全葉青蘭中黃酮類化合物的超聲輔助提取工藝研究

全春喜，劉秀穎，劉玉梅，蘇景秀

(新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

全葉青蘭中黃酮類化合物的超聲輔助提取工藝研究

全春喜，劉秀穎，劉玉梅*，蘇景秀

(新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

通過正交實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了全葉青蘭總黃酮類化合物的提取工藝，得出最佳提取工藝為:乙醇濃度為70%，料液比為1∶15，提取溫度為55℃，總提取時(shí)間2h，其中超聲輔助提取時(shí)間為30min，總黃酮的提取量為25mg/g左右。對該工藝條件下提取所得到的乙醇提取物采用不同極性的溶劑進(jìn)行極性部位的初步分離后的定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各提取部位均含有黃酮類化合物，其中乙醚分離的弱極性部分不含鄰二酚羥基的黃酮，而乙酸乙酯提取的部分則含有二氫黃酮或二氫黃酮醇類，全葉青蘭中的黃酮類化合物以極性較大的黃酮苷類為主，游離苷元的含量較低。

全葉青蘭，黃酮類化合物，提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全葉青蘭 采自新疆塔城地區(qū)裕民縣境內(nèi)，將全葉青蘭粉碎，采用超臨界CO2萃取技術(shù)分離出其中的脂溶性成分，萃余物備用;蘆丁 購自中國藥品生物制品檢定所;亞硝酸鈉、硝酸鋁、鎂粉、醋酸鎂、氯化鍶、氫氧化鈉、丙酮、乙醚、乙酸丁酯、正丁醇、乙醇等 均購自化學(xué)試劑商店，分析純。

表1 乙醇濃度對總黃酮提取的影響

表2 不同提取方法對總黃酮提取的影響

電子天平 德國賽多利斯BS210S型;WFZ26A型紫外-可見分光光度計(jì) 天津光學(xué)儀器廠;HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn);R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申科機(jī)械研究所;SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，超聲儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的測定方法 總黃酮的測定采用硝酸鋁比色法［11］。準(zhǔn)確稱取0.1146g蘆丁，用30%乙醇溶解并定容至100mL的容量瓶中，制成1.146mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。分別吸取剛配制好的蘆丁標(biāo)液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL置于8個(gè)25mL的容量瓶中，用30%乙醇補(bǔ)至10mL后，加入1mL的5%的NaNO2搖勻，避光保存1h。再加入1mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6min，加入10mL的1mol/L的NaOH溶液，搖勻，放置15min后用紫外分光光度計(jì)于510nm波長處測定吸光值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:總黃酮濃度 =-0.03381A510+0.48384，R= 0.9992。樣品的測定方法同上，將其中的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液用1mL全葉青蘭提取液代替，測定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品的總黃酮濃度。

1.2.2 黃酮的提取方法 準(zhǔn)確稱取全葉青蘭樣品置于三角瓶中，并用相應(yīng)的提取溶劑提取，控制相應(yīng)的提取溫度、超聲時(shí)間和提取時(shí)間，提取完成后，過濾，濾液定容至一定的體積，測定其中的總黃酮含量。

1.2.3 全葉青蘭總黃酮的初步分離 對采用70%乙醇提取的全葉青蘭總黃酮的提取物，經(jīng)濃縮除去大部分乙醇后又依次采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等不同極性的溶劑對其進(jìn)行初步分離，分離過程的簡單示意圖見圖1。

圖1 全葉青蘭中黃酮類化合物的分離

1.2.4 黃酮類的定性分析 濃鹽酸-鎂粉反應(yīng):將樣品溶于1.0mL甲醇或乙醇中，加入少許鎂粉振搖，滴加幾滴濃鹽酸，1～2min內(nèi)(必要時(shí)微熱)即可顯色，觀測反應(yīng)現(xiàn)象。鋁鹽反應(yīng):2～3mL樣品的甲醇溶液，加2～4mL 1%硝酸鋁甲醇溶液，觀察并記錄反應(yīng)現(xiàn)象。鎂鹽反應(yīng):在濾紙上滴加一滴供試液，噴以醋酸鎂的甲醇溶液，干燥后置紫外光燈下觀察。氯化鍶反應(yīng):取少許樣品于小試管中，加入1.0mL甲醇溶解，再加0.01mol/L氯化鍶的甲醇溶液3滴和被氨氣飽和的甲醇溶液3滴，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果均是采用 Microsoft Excel或OriginPro 7.0專業(yè)軟件來處理的，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(means±standard deviation)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度的選擇

可用于提取黃酮類化合物的溶劑很多，主要為甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、水或某些極性較大的混合溶劑等，從溶劑的安全性和成本等考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇用乙醇做提取劑。由于黃酮類化合物種類復(fù)雜，不同濃度的乙醇對黃酮類化合物的溶解性能不盡相同，因此選擇合適的提取全葉青蘭的乙醇濃度就很關(guān)鍵。表1是不同濃度乙醇對總黃酮提取的影響。

表1中數(shù)據(jù)表明，乙醇濃度從30%提高到60%，總黃酮的提取率明顯增加，70%乙醇溶液略高于60%，而95%的乙醇提取收率明顯下降。因此，在接下來的實(shí)驗(yàn)中均采用70%的乙醇作為提取溶劑。

2.2 提取工藝的選擇

為了比較不同的實(shí)驗(yàn)條件對提取效率的影響，又分別選擇了回流、索氏提取、超聲波輔助提取等方法，結(jié)果見表2。

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)t-Test檢驗(yàn)的結(jié)果表明，在p為0.05的水平下，各方法之間無明顯差異，考慮到超聲輔助提取所用的時(shí)間較少，因此選擇超聲提取法為宜。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)對提取條件的選擇

影響全葉青蘭中總黃酮提取率的因素，溶劑、總提取時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度、料液比等都會對提取效率產(chǎn)生一定的影響。為了更有效地找到提取條件，實(shí)驗(yàn)中采用正交實(shí)驗(yàn)的方法來優(yōu)選全葉青蘭的提取工藝條件。由前述的乙醇濃度選擇實(shí)驗(yàn)可知，乙醇濃度在60%～70%之間提取率呈增加趨勢，因此在正交實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步選擇了乙醇濃度作為一個(gè)考察因素，其次，選擇以提取溫度、提取時(shí)間和超聲時(shí)間作為正交實(shí)驗(yàn)的考察因素。表3為正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取溫度影響因素最大，其次為超聲時(shí)間，總提取時(shí)間、乙醇濃度。在正交實(shí)驗(yàn)選定的溫度下，提取溫度越高越有利于反應(yīng);超聲時(shí)間為30min有利于提取完全;總提取時(shí)間2h對全葉青蘭中的黃酮類化合物的提取效率最高，而乙醇濃度影響相對較小，這是由于預(yù)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)選擇了相對較好的乙醇濃度。正交實(shí)驗(yàn)極差分析中的最好實(shí)驗(yàn)條件為A2B1C2D3，而從正交實(shí)驗(yàn)中得出的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為A2B2C2D3，即70%乙醇，溫度55℃，總提取時(shí)間2h，其中超聲萃取30min。

表4 提取溫度對總黃酮提取的影響

表5 料液比對總黃酮提取的影響

表6 最佳工藝條件的驗(yàn)證與放大實(shí)驗(yàn)

表7 不同極性黃酮類化合物的顯色反應(yīng)

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 提取溫度的影響

從正交實(shí)驗(yàn)的趨勢來看，提取溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響呈上升趨勢，并不能說明正交實(shí)驗(yàn)選擇的溫度已達(dá)到最佳，因此，又借助進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考察了提取溫度對提取率的影響，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，55℃為最佳反應(yīng)溫度，這是由于溫度過低不利于黃酮類化合物的溶出，而溫度過高，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)可能會受到破壞，因而萃取率反而會降低。

2.5 料液比的影響

在確定了上述提取條件后，有必要對物料和提取液的料液比進(jìn)行考察，表5為料液比與總黃酮提取率的關(guān)系。

表5中數(shù)據(jù)表明，料液比增大，提取率提高，當(dāng)料液比為1∶25時(shí)提取率最高。這是由于料液比較小時(shí)，溶液濃度較高，黃酮類化合物提取不完全，而料液比過高時(shí)，溶劑的回收時(shí)間過長，反而造成了其中黃酮類化合物的損失，由于提取的料液比從1∶15～1∶25之間已無明顯差別，因此考慮到提取成本等因素，最終選擇料液比為1∶15較為合理。

2.6 最佳工藝條件的驗(yàn)證與放大

通過對正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化，最終得到全葉青蘭的最佳提取工藝為:乙醇濃度為70%，料液比為1∶15，水浴溫度55℃，總提取時(shí)間2h，期間輔助超聲提取30min的條件下萃取兩次。表6為對該實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證和放大。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取條件下，全葉青蘭中的總黃酮的含量優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，且放大實(shí)驗(yàn)表明總黃酮的提取收率穩(wěn)定。

3 全葉青蘭總黃酮的定性

為初步考察全葉青蘭提取物中總黃酮的種類，對分離得到的不同極性部位的黃酮類化合物又通過其特征顯色反應(yīng)進(jìn)行了初步定性，結(jié)果見表7。

上述結(jié)果表明，全葉青蘭中可能含有3-羥基、4-羰基或5-羥基、4-羰基或鄰二酚羥基的黃酮，其中，乙醚分離的弱極性部分不含鄰二酚羥基的黃酮，而乙酸乙酯提取的部分則含有二氫黃酮或二氫黃酮醇類。上述不同溶劑所得到的由弱極性→強(qiáng)極性部位的總黃酮的比例為13.25∶11.2∶41.8∶33.75，說明全葉青蘭中的總黃酮類物質(zhì)是以極性大的糖苷類化合物為主，苷元形式存在較少，這一點(diǎn)與最初選擇溶劑時(shí)95%的乙醇提取率較低也是一致的。

4 結(jié)論

全葉青蘭是新疆的一種特色植物資源，本文通過正交實(shí)驗(yàn)對全葉青蘭中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出采用70%乙醇濃度，在料液比為1∶15，提取溫度55℃的條件下萃取2h，期間采用超聲波輔助萃取30min為最佳提取工藝，在該工藝條件下的驗(yàn)證和放大實(shí)驗(yàn)中提取率穩(wěn)定。對全葉青蘭中黃酮類化合物的初步定性分析表明，全葉青蘭中的黃酮類化合物以極性較強(qiáng)的黃酮苷類為主，極性相對較弱的游離苷元的含量較低，對全葉青蘭中的黃酮類化合物的進(jìn)一步的分離、純化和鑒定將是下一步工作的重點(diǎn)。

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Study on extraction process of flavonoids from Dracocephalum integrifolium Bge.

QUAN Chun-xi，LIU Xiu-ying，LIU Yu-mei*，SU Jing-xiu
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

Extraction process of flavonoids from Dracocephalum integrifolium Bge.were obtained combining with orthogonal design methods and single-factor experiment，namely was 70%alcohol(v/v)，1∶15 ratio of material to liquid，55℃，the total extraction time of 2h，30min treatment by ultrasonic-wave assistant.Based on the conditions，the extraction yield of flavonoids was about 25mg/g.This confirmed that the optimized condition was suitable and feasible.A preliminary separation process was carried out by extracting concentrated ethanol extract with different solvents which have varying polarity.The qualitative analysis results showed that all fractions contained flavonoids. Non-polar fraction obtained from ether extracts contained no ortho-diphenolic hydroxyl flavone and medium-polar fraction obtained from acetic ether extracts contained flavanones or flavanonols.The results indicated that the main portion of the flavonoids from Dracocephalum integrifolium Bge.was flavonoid glycosides，and free flavonoids content were low.

Dracocephalum integrifolium Bge.;flavonoids;extraction process;orthogonal experiment

TS201.2

A

1002-0306(2011)03-0312-04

全葉青蘭，學(xué)名Drococephalum integrifolium，維吾爾語稱其為馬爾贊居西，為唇形科多年生草本植物。全葉青蘭主要生長于昆侖山或天山北坡海拔1200～1300m左右的石質(zhì)或粘土的向陽山坡上，在次生裸地上成片生長，喜肥沃土壤，于每年的6、7月間盛花期時(shí)采集，其地上部分的藥用價(jià)值最高［1］，臨床主要用于治療氣管炎、哮喘等，有清熱解毒、鎮(zhèn)咳止喘等功效［2-5］。我國中醫(yī)和維吾爾醫(yī)對全葉青蘭早有應(yīng)用，從治療效果上來看，其對支氣管哮喘治療作用顯著，在對500名左右不同年齡的各類哮喘病患者的治療中，總有效率在94%以上，顯效率在60%以上，特別是對咳、痰、喘的癥狀緩解速度快，效果明顯［6-8］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)均是將其采用水煎煮或乙醇提取的方法得到的提取物直接服用或采用簡單工藝制成片劑、噴劑等使用，1977年版的中國藥典即將全葉青蘭收錄其中［9］，但由于該植物品種主要生長地是在新疆的北疆地區(qū)，數(shù)量較少，且比較分散，對其中藥效成分的研究報(bào)道很少［10］。研究表明，全葉青蘭的主要藥用部分為其中的精油和黃酮類化合物，因此對其中的主要成分的提取工藝的研究，可以為提高該植物的使用價(jià)值提供更合理的途徑。作者對全葉青蘭中的脂溶性成分已采用超臨界CO2提取的方法將其分離，本文的重點(diǎn)是通過正交實(shí)驗(yàn)的方法研究從全葉青蘭的超臨界CO2的萃余物中提取其中黃酮類化合物的提取工藝，并對提取物采用不同極性的溶劑進(jìn)行初步的分離和定性。

2010-02-01 *通訊聯(lián)系人

全春喜(1987-)，男，在讀本科生，研究方向:化學(xué)專業(yè)。

新疆大學(xué)“國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”項(xiàng)目(091075509)。