雙靶點(diǎn)分子探針68Ga-RGD-BBN用于乳腺癌的microPET顯像

趙慧云, 劉 妍,2, 賈 兵,2, 王 凡,2, 劉昭飛,2

1.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)同位素研究中心，北京 100191；

2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室，北京 100191

雙靶點(diǎn)分子探針68Ga-RGD-BBN用于乳腺癌的microPET顯像

趙慧云1, 劉 妍1,2, 賈 兵1,2, 王 凡1,2, 劉昭飛1,2

1.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)同位素研究中心，北京 100191；

2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室，北京 100191

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp，RGD)和蛙皮素 (bombesin，BBN)多肽分別能夠特異性識(shí)別整合素αvβ3和胃泌素釋放肽受體 (gastrin releasing peptide receptor，GRPR)。我們用谷氨酸將RGD和BBN連接制備成RGD-BBN異源二聚體多肽，用雙功能連接劑NOTA偶聯(lián)RGD-BBN后進(jìn)行68Ga放射性標(biāo)記，在 MDA-MB-435(GRPR－/整合素 αvβ3+)和 T47D(GRPR+/整合素αvβ3↓)腫瘤細(xì)胞及荷瘤裸鼠模型中，測定68Ga-RGD-BBN的體外細(xì)胞攝取和體內(nèi)腫瘤microPET顯像特性，并且與其對(duì)應(yīng)單體68Ga-RGD和68Ga-BBN進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，68Ga-RGD-BBN可以靈敏地對(duì)整合素 αvβ3和GRPR任何一個(gè)受體高表達(dá)的腫瘤進(jìn)行顯像，并且較其單體具有更高的腫瘤攝取。說明68Ga-RGD-BBN有望成為一種廣譜的用于GRPR－/整合素αvβ3+和 GRPR+/整合素 αvβ3↓腫瘤診斷的顯像劑。

RGD-BBN；整合素αvβ3；GRPR；乳腺癌；microPET顯像

引 言

腫瘤特異性專一表達(dá)或高表達(dá)的受體 (receptor)可作為腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)。通過無創(chuàng)的方法檢測受體的表達(dá)水平對(duì)于腫瘤的準(zhǔn)確診斷、分級(jí)及預(yù)后評(píng)價(jià)具有極其重要的意義。近些年來，放射性核素標(biāo)記的多肽分子用于腫瘤的PET(positron emission tomography)和SPECT(single photon emission computed tomography)顯像，成為腫瘤核醫(yī)學(xué)分子影像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

Bombesin(BBN，蛙皮素)是一種含有14個(gè)氨基酸的多肽。研究表明，BBN識(shí)別的受體，尤其是胃泌素釋放肽受體 (gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)在多種腫瘤組織 (如小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌等[1,2])呈現(xiàn)高表達(dá)，而在正常組織低表達(dá)或不表達(dá)。這一特性使其成為一種腫瘤特異性靶點(diǎn)，用于腫瘤診斷和靶向放射治療。近年來，一系列核素 (99mTc、111In、64Cu、177Lu、18F、68Ga等)標(biāo)記的BBN及其類似物，已經(jīng)廣泛用于臨床前和臨床階段的腫瘤顯像和治療研究。

整合素αvβ3在腫瘤生長、血管生成、局部浸潤、轉(zhuǎn)移潛能的控制等方面發(fā)揮著重要作用[3,4]，高表達(dá)于侵襲性腫瘤 (如晚期神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌)及腫瘤新生血管[5]，其表達(dá)水平是確定惡性腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力的一個(gè)重要指標(biāo)。目前，我們與其它課題組已經(jīng)成功合成和制備了一系列的RGD(Arg-Gly-Asp)類分子顯像劑，用于體內(nèi)腫瘤整合素αvβ3受體表達(dá)水平的分子顯像，其中[18F]-AH111585和[18F]-Galacto-RGD已經(jīng)進(jìn)行了臨床階段的研究[6,7]。

針對(duì)單一靶點(diǎn)的腫瘤顯像，要求腫瘤組織特異性高表達(dá)某種受體 (如GRPR)且正常組織不表達(dá)或是低表達(dá)這種受體。而在腫瘤生長過程中，腫瘤細(xì)胞表面的受體會(huì)呈現(xiàn)異質(zhì)性和不均一性，即便同種腫瘤患者，其腫瘤組織表達(dá)的受體類型或表達(dá)水平也會(huì)不一致。另外，一種腫瘤細(xì)胞表面也會(huì)表達(dá)兩種或多種受體。因此，雙靶點(diǎn)或多靶點(diǎn)分子探針的應(yīng)用更能提高腫瘤顯像診斷的準(zhǔn)確率?；诖?，在前期工作中，我們制備了包含RGD模序和BBN模序的RGD-BBN異源二聚體分子[8]。在雙受體陽性PC-3腫瘤模型中，18F標(biāo)記的RGD-BBN異源二聚體分子顯示出了整合素αvβ3和GRPR的雙重靶向性及更佳的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)特征[8]。在本研究中，我們將雙功能連接劑1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid(NOTA)偶聯(lián)到RGD-BBN異源二聚體分子上，用正電子核素68Ga(t1/2=68 min，β+=89%，EC=11%)進(jìn)行標(biāo)記，制備雙靶點(diǎn)分子探針68Ga-RGD-BBN(圖1)。我們選用兩種具有代表性的乳腺癌動(dòng)物模型 (T47D和MDA-MB-435)進(jìn)行體內(nèi)顯像，以評(píng)價(jià)68Ga-RGD-BBN較其對(duì)應(yīng)單體68Ga-RGD和68Ga-BBN在腫瘤顯像中的優(yōu)勢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T47D細(xì)胞高表達(dá)GRPR，其整合素αvβ3受體表達(dá)水平低 (GRPR+/整合素αvβ3↓)；而MDA-MB-435細(xì)胞高表達(dá)整合素 αvβ3，不表達(dá) GRPR(GRPR－/整合素 αvβ3+)[9]。

圖1 68Ga-RGD-BBN的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 RGD-BBN為cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)-Glu-(Aca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)Fig.1 Chemical structureof68Ga-RGD-BBN RGD-BBN is cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)-Glu-(Aca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)

材料與方法

主要試劑和儀器

所有化學(xué)試劑均為分析純。p-SCN-Bn-NOTA 購自Macrocyclics(Dallas，TX)。Chelex 100柱購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。所有用于放射性核素68Ga標(biāo)記的水或溶液均過Chelex 100柱以保證無金屬離子的污染。多肽Aca-BBN(7-14)(BBN)和c(RGDyK)(RGD)由Peptides International公司合成。RGD-BBN異源二聚體的具體合成過程同前期工作[8]。68Ga經(jīng)68Ge/68Ga發(fā)生器 (Obninsk,Russia)由0.1 N HCl淋洗獲得。反相高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)同我們前期工作[10,11]。

NOTA偶聯(lián)

NOTA-c(RGDyK)(NOTA-RGD)、NOTA-Aca-BBN(7-14)(NOTA-BBN)和 NOTARGD-BBN根據(jù)前期工作描述的方法制備[10,12]。三種產(chǎn)物分別經(jīng)分析HPLC和MALDI-TOF〔matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI)time-of-flight(TOF)〕質(zhì)譜確定。

68Ga放射性標(biāo)記

具體標(biāo)記過程同前[10,12]。簡言之，分別將5 nmol的NOTA-RGD、NOTA-BBN或NOTA-RGD-BBN溶于500 μl的0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液中，加入4 mCi(148 MBq)的68Ga，40℃反應(yīng)15 min。用HPLC對(duì)68Ga-RGD、68Ga-BBN或68Ga-RGD-BBN進(jìn)行純化。收集產(chǎn)物的放射性吸收峰，經(jīng)旋蒸儀旋干。用PBS溶解反應(yīng)產(chǎn)物，過0.22 μm微孔濾膜后收集于無菌瓶中，用于后期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)衰變校正后的標(biāo)記率分別是：68Ga-RGD(Rt=12.9 min)94%；68Ga-BBN(Rt=21.8 min)93%；68Ga-RGD-BBN(Rt=19.9 min)92%。

細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型

T47D和MDA-MB-435細(xì)胞購自ATCC(American Type Culture Collection)，并根據(jù)其推薦條件持續(xù)培養(yǎng)。在每只雌性BALB/c裸鼠 (4～5周齡)的右側(cè)乳腺脂肪墊處接種5×106個(gè)MDA-MB-435細(xì)胞；另取雌性BALB/c裸鼠 (4～5周齡)在其左側(cè)頸部皮下包埋17β-雌二醇 (60天釋放型，Innovative Research of America，Sarasota，F(xiàn)L)，1 d后，于裸鼠右側(cè)乳腺脂肪墊處注射1×107個(gè)T47D細(xì)胞，待腫瘤體積達(dá)到100～300 mm3時(shí) (MDA-MB-435接種后2～3 w，T47D接種后4～5 w)，用于體內(nèi)microPET實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)過程參照前期工作[8,12,13]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前一天，在12孔板中加入每孔5×105個(gè)T47D或 MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞，以保證其貼壁。然后加入68Ga-RGD、68Ga-BBN或68Ga-RGD-BBN(～18 kBq/孔)，37℃孵育15、30、60和120 min。孵育后用冰凍的PBS洗3遍，然后用消化液 (0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA)(Invitrogen，Carlsbad，CA)消化細(xì)胞。收集細(xì)胞懸液用γ計(jì)數(shù)器 (Packard，Meriden，CT)測量。細(xì)胞攝取數(shù)據(jù)經(jīng)衰變校正后用百分加入劑量 (%AD)表示。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，重復(fù)兩次。

MicroPET顯像

參照前期報(bào)道的方法，采用R4小動(dòng)物microPET(Siemens Medical Solutions)進(jìn)行裸鼠的PET掃描和顯像分析[9,13]。麻醉狀態(tài)下的荷T47D或MDA-MB-435腫瘤裸鼠分別經(jīng)尾靜脈注射3.7 MBq(100 μCi)68Ga-RGD、68Ga-BBN或68Ga-RGD-BBN，并于注射后30 min、1 h和2 h時(shí)間點(diǎn)采集5 min靜態(tài)圖像 (每種顯像劑采集4只荷瘤裸鼠)。在阻斷實(shí)驗(yàn)中，荷T47D腫瘤裸鼠由尾靜脈同時(shí)注射過量的Aca-BBN(7-14)(BBN，15 mg/kg小鼠體重)和3.7 MBq的68Ga-RGD-BBN；荷MDA-MB-435腫瘤裸鼠由尾靜脈同時(shí)注射過量的c(RGDyK)(RGD，10 mg/kg小鼠體重)和3.7 MBq的68Ga-RGD-BBN。注射后1 h進(jìn)行相同條件下的5 min靜態(tài)PET掃描。圖像通過二維有序子集最大期望值法 (ordered subset expectation maximization，OSEM)進(jìn)行空間重構(gòu)。在衰變校正的冠狀面顯像圖中，用ASI Pro 5.2.4.0軟件圈出腫瘤、正常組織和器官的感興趣區(qū)域 (region of interest，ROI)。腫瘤或正常組織中的最大放射性濃度通過ROI區(qū)域中的平均像素值獲得，用轉(zhuǎn)換因子轉(zhuǎn)換為MBq/mL·min。假定組織密度為1 g/mL，將ROI轉(zhuǎn)化為MBq/g·min，然后除以注射劑量，就得到PET定量的每克百分注射劑量 (%ID/g)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示。采用方差分析和t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05時(shí)，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

化學(xué)和放射化學(xué)

通過HPLC和質(zhì)譜兩種分析方法證實(shí)了NOTA-RGD、NOTA-BBN和NOTA-RGD-BBN制備產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。放射性標(biāo)記過程在40℃條件下15 min內(nèi)完成，其經(jīng)衰變校正后的標(biāo)記率在90%以上，經(jīng)HPLC純化后，放射化學(xué)純度均大于98%。

細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

圖2 T47D(A)或MDA-MB-435(B)腫瘤細(xì)胞中68Ga-RGD、68Ga-BBN和68Ga-RGD-BBN的細(xì)胞攝取結(jié)果 (x±s，n=3)Fig.2 Cell uptake assay of68Ga-RGD,68Ga-BBN and68Ga-RGD-BBN on T47D(A)or MDA-MB-435(B)tumor cells(x±s,n=3)

采用T47D和MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞進(jìn)行68Ga-RGD、68Ga-BBN和68Ga-RGD-BBN的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。如圖2A，從15到120 min，68Ga-BBN在T47D細(xì)胞中的攝取高于68Ga-RGD-BBN和68Ga-RGD。68Ga-RGD表現(xiàn)為最低的細(xì)胞攝取，其在120 min處出現(xiàn)最大值 (0.65±0.25)%AD。68Ga-RGD-BBN的細(xì)胞攝取曲線位于68Ga-BBN和68Ga-RGD之間；它在孵育60 min后達(dá)到平臺(tái) 〔(2.22±0.64)%AD〕，并且一直保持到2 h。68Ga-RGD-BBN在MDA-MB-435細(xì)胞中的攝取相對(duì)低于T47D細(xì)胞。如圖2B，68Ga-RGD-BBN的細(xì)胞攝取隨時(shí)間增加，并在60 min時(shí)達(dá)到最大攝取值 〔(1.36±0.61)%AD〕，之后保持到2 h。相對(duì)于68Ga-BBN在T47D的攝取，其在MDA-MB-435細(xì)胞的攝取量很低。

MicroPET顯像

荷T47D和DA-MB-435腫瘤裸鼠 (每組4只)經(jīng)尾靜脈注射3.7 MBq(100 μCi)的68Ga-RGD、68Ga-BBN或68Ga-RGD-BBN后，在不同的時(shí)間點(diǎn)采集其冠狀面圖像，具有代表性的顯像圖示于圖3。注射68Ga-RGD-BBN后30到120 min，T47D和MDA-MB-435腫瘤均清晰可見，且與腫瘤對(duì)側(cè)相比具有很好的對(duì)比度。在30 min時(shí)間點(diǎn)的顯像中，可見68Ga-RGD-BBN在腎中也有顯著的攝取，這應(yīng)該是由于它主要通過腎臟代謝后排出體外的緣故。68Ga-RGD在裸鼠中的本底較低，表明該顯像劑在體內(nèi)清除較快。68Ga-BBN在上腹部呈放射性濃集，提示該顯像劑部分經(jīng)肝膽排泄。顯像劑在腫瘤以及其它主要器官中的攝取量通過分析ROI獲得。

圖3 注射3.7 MBq68Ga標(biāo)記的顯像劑后，在不同時(shí)間點(diǎn)采集的衰變校正的冠狀面顯像圖 箭頭所示為腫瘤部位Fig.3 Decay-corrected whole-body coronal microPET imagesof T47D and MDA-MB-435 tumor-bearing mice Arrows indicate the presence of tumors

68Ga-RGD、68Ga-BBN和68Ga-RGD-BBN三種顯像劑在腫瘤、肝臟和腎臟中的攝取值比較見圖4。每個(gè)顯像劑在正常器官的攝取值通過8只小鼠 (4只荷T47D腫瘤小鼠和4只荷MDA-MB-435腫瘤小鼠)的數(shù)據(jù)得出，而每個(gè)顯像劑的T47D或MDA-MB-435腫瘤攝取值通過4只小鼠測得。如圖4A所示，68Ga-RGD-BBN的血液清除較68Ga-RGD和68Ga-BBN緩慢。68Ga-RGD、68Ga-BBN和68Ga-RGD-BBN在注射后120 min的血液攝取值分別為 (0.58±0.15)、 (0.40±0.14)和 (0.67±0.14)%ID/g(n=8)。68Ga-BBN和68Ga-RGD-BBN在注射后30到120 min的腎攝取值大致相等。68Ga-BBN的肝攝取量 〔注射后30、60和120 min分別為(4.45±1.02)、 (3.57±1.13)和 (3.15±0.97)%ID/g〕明顯高于68Ga-RGD-BBN 〔注射后 30、60和 120 min 分別為 (2.67±0.29)、 (2.08±0.43) 和 (1.60±0.09)%ID/g〕。

68Ga-RGD、68Ga-BBN和68Ga-RGD-BBN三種顯像劑在T47D和MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞中的吸收對(duì)比見圖4D和4E。經(jīng)計(jì)算，注射后30、60和120 min，68Ga-RGD-BBN在T47D腫瘤中的攝取值分別為 (3.91±1.13)、 (2.85±0.79)和 (2.42±0.29)%ID/g，均顯著性高于68Ga-RGD 〔注射后30、60和120min分別為 (1.83±0.31)、(1.22±0.48)和 (0.85±0.32)%ID/g，P＜0.001〕和68Ga-BBN 〔注射后 30、60 和 120 min 分別為 (2.74±1.02)、(2.35±0.86) 和(1.41±0.49)%ID/g，P＜0.01〕。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，68Ga-RGD在T47D腫瘤中的攝取值也顯著性低于68Ga-BBN(P＜0.01)。68Ga-RGD-BBN在MDA-MB-435腫瘤中的攝取值顯著高于68Ga-RGD和68Ga-BBN(P＜0.05，圖4D)。68Ga-BBN在MDA-MB-435腫瘤中的攝取很低，其中最高攝取值為 (0.64±0.13)%ID/g(注射后30 min)，見圖4D。T47D和MDA-MB-435腫瘤模型注射68Ga-RGD、68Ga-BBN和68Ga-RGD-BBN后60 min，腫瘤/非腫瘤 (T/NT)的放射性比值如圖4F和4G所示。T47D腫瘤模型中，68Ga-RGD、68Ga-BBN和68Ga-RGD-BBN的腫瘤/血液的比值分別為1.51±0.39、3.45±1.07和2.71±0.65。68Ga-RGD-BBN同68Ga-BBN的腫瘤/腎臟比值相當(dāng)，且顯著高于68Ga-RGD(P＜0.05)。68Ga-RGD-BBN和68Ga-RGD具有相當(dāng)?shù)哪[瘤/肝臟比值，且顯著高于68Ga-BBN(P＜0.05)，見圖4F。

MDA-MB-435腫瘤模型中，68Ga-RGD的腫瘤/血液、腫瘤/腎臟和腫瘤/肝臟的放射性比值分別為1.83±0.47、1.59±0.14和0.61±0.12；68Ga-RGD-BBN的腫瘤/血液、腫瘤/腎臟和腫瘤 /肝臟的比值分別為 2.13±0.51、1.08±0.22 和 0.57±0.16(圖 4G)。

我們通過阻斷實(shí)驗(yàn)來證實(shí)68Ga-RGD-BBN在T47D和MDA-MB-435腫瘤模型中的受體結(jié)合能力。如圖5所示，當(dāng)68Ga-RGD-BBN和過量的BBN同時(shí)注射時(shí)，其在T47D腫瘤中的攝取被部分抑制，攝取量從 (2.85±0.79)%ID/g降低到 (1.14±0.39)%ID/g。這表明，68Ga-RGD-BBN的RGD模序也可以識(shí)別T47D腫瘤的整合素受體。在68Ga-RGD-BBN與過量RGD同時(shí)注射入MDA-MB-435腫瘤模型時(shí)，其攝取完全被抑制，攝取量從 (2.24±0.73)%ID/g降低到 (0.39±0.08)%ID/g。由于MDA-MB-435腫瘤不表達(dá)GRPR，所以用RGD阻斷可以使MDA-MB-435腫瘤中的68Ga-RGD-BBN攝取完全得到抑制。這表明68Ga-RGD-BBN 在MDA-MB-435腫瘤中的結(jié)合是整合素αvβ3介導(dǎo)的特異性結(jié)合。

圖5 (A)3.7 MBq68Ga-RGD-BBN注射到荷T47D或MDA-MB-435腫瘤裸鼠 〔有無過量的BBN(15 mg/kg)和RGD(10 mg/kg)多肽封閉〕得到的其衰變校正的冠狀面顯像圖 (n=3～4)，箭頭所示為腫瘤部位；(B)68Ga-RGD-BBN在T47D腫瘤中實(shí)驗(yàn)組和BBN阻斷組的腫瘤攝取，以及68Ga-RGD-BBN在MDA-MB-435腫瘤中實(shí)驗(yàn)組和RGD阻斷組的腫瘤攝取值 (以%ID/g±SD形式表示，n=3～4)Fig.5 (A)Decay-corrected whole-body coronal microPET images of T47D or MDA-MB-435 tumor-bearing mice after injection of 3.7 MBq(100 μCi)68Ga-RGD-BBN with or without coinjection of a blocking dose of BBN peptide(15 mg/kg mouse body weight)or RGD peptide(10 mg/kg mouse body weight),respectively(n=3～4),arrows indicate the presence of tumors;(B)The quantified uptake of68Ga-RGD-BBN in T47D tumors with or without preinjection of blocking dose of BBN peptide,and MDA-MB-435 tumors with or without coinjection of a blocking dose of RGD peptide(ROIs are shown as%ID/g±SD,n=3～4)

討 論

以RGD或BBN為基礎(chǔ)的單靶點(diǎn)分子顯像探針的局限性，可能影響到它們?cè)谂R床腫瘤顯像中的廣泛應(yīng)用。1)對(duì)于單受體靶向的分子顯像，細(xì)胞表面靶點(diǎn) (受體)必須在腫瘤組織特異性高表達(dá)而在正常組織不表達(dá)或低表達(dá)。然而，這種情況并不是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的全過程均發(fā)生。例如，在前列腺癌細(xì)胞從激素依賴性到激素不依賴性的生長過程中，GRPR的表達(dá)明顯降低[14]。2)單體多肽與腫瘤靶點(diǎn)結(jié)合的親和力較低，這將導(dǎo)致腫瘤的攝取較低，并且多肽探針易迅速從靶點(diǎn)脫離[15]。例如，RGD單體與整合素受體的親和力不到RGD二聚體親和力的1/5[16]。3)單體的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性可能并不理想。如許多BBN類多肽脂溶性很高，經(jīng)肝膽途徑排泄，因此造成腹腔具有很高的放射性濃集，這將影響該探針用于腹腔腫瘤的顯像。

最近，我們證明了18F標(biāo)記的RGD-BBN異源二聚體在體內(nèi)外具有整合素αvβ3和GRPR雙受體結(jié)合特性[8]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RGD-BBN異源二聚體在分子影像領(lǐng)域的應(yīng)用效果，我們?cè)赗GD-BBN異源二聚體分子上標(biāo)記了可直接用發(fā)生器產(chǎn)生的放射性核素68Ga，同時(shí)也對(duì)于68Ga-RGD-BBN能否作為多種乳腺癌的PET影像探針進(jìn)行了驗(yàn)證。我們還比較了68Ga-RGD-BBN在腫瘤靶向及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)方面與68Ga-RGD和68Ga-BBN的區(qū)別。

根據(jù)腫瘤中雌激素受體的表達(dá)，可以將乳腺癌分為雌激素依賴型 (ER+)和雌激素非依賴型 (ER－)兩類[17]。目前，多種ER+和ER－腫瘤細(xì)胞都廣泛應(yīng)用到乳腺癌的研究中。在我們的前期工作中[9]，我們篩選出一些表達(dá)GRPR和整合素αvβ3的乳腺癌細(xì)胞，ER+：T47D，BT474，MCF-7；ER－：MDA-MB-231，MDA-MB-435，MDA-MB468，BT20。諸如 T47D和BT474的ER+細(xì)胞能夠高表達(dá)GRPR，但其整合素αvβ3的表達(dá)卻相對(duì)較低。而像MDA-MB-435、MDA-MB-231、MDA-MB-468這樣的ER－類型細(xì)胞能夠高表達(dá)整合素αvβ3，而其GRPR的表達(dá)卻幾乎測量不到[9]。我們選擇了 T47D(GRPR+/整合素 αvβ3↓)和MDA-MB-435(GRPR－/整合素αvβ3+)腫瘤細(xì)胞代表兩種腫瘤類型進(jìn)行進(jìn)一步的研究。我們?cè)O(shè)想68Ga-RGD-BBN可以作為一種廣譜的顯像探針用于這兩種類型的乳腺癌顯像，提高顯像診斷的準(zhǔn)確率。

我們?cè)赥47D和MDA-MB-435腫瘤模型中評(píng)價(jià)68Ga-RGD-BBN的顯像效果。相比于68Ga-RGD和68Ga-BBN，68Ga-RGD-BBN在任何檢測時(shí)間點(diǎn)上的腫瘤攝取值都高于任何一種單體顯像劑 (圖 3)。68Ga-RGD可用來檢測T47D腫瘤，但是其腫瘤攝取值很低。這是因?yàn)門47D腫瘤低表達(dá)人整合素αvβ3，只在腫瘤血管表達(dá)鼠整合素αvβ3，并且單體的RGD多肽結(jié)合能力相對(duì)較低。盡管谷氨酸鏈很短，不能使異源二聚體的RGD和BBN模序同時(shí)結(jié)合到受體上，但RGD與整合素受體的結(jié)合勢必能夠增加GRPR周圍的BBN濃度，利于BBN模型與GRPR的結(jié)合，降低其解離，這可能是68Ga-RGD-BBN較68Ga-BBN擁有更高的腫瘤吸收的原因。MDA-MB-435高表達(dá)整合素 αvβ3而不表達(dá) GRPR[9]，BBN模序?qū)τ贛DA-MB-435腫瘤中的受體結(jié)合沒有作用，但是68Ga-RGD-BBN較長的血液循環(huán)時(shí)間使其腫瘤攝取依舊高于68Ga-RGD。通過過量的“冷”RGD，可以阻斷68Ga-RGD-BBN在MDA-MB-435腫瘤的吸收，證明了68Ga-RGD-BBN的腫瘤攝取是整合素受體介導(dǎo)的特異性結(jié)合。

本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)趦煞N乳腺癌細(xì)胞和動(dòng)物模型中，比較了68Ga標(biāo)記的RGD-BBN雙靶點(diǎn)分子探針與其相應(yīng)單體 (68Ga-RGD和68Ga-BBN)的體內(nèi)外特性。結(jié)果顯示，68Ga-RGD-BBN可以進(jìn)行GRPR－/整合素αvβ3+和GRPR+/整合素αvβ3↓乳腺癌的顯像。這樣的雙受體結(jié)合特性使其具有更高的腫瘤攝取，同時(shí)也改善了其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。由于制備簡單、腫瘤攝取增加，以及良好的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性，68Ga-RGD-BBN可以被廣泛地用于整合素αvβ3和GRPR雙受體或單受體陽性腫瘤的PET顯像。

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MicroPET Imaging of Breast Cancer with a Dual-Targeted Molecular Probe68Ga-RGD-BBN

ZHAO Huiyun1,LIU Yan1,2,JIA Bing1,2,WANG Fan1,2,LIU Zhaofei1,2
1.Medical Isotopes Research Center,Peking University,Beijing 100191,China;
2.Department of Radiation Medicine,School of Basic Medical Sciences,Peking University,Beijing 100191,China

This work was supported by grants from the National Natural Sciences Foundation of China(81028009,81000625,30930030,30900373,and 30870728)

Nov 15,2010 Accepted:Jan 24,2011

LIU Zhaofei,Tel:+86(10)82802871,E-mail:liuzf@bjmu.edu.cn

Arg-Gly-Asp(RGD)and bombesin(BBN)can specifically target integrin αvβ3and gastrin releasing peptide receptor(GRPR),respectively.We designed and synthesized a RGD-BBN heterodimeric peptide with both the RGD and BBN motifs in one molecule.RGD-BBN was conjugated with a bifunctional chelate NOTA and then labeled with68Ga.Thein vitrocell uptake andin vivomicroPET imaging of68Ga-RGD-BBN were tested in both MDA-MB-435(GRPR－/integrin αvβ3+)and T47D(GRPR+/integrin αvβ3low expression)breast cancer cells and nude mouse models,respectively.68Ga-NOTA-RGD and68Ga-NOTA-BBN counterparts were also synthesized and compared.It is shown that68Ga-RGD-BBN could sensitively detect the breast cancers with either or both high expression of integrin αvβ3and GRPR,and the dual-targeted probe possessed higher tumor uptake than the corresponding monomeric counterparts.68Ga-NOTA-RGD-BBN is a promising agent for PET imaging of both GRPR+/(integrin αvβ3low expression)and GRPR－/integrin αvβ3+cancers.

RGD-BBN;Integrin αvβ3;GRPR;Breast cancer;MicroPET imaging

2010-11-15；接受日期：2011-01-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81028009，81000625，30930030，30900373和30870728)

劉昭飛，電話：(010)82802871，E-mail：liuzf@bjmu.edu.cn

R817

10.3724/SP.J.1260.2011.00335