多模態(tài)分子影像對肝癌進(jìn)展和血管生成的研究

馬喜波, 田 捷, 楊 鑫, 秦承虎, 朱守平, 薛貞文

中國科學(xué)院自動化研究所醫(yī)學(xué)圖像處理研究組，北京 100190

多模態(tài)分子影像對肝癌進(jìn)展和血管生成的研究

馬喜波, 田 捷, 楊 鑫, 秦承虎, 朱守平, 薛貞文

中國科學(xué)院自動化研究所醫(yī)學(xué)圖像處理研究組，北京 100190

通過對HCCLM3-fLuc-GFP肝癌的進(jìn)展和血管生成的多模態(tài)成像分析，對肝癌細(xì)胞在體內(nèi)生長的適應(yīng)過程和級數(shù)生長特性，分別進(jìn)行了生物自發(fā)熒光成像 (bioluminescent imaging，BLI)研究、激發(fā)熒光成像(fluorescent imaging,FMI)研究和小動物計算機斷層成像 (micro-computed tomography，Micro-CT)研究，對采集的成像數(shù)據(jù)進(jìn)行定性定量分析，并與腫瘤的體積測量數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞在接種后第4天細(xì)胞數(shù)量基本為原接種數(shù)量的一半，第7天體內(nèi)的細(xì)胞基本與接種數(shù)量相等，7天內(nèi)細(xì)胞基本完成了體內(nèi)的適應(yīng)過程，之后肝癌細(xì)胞進(jìn)入了快速增殖期。BLI成像、FMI成像均與腫瘤體積的測量結(jié)果高度相關(guān) (R2=0.9263，R2=0.9068)。通過計算機斷層成像 (Micro-CT)，對腫瘤的新生血管進(jìn)行分析，并用可視化的手段對腫瘤的血管新生特性進(jìn)行三維顯示，Micro-CT成像結(jié)果驗證了BLI、FMI成像揭示的腫瘤生長后期的非指數(shù)生長特性。

生物自發(fā)熒光成像；激發(fā)熒光成像；計算機斷層成像；肝癌進(jìn)展；血管生成

引 言

肝癌是威脅人類生命的一種重要癌癥，其死亡率歷年都居高不下[1～3]。HCCLM3是近年來發(fā)現(xiàn)的一種肝癌亞型，主要見于亞洲人群，在歐美國家極少，對其發(fā)病機理和抗癌療效的研究報道極少[4～6]，因此對HCCLM3的分子影像研究尤為重要。目前主要利用傳統(tǒng)的生物學(xué)手段，如采用測量腫瘤體積的方法研究肝癌進(jìn)展。由于在腫瘤接種的早期，腫瘤細(xì)胞對體內(nèi)環(huán)境有一個適應(yīng)的過程，在此過程中還未形成瘤塊，這是傳統(tǒng)方法無法測量的；后期，在腫瘤體積較大時，腫瘤內(nèi)部由于營養(yǎng)供應(yīng)不全出現(xiàn)局部壞死[7]，導(dǎo)致測量腫瘤體積的方法不能真實、完全地反應(yīng)腫瘤的生長進(jìn)展。目前，血管生成研究主要采用病理切片的方法，實驗鼠的處死給后續(xù)的連續(xù)觀測造成極大的困難，血管生成研究也無法做到整體性。分子影像方法通過使用造影劑 Fenestra VC[8,9]，可以在體地對腫瘤周圍的新生血管成像并進(jìn)行直觀的三維顯示。

分子影像學(xué) (molecular imaging)是美國哈佛大學(xué)Weissleder等人于1999年提出的概念，是指應(yīng)用影像學(xué)方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的定性及定量研究[10,11]。它是以體內(nèi)特定分子作為成像對比度的醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，能在真實、完整的動物或人體內(nèi)，通過圖像直接顯示細(xì)胞或分子水平的生理和病理過程。分子影像學(xué)融合了分子生物化學(xué)、數(shù)據(jù)處理、納米技術(shù)、圖像處理等技術(shù)，具有高特異性、高靈敏度和超高圖像分辨率的特性，可以為臨床診斷提供定性、定位、定量的資料。

生物自發(fā)熒光成像 (bioluminescent imagin，BLI)以其高靈敏、低成本的特性正在引起生物醫(yī)學(xué)研發(fā)領(lǐng)域的關(guān)注，也已被初步應(yīng)用于腫瘤機理研究和藥物療效評價的相關(guān)領(lǐng)域中[12～15]。激發(fā)熒光成像 (fluorescent imagin，F(xiàn)MI)由于不需要轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建內(nèi)部的熒光探針而有可能應(yīng)用于臨床，但其靈敏度低、自體熒光噪聲高的缺點限制了其在腫瘤早期探測、聯(lián)合用藥療效評估中的應(yīng)用[16～19]。小動物計算機斷層成像 (micro-computed tomography，Micro-CT)對腫瘤的探測也存在靈敏度低的缺點，但其對腫瘤新生血管的可視化顯示技術(shù)，在新型腫瘤研究初期以及抗腫瘤血管生成藥物的療效評價中，隱藏著巨大的應(yīng)用價值[20,21]。多模態(tài)分子影像技術(shù)可以綜合各個成像模態(tài)的優(yōu)點，從而對腫瘤進(jìn)展和新生血管進(jìn)行定量化研究，為腫瘤機理研究和藥物研發(fā)提供了可靠的在體成像方式[22～24]。

材料與方法

材料

HCCLM3-fLuc-GFP人肝癌細(xì)胞系由上海第二軍醫(yī)大學(xué)趙健老師贈與。D-Luciferin購自海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司，將其配制成15 mg/mL的溶液后，置于－20℃冷凍保存，備用。18F-FDG由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射性同位素中心提供。血管造影劑Fenestra VC購自ART Advanced Research Technologies Inc，直接使用。

細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型的構(gòu)建

HCCLM3-fLuc-GFP人肝癌細(xì)胞系在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于含5%CO2的37℃恒溫箱中孵育。雌性BALB/c裸鼠 (4～5周齡)購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心。所有動物實驗嚴(yán)格按照 “北京大學(xué)動物保護和使用委員會”的規(guī)定執(zhí)行。HCC-LM3-fLuc-GFP荷瘤鼠模型通過對BALB/c裸鼠右腋皮下注射2×106細(xì)胞建立。荷瘤鼠模型建立12 h后開始進(jìn)行成像實驗研究。

生物自發(fā)熒光成像和圖像獲取

所有的生物自發(fā)熒光實驗均使用同一個在體的光學(xué)分子影像系統(tǒng)ZKKS-MI-IV（由中科凱盛醫(yī)療技術(shù)有限公司和中國科學(xué)院自動化研究所分子影像中心共同研制）。成像采用背照式CCD相機，光圈大小通過f-number值來調(diào)節(jié)。通過液氮制冷技術(shù)將相機溫度降至－120℃，并保持穩(wěn)定，CCD的暗電流可降低至0.5 electrons/pixel·hour。為了計算獲得圖像的絕對光強度值，通過一個12英寸的積分球來校準(zhǔn)CCD輸出值的絕對光強度。

成像前，將實驗鼠置于麻醉盒中 (通有2%的異氟烷)5 min，使其麻醉。成像過程中，將實驗鼠置于暗箱的成像平臺上，并通過平臺上輸氣孔中的2%異氟烷來保持實驗鼠的麻醉狀態(tài)。為了更直觀地區(qū)分腫瘤和正常組織并確定腫瘤在荷瘤鼠體的位置，通常將得到的熒光圖像和背景圖像疊加到一起并加偽彩。 圖像采集和處理均使用自行研發(fā)的操作系統(tǒng)WinMI進(jìn)行。

激發(fā)熒光成像和圖像獲取

激發(fā)熒光成像實驗使用的光學(xué)分子影像系統(tǒng)也是ZKKS-MI-IV,成像同樣采用背照式CCD相機。根據(jù)GFP(green fluorescent protein)的波長范圍，成像中采用中心波長為488 nm、波長范圍20 nm的激發(fā)光濾光片，采用中心波長是525 nm、波長范圍為20 nm的接收光濾波片。為了避免激發(fā)光光源對成像的影響，成像平臺由暗箱進(jìn)行屏蔽。

成像過程中，將實驗鼠麻醉后置于成像平臺上。圖像的疊加方法同上，同樣采用我們自行研發(fā)的WinMI系統(tǒng)。

計算機斷層成像、圖像重建和可視化

荷瘤鼠腫瘤新生血管信息的獲得由Micro-CT系統(tǒng)實現(xiàn)。Micro-CT系統(tǒng)硬件主要由射線源、探測器和電控位移系統(tǒng)組成。射線源采用牛津的UltraBright，焦斑尺寸13～40 μm，管電壓10～90 kV，管電流 100～2000 μA，最高輸出功率80 W，并可通過配備的控制箱調(diào)節(jié)電壓、電流和功率。探測器采用日本濱松的C7942CA-02，像素尺寸50 μm，像素數(shù)目2400×2400，有效面積 (120×120)mm2。電控位移系統(tǒng)由平移臺、轉(zhuǎn)臺及控制箱組成。電控平移臺選用北京卓立漢光公司的KSA200-11，其分辨率達(dá)到1.25 μm，電控轉(zhuǎn)臺采用卓立漢光公司的RAK-100，其角度分辨率達(dá)到0.0125°。電控平移臺和轉(zhuǎn)臺采用卓立漢光的控制箱進(jìn)行調(diào)節(jié)。

成像前，將掃描對象固定在轉(zhuǎn)臺上，并使其處于CT的有效視野中，利用自行開發(fā)的CT控制軟件設(shè)置相應(yīng)的掃描參數(shù)，如探測器積分時間、掃描角度間隔、掃描電壓、功率等，CT控制軟件通過控制箱調(diào)節(jié)各設(shè)備至所需狀態(tài)。成像過程中，轉(zhuǎn)臺采用步進(jìn)式前進(jìn)，每旋轉(zhuǎn)一個角度間隔，探測器采樣一次并儲存。掃描結(jié)束后，利用自行開發(fā)的CT重建后處理軟件3DMED(MITK,Medical Image Processing and Analyzing Group,Institute of Automation,Chinese Academy of Sciences,Beijing,China;www.mitk.net)，將掃描得到的一系列投影數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為三維數(shù)據(jù)，通過分割、配準(zhǔn)和可視化，對腫瘤的新生血管進(jìn)行圖像顯示。

體外細(xì)胞自發(fā)熒光成像實驗

為了分析細(xì)胞數(shù)量與熒光強度的關(guān)系，我們采用不同濃度梯度的細(xì)胞進(jìn)行自發(fā)熒光成像。首先，收集足夠的HCCLM3-fLuc-GFP細(xì)胞，按照4倍的稀釋比例將其從1×105、2.5×104依次稀釋至780個細(xì)胞，做3個重復(fù)；然后，將細(xì)胞依次加入黑色的96孔板中，每孔加入50 ml熒光素酶底物D-luciferin(3 mg/mL)，用PBS將每孔的反應(yīng)體系調(diào)至100 ml。

孵育10 min后，用ZKKS-MI-IV系統(tǒng)進(jìn)行熒光圖像采集。CCD的成像參數(shù)設(shè)置如下:f-number=2.8， binning=6， controllergain=3， rate=1 MHz， resolution=16 bits， exposure time=300 s。通過在熒光強度值上減掉相應(yīng)的背景噪聲，我們得到感興趣區(qū)域的灰度值。根據(jù)積分球校準(zhǔn)得到的灰度值和光強度值之間的關(guān)系，可以計算感興趣區(qū)域的熒光強度值，單位為光子數(shù)/秒 (photon/s)。

在體生物自發(fā)熒光成像實驗

自發(fā)熒光成像實驗分別在腫瘤細(xì)胞接種后的第12 h(記為第0 d)和第4、7、10、14、17、21、24、28、31、35、38、41 d進(jìn)行。為了避免食物對熒光圖像采集的影響，成像的12 h前對荷瘤鼠禁食。成像的相機參數(shù)設(shè)置如下：f-number=2.8，binning=4，controller gain=3，rate=1 MHz，resolution=16 bits，readout=low noise，exposure time=30 s。注射底物劑量為100 μl/10g，根據(jù)底物與熒光素酶作用的時間曲線，10～25 min后開始采集熒光圖像。感興趣區(qū)域的選取和熒光強度的計算同體外細(xì)胞實驗，根據(jù)積分球校準(zhǔn)得到的灰度與絕對光強度的關(guān)系，最終得到單位時間內(nèi)的光子數(shù) (photon/s)以衡量熒光強度的大小。

在體激發(fā)熒光成像實驗

激發(fā)熒光成像實驗的采集時間也分別在腫瘤細(xì)胞接種后的第12 h(記為第0 d)和第4、7、10、14、17、21、24、28、31、35、38、41 d進(jìn)行。成像的相機參數(shù)設(shè)置如下，f-number=2.8，binning=1，controller gain=3，rate=1 MHz，resolution=16 bits，readout=low noise,exposure time=2 s.根據(jù)與背景的差異來選取感興趣區(qū)域，同時也以單位時間內(nèi)的光子數(shù) (photon/s)來計數(shù)發(fā)射熒光的強度。

在體Micro-CT腫瘤新生血管成像

腫瘤新生血管圖像采集在腫瘤接種后第39 d進(jìn)行。成像使用的造影劑為Fenestra VC,分別在注射造影劑后第9、18和27 min進(jìn)行3次掃描，每次約9 min。成像參數(shù)設(shè)置如下：X光管電壓=60 kVp，功率=60 W，光源前用0.5 mm厚的鋁板濾除軟X射線，探測器積分時間=0.467 s(內(nèi)觸發(fā))，投影數(shù)據(jù)在B1條件下采集后，由軟件拼合成B2輸出 (即為B1 to B2)，單幀投影圖像大小為1120×1144，像素大小=0.1 mm×0.1 mm。360°范圍內(nèi)采集500個投影數(shù)據(jù)。掃描持續(xù)時間為8.5 min。

腫瘤組織病理分析

HCCLM3-fLuc-GFP荷瘤鼠在接種后第5 w處死，取腫瘤組織，固定后常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。切片依次經(jīng)如下處理：

1)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗：二甲苯 (Ⅰ)5 min→二甲苯 (Ⅱ)5 min→100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min；

2)蘇木素染色5 min，自來水沖洗；

3)鹽酸乙醇分化30 s；

4)自來水浸泡15 min或溫水 (約50°)5 min；

5)伊紅液2 min；

6)常規(guī)脫水、透明、封片：95%乙醇 (Ⅰ)3 min→95%乙醇 (Ⅱ)1 min→100%乙醇(Ⅰ)1 min→100%乙醇 (Ⅱ)1 min→二甲苯石碳酸 (3∶1)1 min→二甲苯 (Ⅰ)1 min→二甲苯 (Ⅱ)1 min→中性樹脂封固。

經(jīng)上述處理后，將病理學(xué)切片用光學(xué)顯微鏡觀察，用Leica DFC300 FX病理圖像分析系統(tǒng)分析、采集圖像。數(shù)據(jù)分析

定量數(shù)據(jù)通過加和取平均的方法獲得，并以標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式來表示。平均值采用單因素方差分析法 (one-way analysis of variance，ANOVA)和t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析對比，當(dāng)P＜0.05時可認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果與討論

體外自發(fā)熒光成像

通過體外培養(yǎng)HCCLM3-fLuc-GFP和HCCLM3細(xì)胞，進(jìn)而對其增殖性、成瘤性、轉(zhuǎn)移性進(jìn)行對比研究，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的不同。由于螢火蟲熒光素酶基因 (fLuc)和綠色熒光蛋白基因 (GFP)構(gòu)建在同一個載體上，并共用同一個啟動子，所以通過研究螢火蟲熒光素酶報告基因的表達(dá)水平與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，即可得知GFP與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系。通過對不同數(shù)量的HCCLM3-fLuc-GFP細(xì)胞的BLI圖像采集和光子計算，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量和fLuc的表達(dá)呈現(xiàn)穩(wěn)定的線性相關(guān)性 (R2=0.9987,見圖1)。

圖1 (A)不同細(xì)胞數(shù)量的生物自發(fā)熒光圖像，細(xì)胞數(shù)量由高到低對應(yīng)著熒光強度由強到弱；(B)HCCLM3-fLuc-GFP的細(xì)胞數(shù)量與熒光信號強度的線性相關(guān)性。線性回歸分析表明，細(xì)胞數(shù)量與熒光信號強度呈現(xiàn)高度相關(guān)性 (R2=0.9987，P＜0.0001)[14]Fig.1 (A)A diluted series of HCCLM3-fLuc-GFP cells was visualized by bioluminescent imaging.A higher number of cells showed more intense bioluminescent signal;(B)Correlation between the bioluminescent signals of HCCLM3-fLuc-GFP cells and cell number. Linear regression analysis indicated high correlation between the bioluminescent signals and the cell number(R2=0.9987,P＜0.0001)[14]

在體自發(fā)熒光、激發(fā)熒光和病理分析結(jié)果對腫瘤進(jìn)展的觀測

圖2 HCCLM3-fLuc-GFP荷瘤鼠接種后不同時間的自發(fā)熒光圖像[14]Fig.2 Serial bioluminescence images of the HCC-LM3-fLuc-GFP tumor-bearing nude mice after tumor inoculation[14]

圖3 HCCLM3-fLuc-GFP荷瘤鼠接種后不同時間的激發(fā)熒光圖像Fig.3 Serial fluorescence images of the HCC-LM3-fLuc-GFP tumor-bearing nude mice after tumor inoculation

為了監(jiān)測HCCLM3-fLUC-GFP腫瘤的進(jìn)展，組內(nèi)7只裸鼠在接種后12 h即開始進(jìn)行BLI和FMI圖像數(shù)據(jù)采集。在接種后1 w內(nèi)，腫瘤細(xì)胞生長呈現(xiàn)先衰減后生長的趨勢，接種后的前4 d是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境的過程，后3 d才開始出現(xiàn)增長。約1 w后，腫瘤熒光達(dá)到接種當(dāng)天的強度 (見圖2，圖3)，之后便呈現(xiàn)級數(shù)生長的趨勢。定量的生物熒光強度和激發(fā)熒光強度分析結(jié)果也驗證了這一結(jié)論 (見圖4A，B)。在腫瘤生長的前3 w，荷瘤鼠體重隨之逐漸生長，裸鼠活躍，腫瘤對其影響較??；隨著腫瘤體積的增大，荷瘤鼠體重反而減少且活動不便，反映了腫瘤體積增大對裸鼠心、肝、肺等臟器的壓迫及競爭抑制作用(見圖4C)。通過對腫瘤體積、腫瘤生物熒光定量計算結(jié)果和腫瘤激發(fā)熒光定量計算結(jié)果的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤體積和腫瘤生物熒光強度呈較高的相關(guān)性 (R2=0.9263，見圖4D)，腫瘤體積和腫瘤激發(fā)熒光強度的相關(guān)性略低于前者 (R2=0.9068，見圖4E)，分析結(jié)果顯示腫瘤生物熒光強度和激發(fā)熒光強度呈現(xiàn)高度相關(guān)性 (R2=0.9961，見圖4F)。腫瘤在生長到一定的體積后，由于內(nèi)部供養(yǎng)不足，可能呈現(xiàn)局部壞死，接種后第5 w的病理分析見圖5，由圖可見，結(jié)締組織將瘤體分為多個小的腫瘤灶，每一腫瘤病灶中央壞死。腫瘤病灶的中央壞死將導(dǎo)致腫瘤體積測量大小跟熒光強度的采集出現(xiàn)不一致的結(jié)果，而腫瘤生物熒光的強度和激發(fā)熒光的強度均反映了腫瘤內(nèi)活細(xì)胞的數(shù)量，故兩者呈現(xiàn)高度相關(guān)性。

圖4 (A)接種后HCC-LM3-fLuc-GFP腫瘤的定量自發(fā)熒光強度值；(B)接種后HCC-LM3-fLuc-GFP腫瘤的定量激發(fā)熒光強度值；(C)接種后不同時間的裸鼠體重變化；(D)HCC-LM3-fLuc-GFP腫瘤大小與自發(fā)熒光強度的線性相關(guān)性；(E)HCC-LM3-fLuc-GFP腫瘤大小與激發(fā)熒光強度的線性相關(guān)性；(F)測量的HCC-LM3-fLuc-GFP腫瘤自發(fā)熒光強度與激發(fā)熒光強度的相關(guān)性。x±s，n=7Fig.4 (A)The quantified bioluminescent intensity of the HCC-LM3-fLuc-GFP tumors in the nude mice;(B)The quantified fluorescent intensity of the HCC-LM3-fLuc-GFP tumors in the nude mice;(C)HCC-LM3-fLuc-GFP tumor sizes of the nude mice at different time after inoculation;(D)Correlation between tumor bioluminescent signals measured by in vivo bioluminescence imaging and tumor sizes measured by caliper;(E)Correlation between tumor fluorescent signals measured by in vivo fluorescent imaging and tumor sizes measured by caliper; (F) Correlation between tumor bioluminescent signals measured by in vivo bioluminescence imaging and tumor fluorescent signals measured by in vivo fluorescent imaging.x±s,n=7

圖5 HCCLM3-fLuc-GFP 荷瘤鼠接種后第5 w的腫瘤病理觀測結(jié)果Fig.5 The pathologicalresults oftumorat5thweek afterHCCLM3-fLuc-GFP cells inoculation

由圖2和圖3可以看出，BLI成像的靈敏度明顯高于FMI的成像靈敏度，在腫瘤接種早期，生物熒光能夠精確地反映腫瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)，而激發(fā)熒光的顯像結(jié)果在前3次測量中沒有明顯不同，且腫瘤發(fā)射熒光強度與自體熒光強度沒有明顯區(qū)分。由此可見，BLI成像對腫瘤的早期探測以及抗腫瘤藥物的療效評估將是一個有效的工具和手段。

在體Micro-CT對腫瘤新生血管的觀測

20世紀(jì)70年代初期，F(xiàn)orkman[25,26]即提出：腫瘤的生長需要豐富的血液供應(yīng)，腫瘤的生長是血管生成依賴的。對腫瘤新生血管研究的傳統(tǒng)手段局限于病理染色及切片在顯微鏡下的觀察[27,28]，這一方法必須處死裸鼠取出腫瘤進(jìn)行觀測，從而無法對腫瘤新生血管進(jìn)行連續(xù)的后續(xù)觀測，且無法對其進(jìn)行整體的研究分析。同時，傳統(tǒng)的病理觀測手段也非常耗時，無法就新生血管與荷瘤鼠自身血管間的聯(lián)系進(jìn)行觀測研究。Micro-CT系統(tǒng)通過對腫瘤的新生血管進(jìn)行三維X射線掃描，并對整體血管進(jìn)行三維立體化顯示，從而可以直觀地解釋腫瘤生長速度與腫瘤新生血管的依賴關(guān)系 (見圖6)。Fenestra VC造影劑通過尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)后，在約10～30 min內(nèi)，造影劑基本還處于血液循環(huán)中，所以，其對血管的造影效果基本一致。由Micro-CT的斷層圖像可以清晰地看到心臟、肝臟中的大血管和腫瘤中的新生血管 (見圖6箭頭所示的白色區(qū)域)。 三維可視化的顯示結(jié)果可以清晰地顯示腫瘤新生血管和心臟、肝臟中血管的連接關(guān)系。

圖6 (A)荷瘤鼠Micro-CT斷層成像結(jié)果；(B)腫瘤血管和荷瘤鼠正常血管的三維可視化顯示圖 (紅色是荷瘤鼠大血管、心臟和肝臟血管，綠色是腫瘤的新生血管)Fig.6 (A)The micro computational tomography images of tumor-bearing mouse;(B)Three dimension images of blood vessels(red stands for blood vessels in the heart,lung,liver of the tumor-bearing mouse,green stands for the tumor angiogenesis)

本實驗結(jié)果顯示，與其他腫瘤新生血管相比，該腫瘤的新生血管密度不大，由于營養(yǎng)供給不足，導(dǎo)致該腫瘤生長后期生長趨緩，這可以很好地解釋腫瘤生長后期的非指數(shù)生長特性。Micro-CT的成像結(jié)果充分驗證了生物熒光成像的結(jié)果。

結(jié) 論

在本論文中，我們首先使用生物自發(fā)熒光成像和激發(fā)熒光成像技術(shù)對腫瘤的進(jìn)展進(jìn)行了定性、定量的熒光強度圖像采集和計算，并與傳統(tǒng)的腫瘤測量結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者具有強相關(guān)性。分析結(jié)果同時表明，腫瘤的生物熒光和激發(fā)熒光成像能更好地反應(yīng)活腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，同時，生物自發(fā)熒光成像相對激發(fā)熒光成像具有更高的成像靈敏度，使之能夠更好地應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移灶的探測及抗腫瘤藥物的療效評估。其次，通過Micro-CT對腫瘤新生血管的斷層成像研究及三維可視化顯示結(jié)果，為在活體條件下對腫瘤新生血管相關(guān)機制的研究及抗腫瘤新生血管藥物療效 (如恩度等)的綜合評價，提供了有效的成像手段。

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Key Words: Bioluminescentimaging; Fluorescentimaging; Micro-computed tomography; Livertumor proliferation;Tumor angiogenesis

Research on Liver Tumor Proliferation and Angiogenesis Based on Multi-Modality Molecular Imaging

MA Xibo,TIAN Jie,YANG Xin,QIN Chenghu,ZHU Shouping,XUE Zhenwen
Medical Image Processing Group,Institute of Automation,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China

Sep 15,2010 Accepted:Nov 2,2011

TIAN Jie,Tel:+86(10)82628760,Fax:+86(10)62527995,E-mail:tian@ieee.org；jie.tian@ia.ac.cn

To detect the HCC-LM3-fLuc-GFP tumor adaptive and exponential process of tumor progression,bioluminescent imaging (BLI) and fluorescent imaging (FMI) were used to calculate the bioluminescent intensity and fluorescent intensity.The results showed that in the first four days,tumor cells became fewer because of the phagocytosis and decomposition of the macrophage and the trypsins.At about the seventh day,the tumor cells were equal with the number of the cells on the first day.This adaptive process cost about one week.In the following days,the tumor began to mount up exponentially.A good linear correlation was found between the tumor sizes measured by caliper and the BLI signals(FMI signals)determined by the optical imaging(R2(tumor sizes and BLI signals)=0.9263;R2(tumor sizes and FMI signals)=0.9068;R2(BLI signals and FMI signals)=0.9961).In addition,to study the tumor angiogenesis,Micro-CT was used to visualize the tumor blood vessels.The figures clearly displayed the connection between the tumor blood vessel and heart,liver or lung blood vessels.

2010-09-15；接受日期：2010-11-02

“973”計劃項目(2006CB705700，2011CB707700)，中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(KGCX2-YW-907)，國家自然科學(xué)基金項目(81027002，81071205)，中國科學(xué)院百人計劃，北京市教委科技重點項目(KZ200910005005)

田捷，電話：(010)82628760，傳真：(010)62527995，E-mail：tian@ieee.org；jie.tian@ia.ac.cn

TP399

10.3724/SP.J.1260.2011.00355

This work was supported by grants from the"973"Program(2006CB705700,2011CB707700),the Knowledge Innovation Project of the Chinese Academy of Sciences(KGCX2-YW-907),the National Natural Science Foundation of China(81027002,81071205),the Hundred Talents Program of the Chinese Academy of Sciences,the Science and Technology Key Project of Beijing Municipal Education Commission(KZ200910005005)