常用的酶[14],通過(guò)對(duì)輔酶再生酶的篩選,制備全細(xì)胞催化劑轉(zhuǎn)化合成PLA。旨在為L(zhǎng)-PLA生產(chǎn)建立一種簡(jiǎn)潔、高效、經(jīng)濟(jì)的生物催化合成方法,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒

    大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)及質(zhì)粒pET-28a均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

    1.1.2 酶和試劑

    Hind Ⅲ、NotⅠ、XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶與DNA聚合酶,TaKaRa公司;小量質(zhì)粒提取試劑盒、同源重組試劑盒和膠回收試劑盒,南京諾維贊生物科技有限公司;L-Phe、L-苯丙酮酸、L-PLA,國(guó)藥集團(tuán);酵母提取物和胰蛋白胨,英國(guó)Oxoid 公司。所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    LB種子培養(yǎng)基(g/L)[15]:蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH 7.0。

    TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[15]:蛋白胨 12,酵母粉 24,甘油5,KH2PO42.31, K2HPO412.54。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)

    通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得編碼普通變形桿菌Proteusvulgaris來(lái)源的L-AAD基因、乳酸桿菌Lactobacillussp. CGMCC 9967苯丙酮酸還原酶的基因序列,選擇酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成多對(duì)引物,序列如表1所示。

    表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

    1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

    根據(jù)NCBI中公布的普通變形桿菌P.vulgaris來(lái)源的L-AAD基因laad(GenBank登錄號(hào):AB030003.1)、乳酸桿菌Lactobacillussp.CGMCC 9967來(lái)源的LaPPR基因[16]lappr(GenBank登錄號(hào):KP735960.1)、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis來(lái)源的GDH基因[16]gdh(GenBank登錄號(hào):938261)以及博伊丁假絲酵母Candidaboidinii的FDH基因[16]fdh(GenBank登錄號(hào):7657866)序列設(shè)計(jì)引物,分別以各自基因組為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物laad、lappr、gdh和fdh經(jīng)過(guò)試劑盒純化后,連接載體pET-28a,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)中。

    將gdh基因克隆到重組表達(dá)載體pET-28a-lappr的MCS位點(diǎn)上,引入限制性酶切位點(diǎn)NcoⅠ,用各自的T7啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá),構(gòu)建pET-28a-t7-gdh-t7-ppr共表達(dá)質(zhì)粒。選擇限制性酶切位點(diǎn)XhoⅠ,將laad基因克隆到重組質(zhì)粒上,構(gòu)建pET-28a-t7-gdh-t7-lappr-t7-laad共表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)中,涂布平板,并過(guò)夜培養(yǎng),挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,送至測(cè)序,若正確,即重組菌株E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh構(gòu)建成功。

    1.2.3 重組菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

    重組菌E.coliBL21/pET28a-laad、E.coliBL21/pET28a-lappr、E.coliBL21/pET28a-gdh、E.coliBL21/pET28a-fdh、E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh,1%的接種量轉(zhuǎn)接入含Kan 50 μg/mL的種子培養(yǎng)基,37 ℃、180 r/min,培養(yǎng)12 h。再按2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,37 ℃,菌體OD600值為0.4~0.5時(shí),加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度為0.5 mmol/L,24 ℃、180 r/min誘導(dǎo)12 h[15]。

    1.2.4 酶活測(cè)定

    誘導(dǎo)后的大腸桿菌發(fā)酵液于4 ℃離心(8 000 r/min,5 min)收集菌體,用PB緩沖液(0.1 mol/L,pH為8.0)重懸菌體沉淀,低溫超聲破碎,并在4 ℃條件下高速離心后,獲得破碎上清液,即為粗酶液,進(jìn)行SDS-PAGE分析及酶活力測(cè)定[17]。酶活力測(cè)定分別參考HOU等[12]、XU等[8]的報(bào)道。

    1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)

    酶最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH測(cè)定:在25、30、35、40、45、50 ℃下測(cè)定酶活力,分析確定酶反應(yīng)的最適溫度,設(shè)置酶活力最高組為100%對(duì)照[15]。在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下測(cè)定酶活力,分析確定酶反應(yīng)的最適溫度,設(shè)置酶活力最高組為100%對(duì)照[18]。

    酶溫度和pH穩(wěn)定性測(cè)定:取適量純化的酶置于不同溫度(25~45 ℃)下,在最適pH條件下定時(shí)取樣測(cè)定殘余酶活力,以最高殘余酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。取適量純化的酶置于不同pH(4.0~10.0)條件下,在最適溫度條件下定時(shí)取樣測(cè)定殘余酶活力,以最高殘余酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。

    1.2.6L-PLA的合成及條件優(yōu)化

    利用重組菌E.coli/pET28a-laad-lappr-gdh進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化環(huán)合成L-PLA,以L-Phe作為底物,同時(shí)加入輔底物葡萄糖及5%(體積分?jǐn)?shù))的甘油,轉(zhuǎn)化體系為20 mL,轉(zhuǎn)速220 r/min進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)添加適量的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH。

    全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化:在不同的溫度(25~45 ℃)、初始pH(6.0~9.0)、菌體量OD600(10~50)、底物質(zhì)量濃度(20~50 g/L)、輔底物與底物摩爾質(zhì)量比(0.5∶1~4∶1)的條件下進(jìn)行L-PLA的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。HPLC法檢測(cè)產(chǎn)物L(fēng)-PLA的產(chǎn)量的具體方法參考黃國(guó)昌等[19]的檢測(cè)方法。

    2 結(jié)果與分析

    2.1laad,lappr,gdh及fdh基因的克隆與表達(dá)

    從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到L-AAD、LaPPR、GDH、FDH的序列,長(zhǎng)度分別為1 416、1 047、789、1 197 bp,分別作為模板,進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,電泳結(jié)果如圖1所示,可見(jiàn)特異性條帶位置與目標(biāo)基本一致。

    M-DL 10 000 marker;1、2-基因 gdh;3、4基因 lappr;5~7-基因laad圖1 基因的克隆Fig.1 The result of gene cloning

    2.2 溫度和pH對(duì)L-AAD及LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

    2.2.1 溫度對(duì)L-AAD和LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

    在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定L-AAD酶活力,如圖2-a,L-AAD的最適反應(yīng)溫度為35 ℃,存在較高酶活力,溫度高于40 ℃,酶活力下降。圖2-b中顯示,L-AAD在30~40 ℃較穩(wěn)定,酶活力保持在75%以上,而在45、50 ℃條件下,則迅速降到40%以下,可見(jiàn)在30~40 ℃有較好的穩(wěn)定性。

    在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定LaPPR酶活力,如圖2-c,LaPPR的最適反應(yīng)溫度為30 ℃,并具有較高酶活力,溫度高于35 ℃,酶活力下降。圖2-d中顯示,LaPPR在25~35 ℃比較穩(wěn)定,酶活力保持在80%以上,而在40~45 ℃條件下,相對(duì)酶活力迅速降到20%以下,這表明在25~35 ℃有較好的催化性能和熱穩(wěn)定性。

    2.2.2 pH對(duì)L-AAD和LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

    在不同pH條件下測(cè)定L-AAD酶活力,結(jié)果如圖3-a所示,隨著反應(yīng)體系pH的逐漸提高,L-AAD 的相對(duì)酶活力也逐漸提高,L-AAD的最適反應(yīng)pH值為8.0,在pH 7.0~9.0具有較高酶活力。圖3-b中顯示,當(dāng)處于偏酸性環(huán)境中時(shí),L-AAD穩(wěn)定性較差,相對(duì)酶活力降到50%以下;在pH 7.0~9.0偏中性范圍內(nèi)比較穩(wěn)定,酶活力保持在80%以上,有利于其在生物催化工業(yè)上的應(yīng)用。

    a-L-AAD的最適溫度;b-L-AAD溫度穩(wěn)定性;c-LaPPR的最適溫度;d-LaPPR溫度穩(wěn)定性圖2 溫度對(duì)L-AAD和LaPPR的影響Fig.2 The influence of temperature on L-AAD and LaPPR

    在不同反應(yīng)pH下測(cè)定LaPPR酶活力,結(jié)果如圖3-c所示,LaPPR的最適反應(yīng)pH為7.0,在pH 7.0~8.0具有較高酶活力,當(dāng)pH值低于7.0,酶活力迅速下降。圖3-d中顯示,在pH 7.0~8.0比較穩(wěn)定,酶活力保持在80%以上,而偏酸性條件下,相對(duì)酶活力迅速降到40%以下,這表明在pH 7.0~8.0有較好的穩(wěn)定性。本研究中使用的L-AAD和LaPPR具有良好的兼容性,為后續(xù)多酶級(jí)聯(lián)奠定基礎(chǔ)。

    2.3 輔酶自循環(huán)體系的篩選及優(yōu)化

    2.3.1 輔酶自循環(huán)體系的優(yōu)化

    LaPPR催化PPA過(guò)程中需要消耗NADH,而NADH穩(wěn)定性差,成本高[18],在工業(yè)生產(chǎn)中添加昂貴的輔因子會(huì)大大增加生產(chǎn)成本,不符合綠色經(jīng)濟(jì)。輔酶再生是解決其價(jià)格昂貴的有效方法,現(xiàn)主要有葡萄糖脫氫酶和甲酸脫氫酶再生系統(tǒng),通過(guò)分別催化葡萄糖和甲酸來(lái)再生NADH。

    首先對(duì)來(lái)源于Lactobacillussp.CGMCC 9967的LaPPR轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)GDH和FDH進(jìn)行篩選比較。20 mL的轉(zhuǎn)化體系中包含PPA 10 g/L、1.5倍摩爾量的輔底物,分別加入LaPPR和GDH,以及LaPPR和FDH的粗酶液,并以LaPPR和原始菌株粗酶液組作為對(duì)照,各粗酶液在轉(zhuǎn)化體系中的終濃度均為1 U/mL,轉(zhuǎn)化反應(yīng)于pH值為7.5, 220 r/min、30 ℃ 條件下進(jìn)行[16]。結(jié)果如表2所示,通過(guò)比較兩者酶活力以及計(jì)算其初始反應(yīng)速率,GDH初始反應(yīng)速率為16.16 mg/(L·min),F(xiàn)DH初始反應(yīng)速率為8.78 mg/(L·min),因此選擇GDH為下一步構(gòu)建重組菌作鋪墊。

    2.3.2 LaPPR和GDH的酶量配比優(yōu)化

    在多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)中,酶的添加比例能夠影響催化反應(yīng)速率的平衡[20]。LaPPR和GDH作為參與還原反應(yīng)中的重要酶,為了保證催化速率達(dá)到平衡,減少中間產(chǎn)物PPA積累,須對(duì)LaPPR和GDH的添加比例進(jìn)行優(yōu)化。

    20 mL的反應(yīng)體系中包含10 g/L的底物PPA,保持LaPPR終濃度為1 U/mL,GDH的添加量高于LaPPR,設(shè)定GDH與LaPPR不同添加比例,酶活力優(yōu)化范圍設(shè)定為1∶1~5∶1,按照不同添加比例催化底物,計(jì)算產(chǎn)物L(fēng)-PLA的生成速率[16]。如圖4所示,隨著GDH的逐步增加,初始反應(yīng)速率不斷增加,當(dāng)m(GDH)∶m(LaPPR)=4∶1時(shí),初始反應(yīng)速率達(dá)到最大值,為27.63 mg/(L·min)。

    圖4 LaPPR和GDH添加比例優(yōu)化Fig.4 Optimization of dosage of LaPPR and GDH

    2.4 共表達(dá)重組菌的構(gòu)建及優(yōu)化

    按照方法1.2.2構(gòu)建重組菌株E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh,超聲破碎并離心,取上清液進(jìn)行SDS-PAGE 分析,結(jié)果見(jiàn)圖5,在約52.05、37、29.8 kDa位置處有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶,大小一致,各基因成功在大腸桿菌中表達(dá)。

    M-蛋白質(zhì)marker;1- E.coil BL21/pET-28a crude enzyme;2~4-E.coil BL21/pET-28a-laad-lappr-gdh圖5 基因的表達(dá)及分析Fig.5 The result of gene expression and purification

    利用上述共表達(dá)重組菌進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,結(jié)果如圖6所示,當(dāng)提供足夠的Phe和葡萄糖時(shí),底物Phe可大量被消耗,此時(shí)中間產(chǎn)物PPA大量積累,質(zhì)量濃度達(dá)到27.89 g/L,而最終產(chǎn)物L(fēng)-PLA產(chǎn)生速率較為緩慢。中間產(chǎn)物積累濃度較高,影響整個(gè)反應(yīng)順利進(jìn)行??赡苁怯捎贚aPPR和GDH兩個(gè)關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化過(guò)程不平衡,從而影響PPA轉(zhuǎn)化至L-PLA的催化速率。經(jīng)酶活力測(cè)定,結(jié)果如表2所示,在重組菌中,LaPPR酶活力為12.89 U/mL,GDH為7.64 U/mL,GDH酶活力較低,從而影響反應(yīng)使其不能相互協(xié)調(diào),導(dǎo)致PPA不能被快速催化,造成中間產(chǎn)物的積累,影響L-PLA的生產(chǎn)。這一限速步驟對(duì)L-PLA產(chǎn)量的影響是亟需解決的問(wèn)題。

    圖6 重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLAFig.6 The recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh whole cells catalyze the synthesis of L-PLA

    2.5 限速步驟的解除

    為了協(xié)調(diào)具有一個(gè)載體的共表達(dá)菌株中LaPPR和GDH的表達(dá)水平,通過(guò)對(duì)LaPPR和GDH的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)節(jié)優(yōu)化,增加GDH的拷貝量,其酶活力情況如表2所示。通過(guò)調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)全細(xì)胞生物催化劑中酶的表達(dá),當(dāng)GDH為2個(gè)拷貝量時(shí),中間產(chǎn)物PPA的積累減少,減少了84.60%,L-PLA產(chǎn)量有較大的提高,產(chǎn)量增加了3倍多。

    表2 LaPPR、FDH及GDH在大腸桿菌中的酶活力 單位:U/mL

    2.6 重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的條件優(yōu)化

    2.6.1 溫度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    反應(yīng)體系的溫度會(huì)直接影響酶的催化活性和穩(wěn)定性[15],從而影響最終產(chǎn)物PLA的產(chǎn)量。例如L-AAD和LaPPR最適反應(yīng)溫度分別為37、30 ℃,為了能夠達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)化效果,需要對(duì)轉(zhuǎn)化的溫度進(jìn)行優(yōu)化??刂瞥跏挤磻?yīng)pH值為8.0,底物質(zhì)量濃度30 g/L,菌體量OD600為30,輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量,在不同溫度(25~45 ℃)下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

    如圖7-a所示,溫度為30 ℃時(shí),L-PLA產(chǎn)量達(dá)到最高,20.24 g/L,轉(zhuǎn)化率為67.49%,而當(dāng)溫度增加到45 ℃時(shí),L-PLA產(chǎn)量顯著下降,說(shuō)明此時(shí)某種酶活力受到影響,無(wú)法維持反應(yīng)的進(jìn)行。

    2.6.2 初始pH對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    在多酶催化反應(yīng)體系中,pH通過(guò)影響菌體狀態(tài)和酶促反應(yīng)的效率而影響L-PLA的合成,例如L-AAD和LaPPR最適反應(yīng)pH值分別為8.0和7.0,為了使反應(yīng)高效進(jìn)行,對(duì)轉(zhuǎn)化初始pH進(jìn)行了優(yōu)化。維持反應(yīng)溫度30 ℃,底物質(zhì)量濃度30 g/L,菌體量OD600為30,輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量,在初始反應(yīng)體系pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

    如圖7-b所示,隨著pH的升高,L-PLA產(chǎn)量增加,且8.0時(shí)達(dá)到最高21.02 g/L,轉(zhuǎn)化率為70.09%,偏堿性環(huán)境可以實(shí)現(xiàn)3種酶的良好催化。

    2.6.3 菌體量對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    實(shí)際應(yīng)用中為了滿足生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本,控制菌體濃度在適宜范圍內(nèi)也是至關(guān)重要的。控制初始反應(yīng)pH值為8.0,反應(yīng)溫度30 ℃,底物質(zhì)量濃度30 g/L,輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量,菌體OD600為10~50,進(jìn)行催化反應(yīng)。

    如圖7-c所示,轉(zhuǎn)化體系菌體OD600為30時(shí),L-PLA產(chǎn)量達(dá)到最高,為21.20 g/L,轉(zhuǎn)化率為70.66%。

    2.6.4 底物濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    為了提高L-PLA的產(chǎn)量,在前期優(yōu)化的最佳轉(zhuǎn)化條件下(溫度30 ℃,初始pH值為8.0,菌體量OD600,輔底物葡萄糖添加量為1倍摩爾當(dāng)量)合成L-PLA,底物Phe質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 g/L 進(jìn)行催化反應(yīng)。

    如圖7-d所示,底物質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí),產(chǎn)量達(dá)到最大值,為21.36 g/L,轉(zhuǎn)化率為71.22%,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為50 g/L時(shí),轉(zhuǎn)化率也能維持在40.29%左右??赡苡捎赑he溶解度低,反應(yīng)體系中還有其他物質(zhì),體系無(wú)法承載過(guò)多底物,從而產(chǎn)量有所下降[19]。

    2.6.5 輔底物與底物比例對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

    葡萄糖在GDH作用下生成輔酶NADH,隨著NADH的增加,重組菌合成L-PLA產(chǎn)量越高,對(duì)反應(yīng)體系中葡萄糖的添加量進(jìn)行了優(yōu)化。控制反應(yīng)溫度30 ℃,初始反應(yīng)pH值為8.0,菌體量OD600為30,底物Phe質(zhì)量濃度30 g/L,添加0、0.5、1、1.5、2、2.5倍摩爾當(dāng)量的葡萄糖進(jìn)行全細(xì)胞催化。

    如圖7-e示,未添加葡萄糖時(shí),由于大腸桿菌本身含有一定的輔酶NADH,但不能支撐整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)行,可生成少量L-PLA。當(dāng)葡萄糖添加量為1、1.5、2、2.5倍摩爾當(dāng)量時(shí),L-PLA產(chǎn)量無(wú)明顯差異變化,表明輔底物添加量≥1倍摩爾量時(shí)即可滿足反應(yīng)需求,選擇葡萄糖添加量為1倍摩爾當(dāng)量最為合適。

    a-溫度;b-初始pH;c-菌體濃度;d-底物濃度;e-輔底物添加量圖7 轉(zhuǎn)化條件對(duì)重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響Fig.7 Effect of transformation conditions on the transformation and synthesis of L-PLA by recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh

    2.7 1 L放大全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-PLA

    為利用重組大腸桿菌E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-PLA,按照上述優(yōu)化后全細(xì)胞催化條件研究重組菌在大體系中的轉(zhuǎn)化水平。用1 L 0.1 mol/L 的PB緩沖液懸浮菌體,控制反應(yīng)溫度30 ℃,初始pH值為8.0,底物Phe 30 g/L,甘油2.5 mol/L,輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量,菌體OD600為30的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化,液相檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中各組分含量情況。

    如圖8所示,30 g/L底物質(zhì)量濃度下,共生成21.39 g/LL-PLA,轉(zhuǎn)化率為71.33%。反應(yīng)后期延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間,轉(zhuǎn)化率變化不明顯,可能是反應(yīng)趨于平衡。

    圖8 重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLAFig.8 The recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh whole cells catalyze the synthesis of L-PLA

    3 結(jié)論與討論

    本研究通過(guò)構(gòu)建高效便捷的多酶級(jí)聯(lián)催化體系,利用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化Phe合成L-PLA。首先分別對(duì)L-AAD和LaPPR分別進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,以此為基礎(chǔ)篩選比較構(gòu)建輔酶自循環(huán)體系,解決中間產(chǎn)物積累問(wèn)題,從而實(shí)現(xiàn)Phe到L-PLA的直接轉(zhuǎn)化,最終產(chǎn)量達(dá)到21.39 g/L,摩爾轉(zhuǎn)化率為71.33%。然而本研究所制備的產(chǎn)量仍有提升空間,導(dǎo)致產(chǎn)量無(wú)法進(jìn)一步提高的原因是由于Phe溶解度低,反應(yīng)體系無(wú)法承載過(guò)多底物,且有結(jié)晶存在,因此轉(zhuǎn)化率無(wú)法進(jìn)一步提高,增加了轉(zhuǎn)化體系的傳質(zhì)阻力[21],同時(shí)影響酶的催化特性。本研究提供了一種新型的L-PLA合成途徑,因PPA價(jià)格較高,由Phe為底物,大大減少了生產(chǎn)成本,縮短了工藝流程,采用全細(xì)胞催化合成L-PLA,操作工藝便捷,轉(zhuǎn)化效率高。對(duì)提供挖掘成本低廉并能高效轉(zhuǎn)化的生物催化合成L-PLA的方法具有借鑒作用,同時(shí)對(duì)其在食品及合成藥物行業(yè)生產(chǎn)具有廣泛的指導(dǎo)意義。

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