紫穗槐-4,11-二烯合酶基因在酵母工程菌中具有協(xié)同作用

孔建強，支曉慧，王偉，程克棣，朱平

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室&中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室，北京 100050

紫穗槐-4,11-二烯合酶基因在酵母工程菌中具有協(xié)同作用

孔建強，支曉慧，王偉，程克棣，朱平

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室&中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室，北京 100050

為了構(gòu)建高產(chǎn)的紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌，主要探究了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的不同表達(dá)載體在酵母工程菌中是否存在協(xié)同效應(yīng)。首先構(gòu)建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的酵母表達(dá)載體 pGADADS，分別將 pGADADS和pYeDP60/G/ADS轉(zhuǎn)入釀酒酵母W303-1B和WK1中，獲得6種能產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌：W303B[pGADADS]、W303B[pYGADS]、W303B[pYGADS+pGADADS]、WK1[pGADADS]、WK1[pYGADS]和 WK1[pYGADS+pGADADS]。對上述6種酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過GC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，這6種酵母工程菌均能產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯，其產(chǎn)率隨著紫穗槐-4,11-二烯合酶基因拷貝數(shù)的增加而上升，且產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯對酵母工程菌沒有產(chǎn)生毒性。導(dǎo)入多種 ADS重組質(zhì)粒后酵母工程菌的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)率顯著高于多個單質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯之和。上述結(jié)果表明，同一宿主細(xì)胞中多種含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的表達(dá)載體之間存在明顯的協(xié)同效應(yīng)，這為構(gòu)建青蒿素前體高產(chǎn)工程菌提供了一種思路。

酵母工程菌，紫穗槐-4,11-二烯，紫穗槐-4,11-二烯合酶，協(xié)同作用，青蒿素

Abstract:To construct an engineered Saccharomyces cerevisiae producing high titres of amorpha-4,11-diene, we investigated thepossible synergistic effect of different vectors containing amorpha-4,11-diene synthase(ADS) gene within one yeast cell. We constructed the ADS recombinant plasmid pGADADS. This plasmid and another ADS recombinant plasmid pYeDP60/G/ADS were alone, or co-transformed into yeast Saccharomyces cerevisiae W303-1B and WK1, respectively, resulting in the following engineered yeasts, W303B[pGADADS], W303B[pYGADS], W303B[pYGADS+pGADADS], WK1[pGADADS], WK1[pYGADS]and WK1[pYGADS+pGADADS]. All of the six strains were cultured for GC-MS analysis of amorpha-4,11-diene. The results showed that all of the engineered yeasts could produce amorpha-4,11-diene. The yield of the product was improved with increasing ADS gene copies while no deleterious effect on the strain growth was found. Moreover, the product yield of the engineered yeast co-transformed with multiple plasmids was much higher than the total yield of the different engineered yeasts with only one plasmid,respectively. In conclusion, there was a distinct synergistic effect between different recombinant ADS plasmids within one cell. Our results facilitate the construction of the engineered yeast with high yield of amorpha-4,11-diene, the precursor of artemisinin.

Keywords:engineered yeast, amorpha-4,11-diene, amorpha-4,11-diene synthase, synergistic effect, artemisinin

近幾年，隨著青蒿素生物合成途徑的逐漸明晰[1]，以及青蒿素生物合成相關(guān)基因的成功克隆[2-7]，極大地促進(jìn)了青蒿素合成生物學(xué)的發(fā)展[6,8]。青蒿素生物合成相關(guān)基因被導(dǎo)入包括大腸桿菌 Escherichia coli[8-11]和釀酒酵母 Saccharomyces. cerevisiae[6,12-17]在內(nèi)的微生物體內(nèi)，在微生物中重構(gòu)青蒿素中間體生物合成途徑，由于微生物生長繁殖快，因此可以利用“微生物工廠”大量生產(chǎn)青蒿素及其中間體。這種方法不同于簡單的基因插入或敲除，它使不同基因在微生物中重建一條青蒿素代謝途徑成為可能。迄今為止，科研人員利用微生物，獲得了各種青蒿素中間體，如紫穗槐-4,11-二烯 (Amorpha-4,11-diene，AD)[2-6]、青蒿醇[6]、青蒿醛[6]、青蒿酸[6-7]和二氫青蒿酸[7]等。這些目的產(chǎn)物的獲得，表明在微生物中重構(gòu)一條青蒿素生物合成途徑是完全可能的。然而，要想使青蒿素工程菌產(chǎn)生的青蒿素中間體具有工業(yè)價值，必須對工程菌進(jìn)行優(yōu)化，獲得產(chǎn)率更高的微生物。

在青蒿素的生物合成途徑中，由法尼基二磷酸(Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP) 通過紫穗槐-4,11-二烯合酶 (Amorpha-4,11-diene synthase，ADS) 的作用，形成AD是青蒿素生物合成途徑中的限速步驟，AD的產(chǎn)量直接影響到代謝終產(chǎn)物青蒿素在生物體中的含量[9]。因此，提高AD的產(chǎn)量成為了青蒿素合成生物學(xué)中必須重點解決的關(guān)鍵問題。美國Keasling實驗室通過增加FPP的供應(yīng)[8]、改善發(fā)酵條件[10]、增加基因拷貝數(shù)[11]等優(yōu)化措施，使大腸桿菌工程菌中的紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量達(dá)到了293 mg/(L?OD600)[9]，在 S. cerevisiae工程菌中 AD的產(chǎn)量達(dá)到了(781±34) mg/L[14]。我們實驗室也通過基因突變[16]、增加基因拷貝數(shù)[17]以及調(diào)控萜類生物合成途徑[15]等優(yōu)化措施，使AD的產(chǎn)量提高了20 000倍，達(dá)到了123.192 mg/L[16]。

本研究構(gòu)建了一系列紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌，GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)這些酵母工程菌均能產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯，而且部分菌株的紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量達(dá)到了(128.75±21.65) mg/L。更為重要的是，通過這些工程菌，我們證實了同一工程菌中，含ADS基因的不同質(zhì)粒之間存在協(xié)同作用，從而為構(gòu)建高產(chǎn)紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌提供了一種思路。

1 材料與方法

1.1 工具酶和試劑

KOD Plus高保真DNA聚合酶購自Toyobo公司；EZ-T載體購自康潤生物公司；DNA膠回收試劑盒購自百泰克公司；鮭魚精DNA購自Wako公司；PEG4000購自欣經(jīng)科公司；醋酸鋰購自Sigma公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自 TIANGEN公司；朱欒倍半萜標(biāo)準(zhǔn)品 (Valencene) 和正十二烷購自 Fluka公司；其他試劑均為分析純。

1.2 質(zhì)粒、菌種和培養(yǎng)基

宿主菌 E. coli TG1和釀酒酵母 W303-1B(MATa；ade2-1；his -11,-15；leu2-3, -112；ura3-1；trp1-1) 為本實驗室保存。本實驗室構(gòu)建的紫穗槐-4,11-二烯生產(chǎn)菌WK1，是將紫穗槐-4,11-二烯合酶基因整合到W303-1B基因組中而成[17]；酵母表達(dá)載體 pYeDP60/G/ADS為本實驗室構(gòu)建，含有紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，該基因受 GAPDH3啟動子調(diào)控[15-16]；該載體含有 URA3和 ADE2營養(yǎng)標(biāo)記；在高密度培養(yǎng)時，該載體能穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。

LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng) (10 g/L胰蛋白胨；5 g/L酵母提取物；10 g/L NaCl，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉)；YPD培養(yǎng)基 (10 g/L酵母提取物；20 g/L細(xì)菌蛋白胨；20 g/L葡萄糖；固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉) 用于酵母的培養(yǎng)；SC drop out培養(yǎng)基 (7 g/L無氨基酵母氮源；2 g/L drop-out混合物，20 g/L葡萄糖，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉) 用于酵母的脅迫培養(yǎng)。

1.3 酵母表達(dá)載體pGADADS的構(gòu)建

以FGBT(5′-agcatgcggccgctagctgcagagctcatatgaa ttcCTCGAGTTTATCATTATCAATA-3′)和 RGBT(5′-a gccggcctaggatatcccgggatccgcggtaccatggAGCTATGAC CATGATTACGCC-3′)為引物，pYeDP60/G/ADS 質(zhì)粒為模板，擴增得到ADS表達(dá)盒序列 (GAPDH3啟動子-ADS基因-PGK終止子)，克隆至EZ-T載體得到重組質(zhì)粒 pEZADS。分別用 Sph I/Nco I酶切pGADT7，得到908 bp、1 078 bp和6 kb的條帶，回收長為 6 kb的條帶；用 Sph I/Nco I/Pvu I酶切pEZADS，得到 219 bp、1 045 bp、1 752 bp和 2 788 bp四條帶，回收長為2 788 bp的條帶，連接6 kb的pGADT7酶切回收片段和2 788 bp的pEZADS酶切回收片段，得到pGADADS。

1.4 附加體型酵母工程菌的構(gòu)建

提取pGADADS和pYeDP60/G/ADS質(zhì)粒，通過LiAc法[18]將其導(dǎo)入釀酒酵母W303-1B和WK1，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在相應(yīng)的SC drop-out篩選培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)5~7 d，直到長出重組克隆。挑取克隆接種到相應(yīng)的液體SC drop-out培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3~5 d。12 000 r/min，離心2 min，棄上清，收集菌體，提取質(zhì)粒，通過PCR檢測目的質(zhì)粒的存在，從而確定陽性克隆。

1.5 工程菌發(fā)酵

將篩選正確的工程菌菌株接種到10 mL相應(yīng)的SC drop out液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)到OD600達(dá)到1.0。然后取1 mL轉(zhuǎn)接到50 mL新鮮的 YPD液體培養(yǎng)基中，同時加入3 mL正十二烷覆蓋培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)5 d，靜置30 min，吸取10 μL正十二烷進(jìn)行GC-MS定性定量檢測。同時吸取200 μL菌液，檢測OD600值。

1.6 GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物

儀器為Agilent6890-5975氣-質(zhì)聯(lián)用儀，GC-MS檢測條件如下。

色譜條件：DB-5ms毛細(xì)管色譜柱 (30 m×0.25 μm× 0.25 m)；升溫程序：初始溫度100 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至200 ℃，立即以25 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流進(jìn)樣 (分流比10∶1)，進(jìn)樣1 μL；載氣 (氦氣)流量 2 mL/min，恒流模式；色譜-質(zhì)譜接口溫度300 ℃。

質(zhì)譜條件：EI 電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲時間5 min；質(zhì)量掃描方式：全離子掃描；定量離子：m/z 204，189和 119。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGADADS

分別用NcoⅠ和Nco/ⅠSphⅠ對pGADADS進(jìn)行單酶切和雙酶切鑒定，結(jié)果如圖 1所示。從圖中可以看出，經(jīng)過 NcoⅠ單酶切，得到一條長為 8.8 kb左右大小的片段，與pGADADS的理論大小接近；用Nco/ⅠSphⅠ對重組克隆進(jìn)行雙酶切，結(jié)果表明，酶切得到的2條片段大小分別為2.8 kb和6 kb，與理論的大小相當(dāng)，上述酶切結(jié)果說明，pGADADS構(gòu)建成功。pGADADS含有LEU2選擇標(biāo)記。

圖1 pGADADS酶切分析Fig. 1 Restriction analysis of pGADADS. 1: Nco Ⅰ analysis of pGADADS; M: DNA molecular marker: λDNA/Hind Ⅲ; 2:NcoⅠ+SphⅠanalysis of pGADADS; 3:NcoⅠ+SphⅠ an alysi s of pGADT7.

2.2 酵母工程菌的構(gòu)建

分別將pGADADS和pYeDP60/G/ADS導(dǎo)入釀酒酵母W303-1B和WK1，獲得6種酵母工程菌，分別是只導(dǎo)入了 pGADADS的酵母工程菌W303B[pGADADS]和 WK1[pGADADS]；只導(dǎo)入了pYeDP60/G/ADS的酵母工程菌W303B[pYGADS]和WK1[pYGADS]；共轉(zhuǎn)了質(zhì)粒 pGADADS和pYeDP60/G/ADS的酵母工程菌 W303B[pYGADS+pGADADS]和 WK1[pYGADS+pGADADS]。其中，在酵母工程菌 WK1[pYGADS+pGADADS]中，ADS基因存在 3種形態(tài)，一種是整合到酵母基因組上，另外2種分別克隆在質(zhì)粒pGADADS和pYeDP60/G/ADS上。

2.3 GC-MS檢測紫穗槐-4,11-二烯

6種工程菌各挑取 5個克隆，對這些克隆的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS檢測，均檢測到了紫穗槐-4,11-二烯 (圖 2)。根據(jù)朱欒倍半萜標(biāo)準(zhǔn)曲線，對上述 6種酵母工程菌中的紫穗槐-4,11-二烯進(jìn)行了定量測定 (表 1)。從結(jié)果可以看出，以 W303-1B和 WK1為宿主菌的酵母工程菌中，紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量都是隨著ADS基因拷貝數(shù)的增加而上升的 (圖3、4)。通過對以W303-1B為宿主菌的酵母工程菌的菌體干重進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)菌體干重沒有顯著性差異，表明產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯對酵母工程菌沒有產(chǎn)生毒性，不影響酵母工程菌生長 (圖5)。

從結(jié)果進(jìn)一步看出，W303B[pYGADS+pGADADS]產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯總量要超過 W303B[pGADADS]和 W303B[pYGADS]產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯之和。同樣，WK1[pYGADS+pGADADS]產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯總量遠(yuǎn)超W303B[pYGADS]和 WK1[pGADADS]或 W303B[pGADADS]和WK1[pYGADS]產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯之和。

表1 酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量Table 1 Amorpha-4,11-diene production of the engineered yeasts

3 討論

在酵母工程菌中，提高AD產(chǎn)量的方法有很多，如提高ADS基因在微生物中的拷貝數(shù)[12,17]，或改善ADS的作用效果[16]，或增加AD生物合成途徑中底物的供應(yīng)[8-9,11,13]等。通過提高ADS基因在微生物中的拷貝數(shù)來提高工程菌中 AD的產(chǎn)量存在著很大的風(fēng)險：首先，過多的AD可能會對微生物產(chǎn)生毒害；其次，過多外源質(zhì)粒的導(dǎo)入會增加微生物的負(fù)荷，影響其正常功能；最后，隨著整合的外源基因拷貝數(shù)的增加，基因同源序列之間的相互作用會導(dǎo)致外源基因“反式失活”。為了解決上述問題，本實驗設(shè)計了6個酵母工程菌，期望通過對這6種酵母工程菌產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯進(jìn)行分析，得出一些有利的結(jié)論。

圖2 紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌的GC-MS結(jié)果Fig. 2 GC-MS analysis of engineered yeasts producing amorpha-4,11-diene. (A) The total ion chromatogram of engineered yeasts producing amorpha-4,11-diene. (B) Selected ion m/z 204 and m/z 119,189. (C) MS spectrum of the peak of retention time 13.121 min.

圖3 以W303-1B為宿主菌的工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量Fig. 3 Amorpha-4,11-diene production in engineered yeasts derived from W303-1B. 1: W303B; 2: W303B[pGADADS]; 3:W303B[pYGADS]; 4: W303B[pYGADS+pGADADS].

圖 4 以WK1為宿主菌的工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量Fig. 4 Amorpha-4,11-diene production in engineered yeasts derived from WK1. 1: WK1; 2: WK1[pGADADS]; 3:WK1[pYGADS]; 4: WK1[pYGADS+pGADADS].

圖5 酵母工程菌中菌體干重比較Fig. 5 Dry weight analysis of engineered yeasts derived from W303-1B.

結(jié)果表明，隨著 ADS基因拷貝數(shù)的增加，AD的產(chǎn)量確實迅猛增加，然而，這種增加并不會對釀酒酵母產(chǎn)生毒害。估計是由于AD具有揮發(fā)性[10]，使得釀酒酵母產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯絕大部分都已經(jīng)進(jìn)入到正十二烷相中，釀酒酵母體內(nèi)的紫穗槐-4,11-二烯含量已經(jīng)很少，不足以對釀酒酵母產(chǎn)生毒性。

在釀酒酵母 WK1[pYGADS+pGADADS]中，ADS基因通過3種方式導(dǎo)入釀酒酵母，一種是通過基因重組的方式導(dǎo)入了釀酒酵母，另外分別通過質(zhì)粒pYeDP60/G/ADS和pGADADS的形式導(dǎo)入釀酒酵母。在這 3種方式中，ADS基因都是受釀酒酵母GAPDH3啟動子調(diào)控，這樣在這個酵母工程菌，具有多個拷貝數(shù)的除了ADS基因之外，還有GAPDH3啟動子。然而，在這樣的酵母工程菌中并沒有出現(xiàn)反式失活的現(xiàn)象，相反，AD的產(chǎn)量進(jìn)一步上升。這個實驗的成功為下一步采用多個質(zhì)粒，同一個啟動子的導(dǎo)入方式構(gòu)建青蒿素酵母工程菌奠定了基礎(chǔ)。

從結(jié)果可以看出，共轉(zhuǎn)多個質(zhì)粒的酵母工程菌產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量要高于轉(zhuǎn)單個質(zhì)粒的多個酵母工程菌的產(chǎn)量總和，這就表明共轉(zhuǎn)入同一酵母工程菌中的多個質(zhì)粒的ADS基因之間存在協(xié)同作用。這樣就為解決青蒿酸或二氫青蒿酸酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯供應(yīng)問題提供了思路：可以將ADS基因通過諸如整合，或與青蒿素代謝途徑中的其他酶基因串聯(lián)在不同質(zhì)粒上等形式導(dǎo)入酵母工程菌中，利用 ADS基因之間的協(xié)同作用，增加AD的供應(yīng)，提高青蒿酸或二氫青蒿酸的產(chǎn)量，從而為獲得高產(chǎn)青蒿酸或二氫青蒿酸酵母工程菌奠定基礎(chǔ)。

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Synergistic effect of amorpha-4,11-diene synthase gene in engineered Saccharomyces cerevisiae

Jianqiang Kong, Xiaohui Zhi, Wei Wang, Kedi Cheng, and Ping Zhu
Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products, Ministry of Health of PRC & Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education of PRC, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union
Medical College, Beijing 100050, China

Received: May 17, 2010; Accepted: September 6, 2010

Supported by: National Major Special Program of New Drug Research and Development (No. 2009ZX09503-011).

Corresponding author: Zhaolie Chen. Tel: +86-10-66948818; E-mail: chenzl23@sina.com*These authors contributed equally to this study.

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項資助課題 (No. 2009ZX09503-011) 資助。