中國倉鼠卵巢工程細胞無血清流加培養(yǎng)關鍵工藝參數(shù)的考察

劉興茂，劉紅，葉玲玲，李世崇，吳本傳，王啟偉，陳昭烈

軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所，北京 100071

中國倉鼠卵巢工程細胞無血清流加培養(yǎng)關鍵工藝參數(shù)的考察

劉興茂*，劉紅*，葉玲玲，李世崇，吳本傳，王啟偉，陳昭烈

軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所，北京 100071

主要考察流加培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分、流加起始時間及初始接種密度對 11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)的影響。在研究中以懸浮適應的表達尿激酶原 (Pro-urokinase，Pro-UK) CHO工程細胞系11G-S為研究對象，在100 mL的搖瓶中無血清懸浮流加培養(yǎng)11G-S細胞，同時以活細胞密度、細胞活力及Pro-UK活性為評價依據(jù)。結果表明在培養(yǎng)基中氨基酸、無血清添加成分及無機鹽對促進細胞生長、細胞活力維持及蛋白表達起著較為重要的作用；且流加起始時間為72 h及初始接種密度為3×105~4×105cells/mL的流加培養(yǎng)效果較好。在為期12 d的流加培養(yǎng)過程中，11G-S細胞的最大活細胞密度達到7.8×106cells/mL，Pro-UK的最大累積活性為8 570 IU/mL。在此基礎上，分別考察了無血清懸浮流加培養(yǎng)及分批培養(yǎng)11G-S細胞的生長及代謝特征，流加培養(yǎng)中期11G-S細胞的比生長速率 (μ) 高于同期批次培養(yǎng)的11G-S細胞；流加培養(yǎng)中后期11G-S細胞的葡萄糖比消耗速率 (qglu) 和谷氨酰胺比消耗速率 (qgln) 均高于同期批次培養(yǎng)的11G-S細胞。

CHO工程細胞，無血清培養(yǎng)，流加培養(yǎng)，工藝參數(shù)，代謝特征

Abstract:Taking a suspension adapted recombinant CHO cell line, 11G-S expressing human Pro-urokinase (Pro-UK) as the object of study, the impacts of different feeding nutrients, the start time of feeding and cell inoculation density on the growth and Pro-UK production of 11G-S cells in serum-free fed-batch culture were evaluated in 100 mL shacking flasks. The results indicated that amino acids, serum-free supplements and inorganic salts played important role in cell growth, cell viability and protein expression. And the effects of cells fed-batch culture was much better with the initial cell inoculation density at3×105~4×105cells/mL and the start time of feeding set at 72 h, a maximum viable cells density of 7.8×106cells/mL with a peak Pro-UK activity at 8 570 IU/mL was achieved during 12 d fed-batch culture. Further, the μ of the 11G-S cells at the middle phase of the fed-batch culture, and both the qgluand qglnof the 11G-S cells at the middle and later phases of the fed-batch culture was higher than that of the 11G-S cells at the same phase of the batch culture, respectively.

Keywords:recombinant CHO cells, serum free culture, fed-batch culture, process parameter, metabolism character

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物的耗竭和大量代謝副產(chǎn)物的積累往往是限制細胞生長密度、影響培養(yǎng)過程的主要因素[1-2]。特別是在批次培養(yǎng)過程中，不斷消耗的營養(yǎng)成分往往成為影響細胞密度、細胞活力和細胞表達產(chǎn)物生產(chǎn)的限制性因素。流加培養(yǎng)根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，在培養(yǎng)過程中流加濃縮的營養(yǎng)液，可有效地減緩乃至消除營養(yǎng)限制因素，從而延長細胞培養(yǎng)時間，提高細胞培養(yǎng)密度及細胞表達產(chǎn)物濃度[3]。流加培養(yǎng)由于其操作的簡易性、可放大性、靈活性已被廣泛用于眾多動物細胞表達產(chǎn)品的生產(chǎn)，成為動物細胞培養(yǎng)的主流工藝[4-5]。

動物細胞流加培養(yǎng)的效果受眾多因素的影響。其中，流加液的營養(yǎng)成分、流加初始時間及細胞接種密度等因素是流加培養(yǎng)工藝的重要參數(shù)[6]。據(jù)此，本研究以懸浮適應的表達尿激酶原 (Pro-urokinase，Pro-UK) CHO工程細胞系11G-S為研究對象，考察無血清培養(yǎng)條件下細胞接種密度、流加起始時間和流加培養(yǎng)基中的不同營養(yǎng)成分對11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)的影響，并對11G-S細胞在無血清流加培養(yǎng)和批次培養(yǎng)的生長及代謝特征進行比較，以期為CHO工程細胞無血清流加培養(yǎng)工藝的建立和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

適應懸浮培養(yǎng)的表達Pro-UK CHO工程細胞系11G-S (由軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所構建、保藏)。

1.1.2 培養(yǎng)基

有血清培養(yǎng)基為含1% (V/V) 小牛血清、0.1%(W/V) Pluronic F-68和 25 μg/mL硫酸葡聚糖的DMEM/F12 (V/V，1:1)。無血清培養(yǎng)基為添加了胰島素、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白、微量元素、Pluronic F-68及硫酸葡聚糖等成分的 DMEM/F12 (V/V，1:1)。流加培養(yǎng)基為由葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、微量元素、維生素、無血清添加成分、無機鹽及次黃嘌呤等組成的混合液。

1.2 方法

1.2.1 流加液營養(yǎng)成分對11G-S細胞流加培養(yǎng)效果影響的考察

將谷氨酰胺、氨基酸、微量元素、維生素、次黃嘌呤、無血清培養(yǎng)基添加成分及無機鹽等組分按表1的組合配制8種不同的濃縮流加液。依據(jù)不同的濃縮流加液設置 8個實驗組，并以批次培養(yǎng)作對照。11G-S細胞以3×105~3.5×105cells/mL的初始接種密度分別接入9個100 mL三角瓶中，培養(yǎng)初始體積為 35 mL，將三角瓶置于 37 ℃溫箱中搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min。培養(yǎng)至72 h開始實施每24 h補給3 mL濃縮流加液的間歇流加。流加培養(yǎng)時培養(yǎng)體系中谷氨酰胺及葡萄糖瞬時濃度水平分別控制在2~3 mmol/L及3~5 mmol/L。每24 h取樣，用于檢測活細胞密度、細胞活力及Pro-UK活性。

1.2.2 流加起始時間對11G-S細胞流加培養(yǎng)效果影響的考察

將11G-S細胞以3.5×105cells/mL的初始接種密度分別接入3個裝有無血清基礎培養(yǎng)液的100 mL三角瓶中，培養(yǎng)初始體積為35 mL，將三角瓶置于37 ℃溫箱中搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min。分別于培養(yǎng)至48 h、72 h、96 h開始按每24 h流加3 mL由谷氨酰胺、氨基酸、微量元素、維生素、次黃嘌呤、無血清培養(yǎng)基添加成分及無機鹽等組成的濃縮流加液。每24 h取樣，用于檢測活細胞密度、細胞活力和Pro-UK活性。

表1 不同流加液營養(yǎng)成分對11G-S細胞流加培養(yǎng)效果的影響Table 1 Effects of different feeding nutrients on the growth and Pro-UK production of 11G-S cells in fed-batch cultures

1.2.3 細胞接種密度對11G-S細胞流加培養(yǎng)效果影響的考察

將 11G-S 細胞以 2×105、3×105、4×105、5×105cells/mL的初始密度分別接入4個裝有無血清基礎培養(yǎng)液的 100 mL三角瓶中，培養(yǎng)初始體積為35 mL，將三角瓶置于37 ℃溫箱中搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min。培養(yǎng)至72 h開始按每24 h流加3 mL由谷氨酰胺、氨基酸、微量元素、維生素、次黃嘌呤、無血清培養(yǎng)基添加成分及無機鹽等組成的濃縮流加液。每24 h取樣，用于檢測活細胞密度、細胞活力和Pro-UK活性。

1.2.4 11G-S細胞流加培養(yǎng)生長和代謝特征的考察

將11G-S細胞以3.5×105cells/mL的初始接種密度接入裝有無血清基礎培養(yǎng)液250 mL搖瓶中，培養(yǎng)初始體積為80 mL，將三角瓶置于37 ℃溫箱中搖床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min。培養(yǎng)至72 h開始按每24 h流加15 mL由谷氨酰胺、氨基酸、微量元素、維生素、次黃嘌呤、無血清培養(yǎng)基添加成分及無機鹽等組成的濃縮流加液，直至培養(yǎng)體積達到150 mL。同時，按相同接種密度和培養(yǎng)條件設置11G-S細胞無血清批次培養(yǎng)作為對照。每24 h取樣，用于檢測活細胞密度、細胞活力、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和Pro-UK活性。

1.2.5 活細胞密度、細胞活力、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和Pro-UK活性的測定

采用 Cedex AS20 細胞密度和活力自動分析系統(tǒng) (Innovatis，Germany) 進行活細胞計數(shù)和活力分析。采用 YSI 7100 多參數(shù)生物分析系統(tǒng) (Yellow Springs Instruments，USA) 定量檢測細胞培養(yǎng)上清的葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺的濃度。采用體外纖維蛋白瓊脂板溶圈法檢測 Pro-UK的體外纖維蛋白溶解活性[7]。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)結果采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差別采用雙尾 t檢驗和方差分析(P＜0.05 為有較顯著性差異)。

2 結果與分析

2.1 不同流加營養(yǎng)成分對11G-S細胞流加培養(yǎng)的影響

為了確定流加液的營養(yǎng)組成，以活細胞密度、細胞活力及Pro-UK活性為評價依據(jù)，考察不同流加營養(yǎng)成分對11G-S細胞流加培養(yǎng)效果的影響 (表2)。從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，F(xiàn)B1組的最大活細胞密度、最大Pro-UK活性及培養(yǎng)結束時的活細胞密度、細胞活力等指標均基本與FB0相同，F(xiàn)B0與FB1組間沒有顯著差異 (P＞0.05)，表明僅流加谷氨酰胺對11G-S細胞的生長和Pro-UK表達均無明顯的促進作用。FB2、FB3、FB4、FB5及FB6各組之間的評價指標基本相同，且其中的最大活細胞密度及最大Pro-UK活性均明顯高于FB1組，F(xiàn)B1與FB2~6組間有顯著性差異 (P＜0.05)，但 FB2~6各組間無顯著性差異 (P＞0.05)；表明流加液中的氨基酸成分具有明顯的促進11G-S細胞生長和Pro-UK表達作用；流加液中的維生素、微量元素及次黃嘌呤等成分對11G-S細胞的生長及活力維持沒有明顯的作用。FB7組中的最大活細胞密度與FB2~6組實驗沒有明顯差異 (P＞0.05)，但培養(yǎng)結束時的活細胞密度及細胞活力均較前幾組有所提高，提示流加培養(yǎng)液中的無血清添加成分對維持 11G-S細胞的活力有一定的作用。FB8組中各項評價指標均高于其他實驗組，且與 FB2~6組相比具有顯著性差異 (P＜0.05)，但與FB7組相比無顯著性差異 (P＞0.05)。表明流加培養(yǎng)液中的無機鹽具有促進11G-S細胞生長和保持細胞活力的作用。

2.2 流加起始時間對11G-S細胞流加培養(yǎng)的影響

流加起始時間是影響流加培養(yǎng)效果的重要因素之一，為了確立11G-S細胞流加培養(yǎng)工藝的最佳流加起始時間，以活細胞密度、細胞活力及Pro-UK活性作評價指標，考察流加起始時間對流加培養(yǎng)效果的影響。在以72 h為流加起始時間實驗組的各項評價指標中，除細胞活力外，其他指標均優(yōu)于流加起始時間為48 h和96 h的實驗組 (表3)?？傮w而言各實驗組間無明顯差異 (P＞0.05)。

2.3 細胞接種密度對11G-S細胞流加培養(yǎng)的影響

表4為考察不同接種密度對11G-S細胞流加培養(yǎng)效果影響的各項評價指標值。細胞接種密度為2×105cells/mL、3×105cells/mL 和 4×105cells/mL 實驗組中的各項評價指標基本相同，且均優(yōu)于細胞接種密度為5×105cells/mL實驗組，但各實驗組間無明顯差異 (P＞0.05)。結果表明在11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)工藝中選取較低的細胞接種密度，既可提高11G-S細胞的倍增數(shù)量，也便于流加培養(yǎng)工藝的規(guī)模放大。

2.4 11G-S細胞流加培養(yǎng)的生長和代謝特征

圖1所示為11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)及批次培養(yǎng)過程中的細胞生長和Pro-UK表達。根據(jù)11G-S細胞的活細胞密度和細胞活力變化，可將為期12 d的培養(yǎng)過程大致分為前期、中期、后期3個階段，即0~4 d的快速生長期、4~8 d的生長遲滯期、8~12 d的細胞衰退期，11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)及批次培養(yǎng)的細胞生長呈現(xiàn)基本相同的變化趨勢。11G-S細胞的μ值自流加培養(yǎng)第3 天的0.75 d?1下降至第5天的0.36 d?1，批次培養(yǎng)同期的 11G-S細胞μ值從0.70 d?1下降至?0.07 d?1，表明流加培養(yǎng)減緩了11G-S細胞由快速生長期進入生產(chǎn)遲滯期μ的下降程度。細胞培養(yǎng)中期μ值下降幅度不同的直接體現(xiàn)在最大活細胞密度的出現(xiàn)時間和數(shù)值的不同。11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)的最大活細胞密度出現(xiàn)在第 6天，達到7.8×106cells/mL；批次培養(yǎng)的最大活細胞密度出現(xiàn)在第4 天，達到4.2×106cells/mL (圖1A)。Pro-UK活性峰值分別在流加培養(yǎng)的第6 天達到8 570 IU/mL和批次培養(yǎng)的第4 天達到5 672 IU/mL(圖1B)。圖2反映了11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)及批次培養(yǎng)代謝特征的葡萄糖比消耗率 (qglu)、乳酸比生產(chǎn)率(qlac) 及谷氨酰胺比消耗率 (qgln) 總體上呈現(xiàn)出由高到低的相同變化趨勢。流加培養(yǎng)中后期11G-S細胞的葡萄糖比消耗速率 (qglu) 和谷氨酰胺比消耗速率 (qgln) 分別維持在(0.6±0.27) μmol/(106cells·d)和(0.4±0.23) μmol/(106cells·d)，同期批次培養(yǎng) 11G-S 細胞的 qglu和 qgln分別維持在(0.1±0.04) μmol/(106cells·d)和(0.02±0.01) μmol/(106cells·d)。11G-S 細胞在兩種培養(yǎng)模式的 qlac均由培養(yǎng)早期的(2.5±0.6) μmol/(106cells·d)下降到中后期的(?0.24±0.11) μmol/(106cells·d)。流加培養(yǎng)中后期培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺濃度高于同期批次培養(yǎng)的葡萄糖和谷氨酰胺濃度，可能是11G-S細胞流加培養(yǎng)中后期qglu和qgln高于同期批次培養(yǎng)的成因。

表2 不同流加營養(yǎng)成分對11G-S細胞流加培養(yǎng)效果的影響Table 2 Effects of different feeding nutrients on the growth and Pro-UK production of 11G-S cells in fed-batch cultures

表3 流加起始時間對11G-S細胞流加培養(yǎng)效果的影響Table 3 Effects of the starting time of feeding on the growth and Pro-UK production of 11G-S cells in fed-batch cultures

表4 細胞接種密度對11G-S細胞流加培養(yǎng)結果的影響Table 4 Effects of inoculation density on the growth and Pro-UK production of 11G-S cells in fed-batch cultures

圖1 11G-S細胞在無血清流加培養(yǎng)和批次培養(yǎng)中的細胞生長 (A) 和Pro-UK生產(chǎn) (B)Fig. 1 The growth (A) and Pro-UK production (B) of 11G-S cells in serum-free fed-batch and batch culture. ×: viable cell density in batch culture; *: cell viability in batch culture; +: μ in batch culture. (B) ■: Pro-UK activity in batch culture; (A) O: viable cell density in fed-batch culture; □: cell viability in fed-batch culture; △: μ in fed-batch culture; ■: Pro-UK activity in fed-batch culture. Data represent the means of three experiments.

圖2 11G-S細胞在無血清流加培養(yǎng)和批次培養(yǎng)中的葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺代謝Fig. 2 The metabolism of glucose, lactate and glutamine of 11G-S cells in serum-free fed-batch and batch culture. ■: qgluin batch culture; □: qgluin fed-batch culture; ▲: qlacin batch culture; △: qlacin fed-batch culture; ◆: qglnin batch culture;◇: qgluin fed-batch culture. Data represent the means of three experiments.

3 討論

多樣、均衡的營養(yǎng)供是維持體外培養(yǎng)細胞生長代謝的基本前提[8]。流加培養(yǎng)根據(jù)細胞的營養(yǎng)需求，針對性地流加濃縮的營養(yǎng)液，使細胞在培養(yǎng)過程中處于能夠滿足或基本滿足其生長代謝需要的營養(yǎng)供給環(huán)境[3]。根據(jù)其消耗量和檢測的難易程度，流加液中的營養(yǎng)成分可大致地分為以下 2類：一類是消耗量較大且易于檢測的營養(yǎng)組分，如葡萄糖和氨基酸等；另一類是其消耗較少且不易檢測的營養(yǎng)組分，如維生素、微量元素及一些無血清添加成分等[9]。

流加液中消耗量較大且易于檢測的營養(yǎng)成分，主要是細胞生長代謝的能源和前體。其中，氨基酸對促進細胞生長和蛋白表達發(fā)揮著重要的作用，但單一的流加谷氨酰胺往往不能滿足細胞生長代謝的營養(yǎng)需求[10-11]。研究表明細胞吸收的所有營養(yǎng)成分均是通過細胞膜運輸?shù)?，并且營養(yǎng)成分傳輸速率是受培養(yǎng)介質(zhì)中營養(yǎng)成分濃度的影響。有些緩慢消耗的養(yǎng)分可能需要高濃度環(huán)境下才能有效地跨越細胞膜，因此在流加培養(yǎng)過程中維持氨基酸的絕對濃度是影響流加培養(yǎng)效果的一個至關重要的因素。本研究結果表明，在CHO工程細胞的無血清流加培養(yǎng)過程中，氨基酸的添加可有效地促進細胞生長和蛋白表達。

流加液中消耗較少且不易檢測的營養(yǎng)成分一般并不作為細胞生長代謝的能源和前體，但參與調(diào)節(jié)細胞的代謝。在細胞培養(yǎng)過程中這類營養(yǎng)成分生物活性的逐漸降低或因其自細胞外向在細胞內(nèi)的富集，均可造成其含量和活性不足，進而對細胞生長和代謝帶來不利影響[12]。本研究結果證實，在CHO工程細胞的無血清流加培養(yǎng)過程中，添加無血清添加成分對細胞的生長沒有明顯促進作用，但可以有效地延長細胞培養(yǎng)時間，使細胞在培養(yǎng)后期維持著較高的活率。同時，適量流加無血清添加成分和無機鹽不僅有助于細胞培養(yǎng)密度的提高，也有利于細胞活力的維持。

細胞接種密度和流加起始時間是影響流加培養(yǎng)效果的互為關聯(lián)因素，流加起始時間在很大程度上受細胞接種密度的影響，過早或過晚啟動流加都會影響細胞流加培養(yǎng)的效果[3-13]。一般而言，細胞接種密度高，流加起始時間提前；反之，流加起始時間延后。本研究的結果提示，較高的細胞接種密度(5×105cells/mL) 并不能提高 CHO 工程細胞無血清流加培養(yǎng)的效果；較低的細胞接種密度(2×105~3×105cells/mL) 既可提高 CHO 工程細胞無血清流加培養(yǎng)的倍增數(shù)量，也便于流加培養(yǎng)工藝的規(guī)模放大。

比較11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)和批次培養(yǎng)的細胞生長動態(tài)，11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)及批次培養(yǎng)的細胞生長呈現(xiàn)基本相同的變化趨勢。流加培養(yǎng)中期μ值下降的減緩使 11G-S細胞的最大活細胞密度、培養(yǎng)時間及Pro-UK活性均較批次培養(yǎng)有較大程度的提高。對比反映11G-S細胞無血清流加培養(yǎng)及批次培養(yǎng)代謝特征的 qglu、qlac及 qgln參數(shù)，流加培養(yǎng)中后期11G-S細胞的qglu及qgln高于同期批次培養(yǎng)的qglu及qgln葡萄糖和谷氨酰胺濃度，但qlac均由培養(yǎng)早期的(2.5±0.6) μmol/(106cells·d)下降到中后期的(?0.24±0.11) μmol/(106cells·d)，這也反映了 11G-S細胞在流加培養(yǎng)中后期的代謝效率優(yōu)于同期批次培養(yǎng)的11G-S細胞。同時，研究結果也表明當11G-S細胞的 qglu降低至一定水平，會顯著降低進入糖酵解的葡萄糖比例，有利于減緩甚至消除乳酸的生成和積累對細胞的負面影響。

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Evaluation of the critical process parameters for the cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells in serum-free fed-batch mode

Xingmao Liu*, Hong Liu*, Lingling Ye, Shichong Li, Benchuan Wu, Qiwei Wang, and Zhaolie Chen
Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Received: June 2, 2010; Accepted: September 21, 2010

Supported by: Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. BLYX200924), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2009AA10Z107).

Corresponding author: Xiaoming Pang. Tel: +86-10-62336269; E-mail: xmpang@163.com

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金 (No. BLYX200924)，國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2009AA10Z107) 資助。