分子影像監(jiān)測血管內(nèi)皮細胞生長因子預處理促進體外和體內(nèi)脂肪間充質(zhì)干細胞存活與增殖的研究

范偉偉, 王亞斌, 張榮慶, 李聰葉, 李 霜, 曹 豐

第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心血管內(nèi)科，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院分子影像研究中心，西安 710032

分子影像監(jiān)測血管內(nèi)皮細胞生長因子預處理促進體外和體內(nèi)脂肪間充質(zhì)干細胞存活與增殖的研究

范偉偉, 王亞斌, 張榮慶, 李聰葉, 李 霜, 曹 豐

第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心血管內(nèi)科，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院分子影像研究中心，西安 710032

干細胞療法為缺血性心血管病的組織再生帶來希望，然而體內(nèi)移植后干細胞的不良轉(zhuǎn)歸嚴重制約了其治療效果。研究表明，血管內(nèi)皮細胞生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）或可對干細胞產(chǎn)生保護作用；同時，分子影像可作為干細胞研究的有力手段，實現(xiàn)體內(nèi)外干細胞生物學過程的可視化與實時定量監(jiān)測。該研究首先培養(yǎng)了穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶報告基因的脂肪間充質(zhì)干細胞，然后運用報告基因光學成像等分子影像學方法，對體外及體內(nèi)移植后脂肪間充質(zhì)干細胞的存活與增殖進行示蹤和定量分析，并觀察VEGF預處理對細胞活性的影響。光學成像和定量分析結(jié)果提示，VEGF可以顯著改善體外缺氧損傷后脂肪間充質(zhì)干細胞的生存與增殖，并延長其體內(nèi)移植后的生存時間。由此證實，分子影像可以對間充質(zhì)干細胞的體外與體內(nèi)生物學過程進行無創(chuàng)、直觀、高通量監(jiān)測，并能有效評價保護性因子VEGF對細胞的作用。

分子影像；間充質(zhì)干細胞；血管內(nèi)皮細胞生長因子

引 言

根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO)2008年的預測，在未來20年內(nèi)，缺血性心臟病的死亡率仍將高居全球各類疾病的首位[1]。由于心肌細胞為不可再生的終末分化細胞，因此常規(guī)的手術(shù)及藥物等治療方法仍不能從根本上逆轉(zhuǎn)缺血導致的心肌組織損傷和進行性功能減退。近年來，干細胞因具有自我更新和多向分化等特性，為缺血性心臟病的再生治療帶來了新的希望[2,3]。研究顯示，將胚胎干細胞[4](embryonic stem cells，ESCs)或成體干細胞[5](adult stem cells，ASCs)移植入梗死心肌可改善心室重構(gòu)和心臟功能，然而其移植后的轉(zhuǎn)歸、確切療效和作用機制仍待進一步闡明[4,5]。我們前期的研究顯示，與ESCs相比，ASCs，尤其是間充質(zhì)干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)，心肌內(nèi)移植后的存活數(shù)量較少，難以發(fā)揮長時程治療作用[2,6,7]。因此，尋找MSCs體外及在體準確、無創(chuàng)、高效和長程的監(jiān)測手段，同時探索有益于MSCs在缺血組織部位的存活、整合、增殖或分化的有利因素，是進一步研究和促進MSCs有效治療作用的關(guān)鍵。

新興的分子影像學 (molecular imaging)可以實現(xiàn)干細胞生物學狀態(tài)和過程的實時、直觀、動態(tài)、定量、可重復及特異性成像[8]，為干細胞的生物學研究提供了有力平臺。此外，研究證實，血管內(nèi)皮細胞生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)作為血管內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂原，能促進血管新生和心功能的恢復[9]，并可能對干細胞具有保護作用[10]。在之前的研究中，我們運用分子影像方法已證實VEGF可以改善移植胚胎干細胞的存活與增殖[10]。

因此，以前期的分子影像研究為基礎(chǔ)，本實驗采用生物自發(fā)光成像 (bioluminescence imaging）等多種評價方法，對穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶 (firefly luciferase，fluc)報告基因的脂肪源性間充質(zhì)干細胞 (adipose-derived MSCs，ADMSCs)進行監(jiān)測與示蹤，以實時、定量地評價體外缺氧/復氧 (hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷及體內(nèi)移植后，VEGF預處理對MSCs的生物學活性所產(chǎn)生的影響，旨在為MSCs療效評估提供無創(chuàng)影像學手段。

材料和方法

材料

實驗動物為：1)SPF級β-actin-luc轉(zhuǎn)基因FVB/N小鼠20只 (8～10周齡)，購自美國Caliper公司；2)8周齡的雄性BALB/c裸鼠20只 (體質(zhì)量20～25 g)，購自上海實驗動物中心，以上動物均飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)等購自美國Thermo Hyclone公司；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸 (EDTA)、二甲亞砜 (DMSO)、青/鏈霉素等均購自美國Sigma公司；VEGF、堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)購自美國PeprotechAsia公司；熒光兔抗鼠單克隆抗體CD44-PE、CD90-APC、CD34-PE、CD45-PE及同種型IgG購自美國eBioscience公司；小動物分子成像系統(tǒng) (Xenogen IVIS Kinetic)及LivingImage 3.2軟件購自美國Caliper公司；D-luciferin購自美國Biotium公司；倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，三氣孵箱購自美國Thermo公司，流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

方法

ADMSCs的分離培養(yǎng)和表型鑒定

基于Zuk等[11]提出的方法并稍作修改。β-actin-luc小鼠脫頸處死，無菌分離腹腔脂肪組織，剪碎加入0.2% Ⅰ型膠原酶，輕微振搖下在37℃水浴消化1 h。等體積含有DMEM/F12和10%FBS的完全培養(yǎng)基終止消化，細胞懸液室溫下200×g離心10 min，重懸后在細胞擴增培養(yǎng)基 (完全培養(yǎng)基中加入5 ng/mL bFGF，青/鏈霉素各100 U/mL)中，以37℃、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)12 h，去除未貼壁細胞，貼壁細胞消化后，以2×104/cm2密度接種。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。細胞生長至占瓶底80%時，采用0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化傳代。

取第3代ADMSCs，PBS重懸計數(shù)后，將細胞濃度調(diào)整為1.0×106/mL，根據(jù)既往研究[11]，分別加入熒光素標記的兔抗鼠單克隆抗體CD44-PE、CD90-APC、CD34-PE和CD45-PE，4℃反應(yīng)30 min，設(shè)立同種型非特異性IgG為陰性對照，PBS洗滌后用流式細胞儀進行檢測。

ADMSCs生物自發(fā)光強度檢測

收集第3代ADMSCs。取96孔板1塊，每組6個孔，分別加入0.5×104、1.0×104、2.0×104、4.0×104、6.0×104、8.0×104、10.0×104數(shù)量的細胞，設(shè) 3 個復孔。然后每孔以150 ng/μL的濃度加入報告探針底物螢光素 (D-luciferin)，在IVIS中檢測生物發(fā)光情況，電荷耦合元件 (CCD)曝光時間為3 min，像素合并 (Binning)為4，光圈大小 (F/stop)為1，圖像分析采用LivingImage3.2軟件，采用fluc平均輻射度定量，單位為光子/秒·厘米2·單位角 (Photons·sec－1·cm－2·steradian－1，P/s·cm2·sr)。PBS 中加入 D-luciferin 作為空白對照。

H/R損傷模型的建立及VEGF分組處理

H/R損傷模型采用第3代ADMSCs，以2.0×104個細胞/孔密度接種于96孔板中，待貼壁后換用無血清DMEM/F12，置于氣體濃度為940 ml/L N2、50 ml/L CO2及10 ml/L O2的密閉缺氧孵箱中，于37℃持續(xù)缺氧6 h。PBS洗滌后加入ADMSCs完全培養(yǎng)基，放回氣體濃度為95%空氣及5%CO2的正常孵箱中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，完成H/R損傷。

ADMSCs根據(jù)是否進行VEGF干預和H/R損傷，分為正常對照組、單純VEGF干預組、單純H/R模型組和H/R模型+VEGF干預組。對照組于實驗前換用含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，按正常條件培養(yǎng)；H/R模型按上述方法。將培養(yǎng)至第3代的ADMSCs以每塊10個孔、每孔2×104個細胞的密度接種于4塊96孔培養(yǎng)板。當細胞生長至鋪滿孔底的70%后，每孔分別以0～10 ng/mL濃度加入VEGF，預處理ADMSCs 48 h，備用。

ADMSCs的體外生物自發(fā)光成像和細胞存活率MTT法檢測

取上述2塊96孔板，1塊板繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) (即單純VEGF干預組)，1塊板進行H/R處理。H/R組復氧結(jié)束后，每孔以150 ng/μL的濃度加入D-luciferin，在IVIS中檢測生物發(fā)光情況，并根據(jù)VEGF濃度梯度和光學信號強度的關(guān)系繪制量效曲線，成像參數(shù)設(shè)定同上。PBS中加入D-luciferin作為空白對照。

生物自發(fā)光成像的同時另取上述2塊96孔板，同樣分別進行常規(guī)培養(yǎng)和H/R處理。復氧結(jié)束后，向2塊板每孔加入四唑鹽溶液 (MTT，5 μg/μL)10 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)并吸除培養(yǎng)液后，每孔加入150 μl DMSO振蕩10 min至紫色結(jié)晶完全溶解。正常培養(yǎng)無VEGF干預的ADMSCs作為對照，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值 (A值)。每組均設(shè)3個復孔，取平均值計算細胞存活率 (%)，即 (處理孔A值／對照孔A值)×100%。

ADMSCs裸鼠后肢肌肉內(nèi)移植和體內(nèi)生物自發(fā)光成像

收集2.0×107數(shù)量的第3代ADMSCs，等分為20份，每份 (含1.0×106個ADMSCs)均重懸于40 μl無菌PBS中，置于EP管內(nèi)。BALB/c裸鼠 (n=20)隨機分為MSCs組和MSCs+VEGF組。動物麻醉后常規(guī)皮膚消毒，MSCs組將40 μl細胞懸液謹慎注入裸鼠腓腸肌內(nèi)，MSCs+VEGF組在40 μl細胞懸液中以10.0 ng/mL加入VEGF。細胞移植12 h后，裸鼠腹腔內(nèi)以150 mg/kg濃度注射D-luciferin，10 min后，在IVIS中進行生物發(fā)光成像。從移植后0天起，采用生物發(fā)光成像連續(xù)動態(tài)觀察ADMSCs在體內(nèi)的存活與增殖情況，監(jiān)測至移植后第21天。成像參數(shù)設(shè)定同上。

統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以 x±s表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用One-way ANOVA，組內(nèi)比較采用Dunnet-t檢驗，顯著性水準為α=0.05。

實驗結(jié)果

ADMSCs的形態(tài)特征、表面標志和生物自發(fā)光強度

原代ADMSCs在接種12 h后，倒置顯微鏡下可見少數(shù)集落生長的貼壁細胞，24～48 h后，細胞逐漸融合成單層簇狀分布。傳代后細胞呈梭形，核居中。平均擴增時間約為48 h。

圖1 體外ADMSCs的fluc報告基因光學成像和表面標志 (A)生物自發(fā)光成像顯示不同數(shù)量的ADMSCs穩(wěn)定表達報告基因fluc；(B)流式細胞學分析證實，以同種型IgG作為陰性對照 (紅色)，體外培養(yǎng)的ADMSCs高表達MSCs的表面標志CD90和CD44(綠色)；(C)定量分析顯示ADMSCs細胞數(shù)與fluc平均輻射度的直線相關(guān)關(guān)系Fig.1 Bioluminescence imaging and markers of ADMSCsin vitro (A)ADMSCs by diverse numbers stably carried the reporter gene by bioluminescence imaging; (B) Flow cytometry identified that ADMSCs highly expressed the CD90 and CD44(green)as the markers of MSCs,compare to negative isotype IgG control(red);(C)Quantitative analysis showed a linear correlation existed between cell number and fluc average radiance

報告基因光學成像結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的ADMSCs穩(wěn)定表達β-actin-luc(圖1A)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，所分離細胞的CD44、CD90陽性率分別為89.7%和99.0%，而CD34、CD45陽性率均小于3%，表明分離培養(yǎng)的ADMSCs高表達MSCs表面標志 (圖1B)。定量分析表明，D-luciferin滴入后，即刻ADMSCs的fluc總輻射通量范圍是2.78×105至1.99×106(P/s)，CCD曝光時間為3 min；調(diào)整感興趣區(qū)域 (region of interest，ROI)面積為π×0.822cm2時，計算出0.5×104至 10.0×104細胞數(shù)的ADMSCs的 fluc平均輻射度，從1.20×105±1.22×104至 1.10×106±4.21×105(P/s·cm2·sr) 逐漸增強，與對照組 (1.26×104±1.10×103P/s·cm2·sr)相比具有統(tǒng)計學差異 (P＜0.01)。相關(guān)分析顯示，ADMSCs細胞數(shù)與fluc平均輻射度呈正直線相關(guān) (相關(guān)系數(shù)r2=0.94，方程為y=9.203x+76881)(圖1C)。

VEGF預處理對H/R損傷后ADMSCs生物發(fā)光成像的影響

生物發(fā)光成像結(jié)果顯示，在單純VEGF干預組，1.0～10.0 ng/mL濃度的VEGF對正常培養(yǎng)條件下ADMSCs的fluc生物發(fā)光信號強度的影響無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)(圖2A，B)。

圖2 生物發(fā)光成像評價VEGF對正常培養(yǎng)ADMSCs的影響 VEGF(濃度為1.0～10.0 ng/mL)對正常培養(yǎng)條件下ADMSCs生物發(fā)光信號強度的影響Fig.2 Bioluminescence imaging of ADMSCs by VEGF pretreatment The images (A)and the chart(B)indicate that there is no effect of VEGF(1.0～10.0 ng/mL)on ADMSCs'bioluminescence signalintensity under common culture condition

H/R損傷后，無VEGF干預的ADMSCs(單純H/R模型組)，其fluc平均輻射度下降為6.18×104±4.23×103P/s·cm2·sr，與正常培養(yǎng)條件下的 ADMSCs(3.62×105±1.13×104P/s·cm2·sr)相比，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)；對于4.0～10.0 ng/mL VEGF預處理的ADMSCs，其H/R損傷后fluc平均輻射度較單純H/R模型組增強，為1.44×105±1.77×104至2.01×105±1.00×104(P/s·cm2·sr)，具有統(tǒng)計學顯著性 (P＜0.05)；而 1.0～3.0(ng/mL)VEGF 濃度組，ADMSCs的fluc平均輻射度與單純H/R組相比無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。結(jié)果表明，4.0～10.0(ng/mL)VEGF預處理可提高細胞H/R損傷后的生物發(fā)光信號強度 (圖3A，B)。量效曲線分析顯示，不同的VEGF預處理濃度 (1.0～10.0 ng/mL)，與H/R損傷后ADMSCs的光學信號強度成一定的正相關(guān)關(guān)系，其效應(yīng)具有一定的遞增趨勢 (r2=0.82，方程為y=13475x+65547)；然而，VEGF 4.0～10.0 ng/mL濃度梯度組之間無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)(圖3C)。以上CCD曝光時間均為3 min。

圖3 生物發(fā)光成像評價VEGF對H/R損傷后ADMSCs存活與增殖的影響 生物發(fā)光成像(A)、定量分析(B)和量效曲線(C)，提示VEGF(4.0～10.0 ng/mL)可促進H/R損傷后ADMSCs的存活與增殖Fig.3 Bioluminescenceimaging of ADMSCsby VEGF pretreatment with H/R injury The images(A),chart(B)and dose-respose curve(C)indicate the effect of VEGF(1.0～10.0 ng/mL)on bioluminescence signal intensity of ADMSCs after H/R injury.The fluc average radiance of ADMSCs has a significant decrease after H/R injury,and VEGF(4.0～10.0 ng/mL)can promote the bioluminescence signal of ADMSCs

VEGF對H/R損傷后ADMSCs生存活力的影響

ADMSCs的MTT顯色深淺隨孔板中活細胞數(shù)增加而逐漸加深，其A值亦隨之升高。取A值均數(shù)計算細胞存活率，結(jié)果顯示，對于正常培養(yǎng)條件下的ADMSCs，不同濃度的VEGF對其生存率的影響與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)，且無量效關(guān)系(r2=0.095)；然而，對于H/R損傷后的ADMSCs，5.0 ng/mL 〔(41±6.9)%〕～10.0 ng/mL 〔(55±4.4)%〕濃度的VEGF預處理可提高其生存率，與單純H/R損傷模型組 〔(28±3.7)%〕相比具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，而1.0 ng/mL 〔(33±5.4)%〕～4.0 ng/mL 〔(29±2.7)%〕VEGF濃度組與單純H/R組相比則無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。5.0～10.0 ng/mL VEGF濃度組之間對細胞活力的影響有增強的趨勢，但無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)，VEGF的量效呈弱直線相關(guān)關(guān)系(r2=0.78)(圖 4)。ADMSCs體內(nèi)移植后存活與增殖情況的分子影像監(jiān)測

生物自發(fā)光成像顯示，ADMSCs移植入裸鼠腓腸肌后，其體內(nèi)光學信號隨時間的延長逐漸減弱 (圖5A)；MSCs組和MSCs+VEGF組ADMSCs移植后即刻，其fluc平均輻射度分別為 2.92×106±1.75×105和 2.95×106±1.31×105(P/s·cm2·sr)(P＞0.05)；而在移植后 7～21 天，MSCs+VEGF組ADMSCs的信號強度顯著高于MSCs組，第7天分別為2.54×106±9.64×104和 1.85×106±8.95×104(P/s·cm2·sr)(P＜0.05)，至第 21 天分別為 4.14×105±5.34×104和 1.15×105±4.26×104(P/s·cm2·sr)(P＜0.05)(圖 5B)。結(jié)果提示 10.0 ng/mL VEGF 可促進 ADMSCs體內(nèi)的增殖和存活，并延長ADMSCs移植后的生存時間。

圖5 ADMSCs體內(nèi)移植后生物發(fā)光成像示蹤與定量 生物自發(fā)光成像和定量分析顯示，ADMSCs體內(nèi)移植后，其光學信號強度隨時間延長而逐漸減弱，而10.0 ng/mL VEGF預處理可促進ADMSCs的體內(nèi)存活與增殖，并延長ADMSCs移植后的生存時間Fig.5 In vivo visualization and quantification of implanted ADMSCs by bioluminescence imaging Bioluminescence imaging(A) and quantitative analysis(B)show that the fluc average radiance of ADMSCs has a time-dependent and gradual decrease after transplantation, while VEGF(10.0 ng/mL)pretreatment can enhance the ADMSCs'survival and proliferation in vivo

討 論

干細胞通過組織新生和旁分泌等作用促進受損心肌組織再生，逐漸成為缺血性心臟病治療的新選擇[13]。干細胞的種類多樣，其中骨髓來源的MSC(BMMSC)被證實可以提高心臟功能[14]，但受到其不易獲取、增殖能力較低等因素的局限。Zuk等[15]的研究表明，脂肪來源的MSC具有較強的增殖與分化潛能，或可作為再生醫(yī)學較好的細胞來源。因此，實驗選取ADMSC作為目標細胞進行研究。

然而，在缺血心肌組織中，MSCs能否在相對缺氧的移植區(qū)域中生存，移植后細胞的生物學活性和增殖能力如何等，仍是MSCs治療面臨的巨大挑戰(zhàn)。對于研究者，最為關(guān)鍵的是尋找一種準確、無創(chuàng)的監(jiān)測手段，對干細胞及其生物學狀態(tài)進行示蹤與評估。

分子影像學技術(shù)可以在活體細胞和分子水平對干細胞的生物過程進行成像和定量研究，對干細胞的高效、長時程監(jiān)測具有獨特的優(yōu)勢[8,16]。在以往的實驗中，我們運用分子影像學方法評價了攜帶多重報告基因人源ESCs的體外及體內(nèi)轉(zhuǎn)歸[16]。我們前期的分子影像研究還證實，BMMSCs心肌內(nèi)移植后，由于存活數(shù)量等因素，導致其長期、有效的治療作用嚴重受限[6]。本研究中，我們選取穩(wěn)定攜帶報告基因β-actin-luc小鼠的脂肪組織為來源，在體外培養(yǎng)ADMSCs；通過生物自發(fā)光成像、細胞表面標志流式細胞學鑒定及定量分析，證實該細胞具備MSCs的形態(tài)學與表型特點，能穩(wěn)定表達報告基因fluc，可以實現(xiàn)體外和體內(nèi)生物學過程的分子影像實時定量監(jiān)測。

同時，針對MSCs移植后的不良轉(zhuǎn)歸，我們選擇VEGF作為可能的保護因子進行研究。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強效促血管生成因子，具有促進缺血組織血管形成和抗缺血組織凋亡的功能，并能促進MSCs的血管新生作用[17]。我們前期的分子影像學研究也證實，誘導型表達VEGF165，可以提高移植小鼠ESCs的心臟功能與存活率[10]。

鑒于生物自發(fā)光信號可以直觀準確地反映細胞的生物學活性，因此，研究建立在以報告基因光學成像為主要監(jiān)測手段的干細胞影像學平臺上。首先通過建立H/R模型在體外模擬缺血再灌注損傷，觀察了H/R環(huán)境下ADMSCs的生物學活性變化以及VEGF預處理對細胞的保護作用。體外生物發(fā)光成像結(jié)果表明：VEGF對常氧條件下生長的ADMSCs活性無顯著影響；H/R損傷后，ADMSCs的生物學活性顯著下降，而一定濃度的VEGF（4～10.0 ng/mL）可以明顯提高H/R后ADMSCs的生存與增殖。這一結(jié)果也被MTT試驗證實。我們還運用生物發(fā)光示蹤進一步定量監(jiān)測了ADMSCs體內(nèi)移植后的轉(zhuǎn)歸及VEGF對移植細胞的作用。結(jié)果顯示，VEGF能夠改善移植細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸，并延長細胞在移植組織中的存活時間。

本研究以分子影像為主要監(jiān)測手段，實現(xiàn)了體內(nèi)MSCs的無創(chuàng)可視化，并以此為基礎(chǔ)證實了VEGF可能是干細胞移植后存活的保護性因子。研究初步建立的可視化方法為有效評價體內(nèi)干細胞移植的長期獲益、安全性及作用機制，改善干細胞的移植后轉(zhuǎn)歸，最終實現(xiàn)干細胞治療缺血性心臟病的臨床轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了有利條件。

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Molecular Imaging for Monitoring Survival and Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cellsin vitroandin vivoafter Pretreatment with VEGF

FAN Weiwei,WANG Yabin,ZHANG Rongqing,LI Congye,LI Shuang,CAO Feng
Department of Cardiology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University；
Molecular Imaging Center,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

This work was supported by grants from The National Natural Sciences Foundation of China(81090274,30970845)and Xijing Research Boosting Program on Stem Cell Research(XJZT08Z04)

Oct 20,2010 Accepted:Jan 17,2011

CAO Feng,Tel:+86(29)84771024,E-mail:wind8828@gmail.com

Although stem cell therapy holds promise for the regenerative treatment of ischemic heart disease,the tragic fate of engrafted stem cells is still a hurdle for the therapeutic effect.Previous studies showed that molecular imaging could be a realtime and quantitative effective approach to visualize and monitor stem cells,while vasoactive factors such as vascular endothelial growth factor(VEGF)may have protective effect on the stem cell.In this study,adipose tissue derived mesenchymal stem cells(ADMSCs),which stably expressed firefly luciferase gene,were cultured at the first step.Then bioluminescence imaging and other methods were used to visualize and quantify the ADMSCs'survival and proliferation,and confirmed whether VEGF pretreatment could affect the cells'viability.The results from bioluminescence imaging and quantitative analysis implied that VEGF pretreatment significantly enhanced the survival and proliferation of ADMSCs after hypoxia/reoxygenation injuryin vitro,and prolonged ADMSCs'lifetimein vivo.Eventually,it concluded that reporter genemolecular imaging could beadirect,efficient and noninvasive strategy for monitoring the MSCs'biological processin vitroandin vivo,while it could well evaluate the effect of protective factors,such as VEGF,on MSCs with high efficacy.

Molecular imaging;Mesenchymal stem cells;VEGF

2010-10-20；接受日期：2011-01-07

國家自然科學基金項目(81090274，30970845)；西京醫(yī)院助推計劃重大項目(XJZT08Z04)

曹豐，電話：(029)84771024，E-mail：wind8828@gmail.com

Q421

10.3724/SP.J.1260.2011.00345