抗禽流感病毒H5N1分泌型IgA在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中的表達(dá)

李存，張寶中，安小平，米志強(qiáng)，劉大斌，姜煥煥，潘博，王盛，陳斌，黃芬，王娟，王曉娜，童貽剛

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

抗禽流感病毒H5N1分泌型IgA在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中的表達(dá)

李存，張寶中，安小平，米志強(qiáng)，劉大斌，姜煥煥，潘博，王盛，陳斌，黃芬，王娟，王曉娜，童貽剛

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

分泌型IgA (SIgA) 在機(jī)體的粘膜免疫中具有重要作用，在外分泌道中比單體IgA和IgG抗體具有更好的抗感染活性。為了表達(dá)抗禽流感病毒H5N1人-鼠嵌合分泌型IgA抗體，首先以本室先前構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)IgA的中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO) 細(xì)胞系為基礎(chǔ)，共轉(zhuǎn)染分泌片和J鏈表達(dá)質(zhì)粒，然后用抗生素Zeocin選擇陽性克隆細(xì)胞，利用倍比稀釋的方法篩選分泌SIgA的單克隆細(xì)胞，通過Western blotting分析培養(yǎng)上清中SIgA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在CHO細(xì)胞中成功表達(dá)了SIgA抗體，上述研究為研制分泌型IgA抗體制劑奠定了良好的基礎(chǔ)。

禽流感病毒H5N1，Western blotting，SIgA抗體

Abstract:Secretory IgA (SIgA) antibodies in external secretions play an important role in mucosal immune response. Polymeric SIgA was advantageous over monomeric IgA (mIgA) and IgG in several aspects. To express secretory IgA antibody against H5N1 virus, we constructed the secretory component and immunoglobulin J expressing plasmids and co-transfected the plasmids into the Chinese hamster ovary cells (CHO) stably expressing immunoglobulin A. Then we used Zeocin to select the positive clone cells,monoclonal cells stably secreting SIgA was screened through fold dilution method at last. The SIgA antibody secreted from the CHO cells was confirmed by Western blotting, which demonstrated that we had got the complete SIgA molecular. The successful expression of this polymeric anti-H5N1 SIgA in CHO cells will contribute to the production of recombinant SIgA as a preventive agent for infectious disease control.

Keywords:Avian influenza virus H5N1, Western blotting, secretory Immunoglobulin A

禽流感 (Avian influenza，AI) 是由甲型流感病毒引起的一種以侵害呼吸系統(tǒng)為主的疾病，嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，并嚴(yán)重影響國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。禽流感病毒 (Avian influenza virus，AIV)基因組極易發(fā)生變異，造成病毒的多型性，給禽流感防治帶來極大難度。據(jù)WHO最新報道，截至2010年3月29日，全世界已確診490人感染H5N1亞型高致病性禽流感，死亡290人，病死率為59.2%[1]。WHO預(yù)測下一次流感大流行不是有和無的問題，而是早和晚的問題。為此，發(fā)展人禽流感阻斷技術(shù)，進(jìn)行人禽流感的綜合防控，成為世界各國的迫切需求。

在預(yù)防方面，使用疫苗進(jìn)行主動免疫預(yù)防是一種較為理想的選擇，但是目前人用禽流感疫苗上存在一些問題。由于目前尚沒有禽流感在人群中流行，因此疫苗保護(hù)效果難以準(zhǔn)確評價。使用疫苗進(jìn)行預(yù)防還有一個很大的缺點，那就是從疫苗注射到產(chǎn)生保護(hù)性抗體需要數(shù)周的時間，這往往會影響預(yù)防效果，尤其是對一些高危人群，不能提供緊急防護(hù)，一旦疫情發(fā)生，有可能造成大量生命損失?？贵w制劑作為一種被動免疫防護(hù)手段，可以彌補(bǔ)疫苗的不足，可以在使用之后立刻產(chǎn)生防護(hù)效果，尤其適合于重點人群的緊急保護(hù)。

分泌型IgA是20世紀(jì)60年代初在外分泌液中發(fā)現(xiàn)的一種IgA抗體，主要存在于乳汁、胃腸液、呼吸道分泌液等外分泌液中。SIgA 分子是由 2個IgA 單體 (每個單體含2條輕鏈和2條重鏈)、1條J鏈和1條分泌片 (Secretory component，SC，為多聚免疫球蛋白受體pIgR的胞外裂解片段) 構(gòu)成的異源十聚體 (圖1)[2]。

圖1 SIgA多肽鏈?zhǔn)疽鈭DFig. 1 Diagram of SIgA polypeptide chain.

與普通的抗體分子相比 SIgA具有許多優(yōu)良特性：SIgA分子中的J鏈將2個IgA單體連接起來，由于每個IgA單體具有2個抗原結(jié)合部位，因此每個 SIgA抗體即有 4個抗原結(jié)合位點 (四價)，從而比普通抗體分子具有更高的親和力[3]。SIgA具有很高的穩(wěn)定性，其在粘膜表面的半衰期為IgG的3倍，其在人體外分泌道中的保護(hù)作用可以持續(xù)4個月以上[3]。分泌片的存在還賦予SIgA特殊的免疫保護(hù)作用：首先，分泌片具有非特異性的病原微生物中和活性[4]；其次，分泌片上的糖基粘附于粘膜上皮更使SIgA整齊地排列在粘膜表面，形成隔離保護(hù)層，可有效地阻止病毒的入侵[5]。因此，研究呼吸道或消化道分泌型IgA對禽流感病感染的阻斷作用，具有潛在的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及主要試劑

DNA 工具酶購自 Promega公司；LipofectiAMINETM2000Regent購自 Gibco BRL公司；Zeocin抗生素購自Invitrogen公司；DMEM購自Hyclone公司；透析胎牛血清購自Bioind公司；本研究使用的抗體均購自 Sigma公司；protein A-agarose購自Invitrogen公司；實驗中所用的抗禽流感病毒H5N1 HA的嵌合IgA穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞系已由本實驗室構(gòu)建完成[8]；實驗所設(shè)計的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成 (表1)。

表1 合成引物序列Table 1 Primer Sequence

1.2 人-鼠嵌合SIgA抗體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 人-鼠嵌合SIgA 抗體分泌片SC表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本實驗室通過 DNA剪接技術(shù)克隆得到了免疫球蛋白受體 (pIgR) 基因，但獲得的 pGEM-T-pIgR的克隆中有部分突變 (融合引物內(nèi))[6]，為了獲得野生型的基因序列，選擇pGEM-T-pIgR 1號和2號2個克隆 (克隆 1目的基因 3′端有突變，克隆 2目的基因5′端有突變)，再加上pUC19，通過構(gòu)建輔助質(zhì)粒和中間質(zhì)粒，利用“全長質(zhì)粒快速定點突變技術(shù)”[7]完成重組質(zhì)粒 pcDNA4-pIgR的構(gòu)建(圖 2)。

圖2 pcDNA4-SC構(gòu)建過程示意圖Fig. 2 Construction of SC expression plasmid.

以EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切pGEM-T-pIgR-1，回收約1 000 bp DNA 片段，同時以BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切pGEM-T-pIgR-2，回收約500 bp DNA片段，將上述回收的2條DNA條帶插入到以EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切的 pUC19載體中，形成輔助質(zhì)粒 pUC19-pIgR-help；第二步將輔助質(zhì)粒 pUC19-pIgR-help進(jìn)行 EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切，回收純化約 1 500 bp的DNA條帶，同時以 EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切 pGEM-T-pIgR-1，回收純化約1 000 bp的DNA條帶，將上述回收的 2條 DNA條帶插入到經(jīng) EcoRⅠ消化的pUC19載體中，形成中間質(zhì)粒 pUC19-pIgR-final；最后將中間質(zhì)粒 pUC19-pIgR-final使用 EcoRⅠ消化，回收完整pIgR 基因的2 500 bp DNA條帶，與以EcoRⅠ酶切的哺乳動物表達(dá)載體pcDNA4/His A連接，完成人 pIgR基因的真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA4-pIgR的構(gòu)建。

利用本實驗室建立的“全長質(zhì)?？焖俣c突變技術(shù)”[7]，將pcDNA4-pIgR質(zhì)粒pIgR基因胞內(nèi)區(qū)基因部分突變，從而完成 pIgR胞外區(qū)基因載體的構(gòu)建。具體方法：設(shè)計2條突變引物pCDNA-SC-F和PCDNA-SC-R (表1)；用Phusion超保真DNA聚合酶做標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)，50 μL體系含有10 μL 5×GC Buffer(含 MgCl2)，4 μL dNTPs (各 2.5 mmol/L)，引物pCDNA-SC-F 和 pCDNA-SC-R (10 μmol/L 各 1 μL，0.2 μL pcDNA4-pIgR(10 ng) 作為PCR反應(yīng)的模板，0.5 μL (2 U/μL) Phusion 超保真 DNA 聚合酶，用去離子水補(bǔ)至50 μL。將配好的PCR反應(yīng)體系放入GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Elmer，F(xiàn)osterCity，CA) 中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性30 s；變性98 ℃變性10 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸150 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將上述PCR產(chǎn)物純化并進(jìn)行磷酸化，然后放入 37 ℃的水浴鍋中30 min；最后70 ℃加熱5 min將T4 多聚核苷酸激酶滅活；磷酸化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行自連，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及測序鑒定，突變后的質(zhì)粒命名為pcDNA4-SC。

1.2.2 人-鼠嵌合SIgA抗體IgJ表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

與SC基因的擴(kuò)增方法相同，我們也是利用DNA剪接技術(shù)克隆得到了 IgJ基因，并將其克隆到了PGEM-T-Easy克隆載體上[6]。以Hind /ⅢEcoRⅠ雙酶切PGEM-T-Easy-IgJ，回收約700 bp IgJ基因片段，插入以Hind /ⅢEcoRⅠ雙酶切的哺乳動物表達(dá)載體pcDNA4/His A中，得到人IgJ基因的哺乳細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA4-IgJ (圖 3)。

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IgJ構(gòu)建示意圖Fig. 3 Construction of IgJ expression plasmid.

1.3 嵌合IgA CHO單克隆細(xì)胞系的再轉(zhuǎn)染及陽性克隆的篩選

本實驗室已成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)IgA的CHO單克隆細(xì)胞系[8]，在此基礎(chǔ)上我們再共轉(zhuǎn)染SC和IgJ表達(dá)質(zhì)粒。取pcDNA4-SC、pcDNA4-IgJ各2 μg加到100 μL無血清和無抗生素培養(yǎng)液DMEM中，取LipofectiAMINETM20004 μL 加到 100 μL 無血清和抗生素的培養(yǎng)液，室溫孵育5 min，將二者混合，室溫放置20 min。靜置期間，每次用無血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液1 mL洗滌細(xì)胞 2次，最后加0.2 mL的無血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)液到六孔板細(xì)胞中。將 LipofectiAMINETM2000和 DNA的混合物滴加到培養(yǎng)板。于5% CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)6 h，吸棄上清，加入含10%透析胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，然后用含500 μg/mL zeocin抗生素的培養(yǎng)液進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，通過96孔板倍比稀釋的方法篩選單克隆細(xì)胞系。

1.4 嵌合分泌型IgA單克隆細(xì)胞系的PCR鑒定

將篩選得到的單克隆細(xì)胞系提取全基因組DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，鑒定SC基因和IgJ基因是否已與CHO?細(xì)胞基因組發(fā)生重組。用J-F、Jnei-R和SC-F、SCnei-R分別擴(kuò)增IgJ基因和SC基因，具體體系如下：5×FastPfu Buffer 5 μL；dNTPs (2.5 mmol/L)2.5 μL，J-F、Jnei-R (10 μmol/L) (或 SC-F、SCnei-R)；FastPfu (2.5 U/μL) 0.5 μL；用水補(bǔ)至 25 μL。按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性 20 s，51 ℃ (SC 57 ℃) 退火 20 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。

1.5 嵌合分泌型IgA單克隆細(xì)胞系的無血清培養(yǎng)

將 SIgA單克隆細(xì)胞在含有 10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，等其生長至 G1期更換為DMEM無血清培養(yǎng)，72 h后收集無血清上清，然后進(jìn)行免疫沉淀和Western blotting分析。

1.6 免疫沉淀實驗

每毫升SIgA樣品加入50 μL兔抗人的IgA (α)4 ℃孵育過夜，然后加入 50 μL protein A-agarose 4 ℃孵育4 h，5 000 r/min離心10 min后小心棄上清，加入60 μL SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴5 min，最后進(jìn)行Western blotting分析。

1.7 嵌合分泌型IgA抗體的Western blotting分析

1.7.1 還原SDS-PAGE分析

免疫沉淀的蛋白樣品進(jìn)行還原SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF上，分別對SIgA的4個多肽鏈進(jìn)行檢測，一抗分別為鼠抗人 Kappa 鏈 (1∶1 500)、α鏈 (1∶2 000)、SC (1∶2 000) 和 IgJ (1∶2 000) 的單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶3 000)，以ECL顯色。

1.7.2 非還原SDS-PAGE分析

免疫沉淀的蛋白樣品進(jìn)行非還原 SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到 PVDF上，然后利用鼠抗人的 SC(1∶3 000) 單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測，二抗為辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶3 500)，以ECL顯色。Western blotting印跡操作詳見參考文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 人-鼠嵌合SIgA抗體分泌片SC表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過“全長質(zhì)?？焖俣c突變技術(shù)”，該方法是利用PCR一步定點突變，以pcDNA4-pIgR為模板，使用高保真的DNA聚合酶擴(kuò)增全長質(zhì)粒，并將目的基因pIgR胞內(nèi)區(qū)部分突變，PCR產(chǎn)物磷酸化、自連、轉(zhuǎn)化最終篩選陽性克隆pcDNA4-SC。用PVUⅡ消化pcDNA4-SC，產(chǎn)生3 378 bp、1 748 bp、1 275 bp和699 bp四條DNA條帶 (圖4)，測序表明成功獲得目標(biāo)序列。

圖4 SC表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 4 Restriction of SC expression plasmid. 1, 2, 3: SC expression plasmid; M: DNA molecular weight marker 1 kb ladders.

2.2 人-鼠嵌合SIgA抗體IgJ表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切PGEM-T-Easy-IgJ，回收IgJ基因片段，插入以Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切的哺乳動物表達(dá)載體pcDNA4/His A中，構(gòu)建了質(zhì)粒pcDNA4-IgJ。該重組質(zhì)粒經(jīng) NcoⅠ酶切鑒定，產(chǎn)生3 443 bp、2 042 bp和220 bp三條DNA條帶 (圖5)；進(jìn)一步對該克隆的測序鑒定，說明成功插入目的基因。

2.3 嵌合分泌型IgA單克隆細(xì)胞系的PCR鑒定

將篩選得到的 SIgA單克隆細(xì)胞系提取全基因組DNA，利用載體和IgJ基因、SC基因內(nèi)部特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增分別得到445 bp和566 bp的目的片段 (圖6、圖7)，證明IgJ基因、SC基因已整合到CHO細(xì)胞基因組中。

圖5 IgJ表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 5 Indentification of recombinant IgJ expression plasmid.IgJ: IgJ expression plasmid. M1: DNA molecular weight marker 1 kb ladders; M2: DNA molecular weight marker DL2000Plus.

圖6 SC基因的PCR鑒定Fig. 6 PCR analysis of SC gene. 1,2: PCR product of SC gene.M: DNA molecular weight marker DL2000Plus.

圖7 IgJ基因的PCR鑒定Fig. 7 PCR analysis of IgJ gene. 1,2: PCR product of IgJ gene.M: DNA molecular weight marker DL2000Plus.

2.4 嵌合分泌型IgA抗體的Western blotting分析

2.4.1 還原SDS-PAGE分析

免疫沉淀得到的 SIgA蛋白樣品進(jìn)行還原SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上做 Western blotting分析，結(jié)果顯示SIgA中包括重鏈 (55 kDa)、輕鏈 (25 kDa)、SC (66 kDa) 和 IgJ (17 kDa) 四種多肽鏈大小與陽性對照 (唾液，saliva) 一致 (圖8)。

圖8 重組SIgA抗體Western blotting鑒定Fig. 8 Western blotting analysis of recombinant SIgA. (A) Heavy chain. 1: positive control (saliva); 2: SIgA immunoprecipitation.(B) Kappa light chain. 1: SIgA immunoprecipitation; 2: positive control. (C) SC. 1: SIgA immunoprecipitation; 2: positive control (saliva IP). (D) IgJ. 1: SIgA immunoprecipitation; 2:positive control.

2.4.2 非還原SDS-PAGE分析

免疫沉淀得到的 SIgA蛋白樣品進(jìn)行非還原SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上做 Western blotting分析，一抗為鼠抗人SC (1∶3 000) 的單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶3 000)，經(jīng)ECL發(fā)光顯示出3條大小約為 66 kDa (SC)、160 kDa、400 kDa (SIgA 全分子) 的條帶，與陽性對照 (唾液，saliva) 一致 (圖 9)，證明我們成功表達(dá)出了具有十聚體形式的 SIgA抗體分子。

圖9 重組SIgA抗體非還原Western blotting鑒定Fig. 9 Western blotting analysis of recombinant SIgA under nonreducing conditions. 1: SIgA immunoprecipitation; 2:positive (saliva).

3 討論

由于禽流感是一種呼吸道傳染病，其感染途徑主要是呼吸道或消化道，通過粘膜侵入，因此在病毒感染發(fā)生的最早階段采取措施，極可能最有效地抵抗病毒的感染，用最少的藥物達(dá)到最大的效果。SIgA 是外分泌液中存在的一種主要抗體，是呼吸道、消化道、泌尿生殖道和乳汁中抵御病原體及有害物質(zhì)的第一道免疫防線，是機(jī)體粘膜免疫最重要的抗體，具有很強(qiáng)的抗感染能力[10]。分泌型IgA通過滴鼻/噴霧或口服/灌胃即可給藥，無需注射，這樣的用藥方式更加安全和方便。而且因為是局部使用，使用劑量較小，成本較低。

抗體的高效表達(dá)技術(shù)是抗體工程研究的一個關(guān)鍵技術(shù)，提高單個細(xì)胞單位時間抗體表達(dá)量和提高發(fā)酵體積和細(xì)胞密度是提高抗體表達(dá)量的 2個關(guān)鍵的步驟和因素，同時也是 2個相互關(guān)聯(lián)和相互影響的環(huán)節(jié)，優(yōu)化系統(tǒng)提高抗體產(chǎn)量是一個極其復(fù)雜的系統(tǒng)工程，不僅要考慮基因的選擇、載體的構(gòu)建、基因整合的位置、表達(dá)調(diào)控序列的功能，而且要考慮細(xì)胞的生長速度、抗凋亡能力、生存活力、代謝特性、營養(yǎng)狀況等復(fù)雜因素。通過借鑒國外先進(jìn)的抗體高效表達(dá)經(jīng)驗，我們將采用強(qiáng)啟動子、絕緣子、優(yōu)化密碼子、抗凋亡、促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、改善細(xì)胞代謝狀況等措施提高抗體表達(dá)量，這將是我們下一步的主要工作內(nèi)容。

本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)和分泌SIgA的CHO細(xì)胞系，并通過PCR和Western blotting分析，檢測到本實驗室構(gòu)建的SIgA穩(wěn)定CHO細(xì)胞系表達(dá)的SIgA由重鏈、輕鏈、分泌片和 J鏈構(gòu)成，能穩(wěn)定分泌嵌合 SIgA，而且表達(dá)的重鏈、輕鏈、J鏈、分泌片與天然SIgA大小一致，為進(jìn)一步建立高效表達(dá)SIgA抗體的細(xì)胞系和開發(fā)出針對H5N1 高致病性禽流感的預(yù)防性SIgA 抗體制劑奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] WHO. Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO. http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2 010_03_29/en/index.html, 2010.

[2] Corthésy B. Recombinant immunoglobulin A: powerful tools for fundamental and applied research. Trends Biotechnol, 2002, 20(2): 65?71.

[3] Ma JK, Hikmat BY, Wycoff K, et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans. Nat Med, 1998,4(5): 601?606.

[4] Dallas SD, Rolfe RD. Binding of Clostridium difficile toxin A to human milk secretory component. J Med Microbiol, 1998, 47(10): 879?888.

[5] Phalipon A, Cardona A, Kraehenbuhl JP, et al. Secretory component: a new role in secretory IgA-mediated immune exclusion in vivo. Immunity, 2002, 17(1): 107?115.

[6] Zhang BZ, An XP, Zhang X, et al. Clonging of genes by genomic DNA splicing for secretory IgA production.China Biotechnol, 2008, 28(6): 1?6.

張寶中, 安小平, 張昕, 等. 用基因組DNA剪接技術(shù)克隆SIgA相關(guān)基因. 中國生物工程雜志, 2008, 28(6): 1?6.

[7] Zhang BZ, Ran DL, Zhang X, et al. Rapid site-directed mutagenesis on full-length plasmid DNA by using designed restriction enzyme assisted mutagenesis. Chin J Biotech, 2009, 25(2): 306?312.

張寶中, 冉多良, 張昕, 等. 用 DREAM 技術(shù)進(jìn)行全長質(zhì)?？焖俣c突變. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(2):306?312.

[8] Zhang BZ, Zhang X, Chen WR, et al. Construction of anti-H5N1 virus chimeric IgA antibody gene and its expression in CHO cells. Chin J Biotech, 2009, 25(5):714?719.

張寶中, 張昕, 陳萬榮, 等. 抗H5N1病毒嵌合IgA抗體基因的構(gòu)建及其在CHO細(xì)胞中的表達(dá). 生物工程學(xué)報,2009, 25(5): 714?719.

[9] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 880?897.

[10] Hammarstr?m L, Weiner CK. Targeted antibodies in dairy-based products. Adv Exp Med Biol, 2008, 606:321?343.

Expression of anti-avian influenza virus H5N1 secretory IgA in Chinese hamster ovary cells

Cun Li, Baozhong Zhang, Xiaoping An, Zhiqiang Mi, Dabin Liu, Huanhuan Jiang, Bo Pan,Sheng Wang, Bin Chen, Fen Huang, Juan Wang, Xiaona Wang, and Yigang Tong
State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China

Received: June 3, 2010; Accepted: October 15, 2010

Supported by: Program of Shanghai Subject Chief Scientist (A type) (No. 10XD1403500), Scientific Research Priming Foundation of Shanghai Public Health Clinical Center (No. KSF0268).

Corresponding author: Xiaoyan Zhang. Tel: +86-20-37990333-7310; Fax: +86-20-57247094; E-mail: zhang_xycn2002@yahoo.com.cn

上海市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人計劃 (A類) (No. 10XD1403500)，上海市公共衛(wèi)生臨床中心科研啟動基金 (No. KSF0268) 資助。