麥冬多糖POJ-U1A的結(jié)構(gòu)研究及原子力顯微鏡觀測(cè)

王小梅，孫潤(rùn)廣，薛慧君，韓 濤

(陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院生物物理與生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062)

麥冬多糖POJ-U1A的結(jié)構(gòu)研究及原子力顯微鏡觀測(cè)

王小梅，孫潤(rùn)廣*，薛慧君，韓 濤

(陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院生物物理與生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062)

用功率超聲從麥冬中提取麥冬多糖POJ-U1，通過(guò)DEAE-52 cellulose色譜柱和Sephadex G-150凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化得到POJ-U1a，采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定其分子量，采用紅外光譜法、氣相色譜法對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，原子力顯微鏡觀察其微觀形貌。結(jié)果表明，麥冬多糖POJ-U1a的平均分子量為4.02×103D，是一種由均一葡萄糖組成的葡聚糖，具有糖類(lèi)物質(zhì)的特征吸收峰，同時(shí)存在呋喃環(huán)，是具有高度分枝的化學(xué)結(jié)構(gòu)的多糖。

麥冬多糖，結(jié)構(gòu)分析，原子力顯微鏡(AFM)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥冬 浙江產(chǎn);95%乙醇、苯酚、濃硫酸、氯化鈉均為分析純;DEAE-52 Whatman;Sephadex G-150 Pharmacia。

KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;CF16RX高速離心機(jī) 日本日立公司;系列層析柱2.5×60cm 上海琪特分析儀器有限公司;TB-215D電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度:1/105g;FD-1A真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司; Waters1525高效液相色譜儀，Waters2414示差折光檢測(cè)器，Trace-2000高效氣相色譜儀，日本島津SPM-9500J3原子力顯微鏡，Avatar360E.S.P.F TIR傅里葉變換紅外光譜儀(尼高力)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥冬多糖的提取 將麥冬塊根60℃烘干后粉碎，加入4倍體積的95%乙醇超聲脫脂三次，烘干，取80g脫脂后的塊根粉末，按料液比1∶10加蒸餾水，攪拌使其充分溶解，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)下提取，提取條件:超聲時(shí)間10s，間隙時(shí)間15s，超聲次數(shù)90次，超聲功率80W，提取兩次，兩次的提取液經(jīng)減壓濃縮，用四倍量95%乙醇醇析得粗多糖沉淀，離心，透析，真空冷凍干燥后得麥冬粗多糖POJ-U1。

1.2.2 麥冬多糖的分離純化［6-7］

1.2.2.1 DEAE-52 cellulose色譜柱層析 將麥冬多糖1.0g溶于12mL蒸餾水，12000r/min，4℃，離心20min，上DEAE-52 cellulose色譜柱，梯度洗脫法洗脫各級(jí)分，洗脫液分別為蒸餾水、0.05mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液，流速為6s一滴，20min一管，全自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，苯酚-硫酸法在487nm波長(zhǎng)下比色檢測(cè)糖含量。以試管數(shù)目為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作DEAE-52 cellulose色譜柱洗脫曲線圖。合并各主峰溶液，濃縮，流水透析，冷凍干燥，得POJ-U1a、POJ-U1b、POJ-U1c。

1.2.2.2 Sephadex G-150凝膠色譜柱層析 將之前收集的最多的組分進(jìn)行凝膠色譜分離。流速為4s一滴，10min收集一管，苯酚-硫酸法檢測(cè)。以試管數(shù)目為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作DEAE-52 cellulose色譜柱洗脫曲線圖。合并各主峰溶液，濃縮，蒸餾水透析，冷凍干燥，得POJ-U1a。

1.2.3 高效液相色譜法測(cè)定多糖分子量［8-9］色譜條件:色譜柱:Shodex Ohpak SB-804 HQ;流動(dòng)相:高純水;流速:0.8mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器;進(jìn)樣量:20μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:用系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖作為分子量標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相溶解制成2mg/mL溶液分別進(jìn)樣，記錄洗脫峰的保留時(shí)間，以標(biāo)準(zhǔn)分子量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)譜峰的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為:lgMw=-0.6638x+ 10.113(R2=0.9997)，其中:x為保留時(shí)間;Mw為平均分子量。

多糖分子量的測(cè)定:將多糖樣品溶于高純水制成2mg/mL溶液，在相同色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄保留時(shí)間，帶入回歸方程算得平均分子量。

1.2.4 傅里葉紅外光譜測(cè)定［10］稱(chēng)取 POJ-U1a 1mg，加入 100mg KBr充分研磨，壓片，在 4000～600cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)用紅外光譜儀進(jìn)行掃描。

1.2.5 氣相色譜分析［11］稱(chēng)取5mg POJ-U1a樣品，加入2mol/L的三氟乙酸3mL，110℃下水解6h，取出，加入少量甲醇，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓濃縮，重復(fù)三次，以除盡三氟乙酸，得水解產(chǎn)物。水解產(chǎn)物加入0.5mL無(wú)水吡啶，10mg鹽酸羥胺，2mg肌醇六乙酰酯(內(nèi)標(biāo))，于恒溫水浴鍋中90℃反應(yīng)30min，取出，冷卻至室溫。然后加入0.5mL無(wú)水乙酸酐90℃下繼續(xù)反應(yīng)30min進(jìn)行糖腈乙?；?，氣相色譜分析。

氣相色譜條件:OV-17毛細(xì)管柱;FID檢測(cè)器;升溫程序:150℃(7℃/min)→190℃(15℃/min)→250℃;進(jìn)樣口溫度280℃;檢測(cè)器溫度260℃;Air∶H2∶N2= 300∶30∶30，載氣流速10mL/min;進(jìn)樣量1μL。

1.2.6 原子力顯微鏡研究［12-14］將麥冬多糖 POJU1a配成濃度為2.5μg/mL的溶液，磁力攪拌器攪拌4h，用移液器取5μL滴在新剝離的云母表面，自然風(fēng)干，置于原子力顯微鏡下進(jìn)行掃描觀測(cè)。測(cè)試在室溫下進(jìn)行，濕度為50%～60%，探針為Si3N4，微懸臂長(zhǎng)200μm，微懸臂的彈性常數(shù)為0.28N/m。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥冬多糖POJ-U1a的紫外吸收光譜掃描及蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

麥冬多糖POJ-U1a的水溶液在190～400nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在191nm處有多糖特征吸收峰。在260～280nm范圍內(nèi)無(wú)吸收峰，表明麥冬多糖POJ-U1a中不含有蛋白質(zhì)和核酸。

2.2 DEAE-52 cellulose色譜柱層析結(jié)果

由圖1可以看出，實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的麥冬多糖共有三種組分，用蒸餾水、0.05mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl溶液洗脫均出現(xiàn)一個(gè)峰，依次命名為POJ-U1a、POJ-U1b和POJ-U1c，其中POJ-U1a多糖含量最高，因此將其峰位合并，冷凍干燥，為下一步純化備用。

圖1 麥冬多糖DEAE-52纖維素柱層析圖

2.3 Sephadex G-150凝膠色譜柱層析結(jié)果

由圖2可以看出，POJ-U1a經(jīng)Sephadex G-150凝膠色譜柱層析，流出曲線為單一對(duì)稱(chēng)峰，表明POJ-U1a為分子量分布均一的麥冬多糖組分。

2.4 麥冬多糖POJ-U1a的分子量測(cè)定

如圖3所示，麥冬多糖POJ-U1a經(jīng)高效液相色譜得到的峰形為單一對(duì)稱(chēng)峰，表明其為均一多糖，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出其平均分子量為4.02×103D。

2.5 紅外光譜分析

如圖4所示，麥冬多糖POJ-U1a的特征吸收峰: 3423cm-1出現(xiàn)的寬峰是O-H伸縮振動(dòng)峰，表明該多糖存在分子間和分子內(nèi)氫鍵;2926cm-1和2853cm-1處為多糖-CH2-的C-H伸縮振動(dòng)引起的;1637cm-1處為多糖中結(jié)晶水或氨基N-H變角振動(dòng)引起的; 1119cm-1處為多糖C-O伸縮振動(dòng)引起的;871cm-1處的吸收峰為呋喃環(huán)或羥基呋喃環(huán)，表明麥冬多糖POJ-U1a中的糖環(huán)構(gòu)型為呋喃類(lèi)。

圖2 POJ-U1a的Sephadex G-150凝膠層析柱色譜圖

圖3 麥冬多糖POJ-U1a的高效液相凝膠滲透色譜圖

圖4 POJ-U1a的紅外光譜圖

2.6 氣相色譜分析

氣相分析圖5和圖6表明，麥冬多糖POJ-U1a由單一葡萄糖組成，屬于葡聚糖。

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖

2.7 原子力顯微鏡觀測(cè)結(jié)果

原子力顯微鏡(AFM)是以物理學(xué)原理為基礎(chǔ)的一種新型表面分析儀器，能夠提供生物大分子納米級(jí)的三維結(jié)構(gòu)信息，因此被廣泛應(yīng)用于高分子聚合物和生物大分子表面形貌的研究［15］。

圖6 POJ-U1a衍生物的氣相色譜圖

如圖7(A、B)可以看到，麥冬多糖POJ-U1a由長(zhǎng)鏈折疊、纏繞形成，分枝較多，圖像的對(duì)比度依賴(lài)于針尖上的作用力大小，作用力太大易損壞糖鏈，太小對(duì)比度較差，圖像模糊，最佳的作用力為3～4nN，從圖中可以看到，多糖聚合物鏈相互纏繞，鏈的高度均在1nm左右，鏈寬0.2～0.7μm，一般多糖的分子鏈大小為0.1～1.0nm，我們得到的圖像寬度遠(yuǎn)大于單鏈分子的估計(jì)值，這一方面可能是由于針尖在掃描時(shí)與分子間相互作用導(dǎo)致增寬效應(yīng);另一方面估計(jì)是由于糖鏈間范德瓦爾斯力相互作用及糖鏈與帶負(fù)電的云母表面產(chǎn)生相互作用，使得多糖鏈分子聚集平鋪在云母表面。鏈間通過(guò)糖單元間不同的連接方式衍生出許多大大小小的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，尺寸在幾百納米到幾個(gè)微米不等，證明麥冬多糖大分子具有高度分枝的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖7 POJ-U1a的AFM圖像

由圖7(C)可以清楚地看到，鏈中有孔洞出現(xiàn)，圖7(D)可以看出，這些孔洞的形成是鏈間相互纏繞、折疊的結(jié)果。還可以看到多糖分子間的纏繞及螺旋狀排列，此螺旋結(jié)構(gòu)再相互聚集，形成比較大的多糖聚集體，這種現(xiàn)象可能是Van Der Waals相互作用及鏈間氫鍵締合所導(dǎo)致的。

總之，利用功率超聲從麥冬中提取麥冬多糖是一種簡(jiǎn)單、可行而有效的方法。應(yīng)用層析柱法對(duì)麥冬粗多糖進(jìn)行分離純化，可以得到純度比較高的單一組分。高效液相色譜法、紅外光譜法、氣相色譜法及原子力顯微鏡也是分析麥冬多糖結(jié)構(gòu)的有力手段。

3 結(jié)論

用高效液相色譜、氣相色譜、傅里葉紅外光譜對(duì)超聲提取麥冬多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，麥冬多糖POJ-U1a為均一多糖，其平均分子量為4.02× 103D;麥冬多糖POJ-U1a具有一般多糖類(lèi)物質(zhì)的特征吸收峰，它的單糖殘基以呋喃環(huán)的形式存在;麥冬多糖POJ-U1a為葡聚糖，極易溶于水，黏度非常高，估計(jì)是麥冬中黏性物質(zhì)的主要成分。用原子力顯微鏡觀察麥冬多糖POJ-U1a，結(jié)果得到了清晰、穩(wěn)定的圖像，證明麥冬多糖具有高度分枝的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

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Structure investigation and observation of microstructure of ophiopogon japonicus polysaccharide POJ-U1a with atomic force microscope

WANG Xiao-mei，SUN Run-guang*，XUE Hui-jun，HAN Tao
(College of Physics and Information Technology，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

Ophiopogon japonicus polysaccharide JOP-U1 was extracted by ultrasonic power.It was separated and purified by DEAE-52 cellulose column and Sephadex G-150 gel column，POJ-U1a was acquired，then its relative molecular weight was determined by high performance gel permeation chromatography(HPGPC)，its chemical structure was analyzed by the techniques of infrared spectrometry and gas chromatography，and its external figure was observed by atomic force microscopy(AFM).The determination results showed that the relative molecular weight of ophiopogon japonicus polysaccharide POJ-U1a was 4.02×103D，it is glucan composed by glucose.The infrared spectrum suggested that there were characteristic absorption bands of polysaccharide in JOP-U1，and its monosaccharide residues existed in the forms of furan rings.AFM revealed that it had a multi-branched structure in linkages of adjacent monosaccharides.

ophiopogon japonicus polysaccharide;structure analysis;atomic force microscopy(AFM)

TS201.2+3

A

1002-0306(2011)03-0081-04

麥冬為百合科多年生草本植物的干燥塊根，主要活性成分麥冬多糖具有多種生物活性，主要表現(xiàn)在抗心肌缺血、降血糖、耐缺氧能力、抗過(guò)敏活性、免疫活性、對(duì)胃腸道作用活性等方面［1-2］。為了提高中藥生產(chǎn)效率，已有不少研究者將功率超聲技術(shù)引用到中藥提取過(guò)程中，研究超聲作用對(duì)中藥提取過(guò)程的影響，并取得了一定的成果。如G.L.Cote等［3］對(duì)不同頻率超聲波的降解作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)20kHz的超聲波比1.5MHz超聲波的降解作用更強(qiáng)，使得所得產(chǎn)品具有非常低的分子量分布。Mei Zhang等［4］運(yùn)用熱水法和超聲波處理法分別對(duì)側(cè)耳菌核和菌絲體進(jìn)行提取，結(jié)果表明，側(cè)耳菌核和菌絲體中水溶性多糖的抗腫瘤活性依賴(lài)于其分離方法，不同的分離方法對(duì)提取物的分子量和組成成分都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。目前對(duì)于超聲提取麥冬多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)的研究尚不多見(jiàn)，超聲提取對(duì)麥冬多糖結(jié)構(gòu)的影響是一個(gè)值得研究的問(wèn)題。由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且難以形成晶體，因此對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究比較困難，原子力顯微鏡的出現(xiàn)使得多糖表面形貌的觀察成為可能［5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)功率超聲提取麥冬多糖，并對(duì)其進(jìn)行分離純化，利用原子力顯微鏡觀察其微觀形貌，獲得了較清晰的分子鏈構(gòu)象，這為進(jìn)一步研究其微觀結(jié)構(gòu)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2009-09-07 *通訊聯(lián)系人

王小梅(1983-)，女，碩士研究生，主要從事分子生物物理研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(10874108);陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(SJ08A16)資助。