• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人體黏膜活組織模型在HIV-1性傳播途徑感染中的應(yīng)用

    2011-09-29 07:26:20楊瑜張曉燕
    生物工程學(xué)報(bào) 2011年2期
    關(guān)鍵詞:包皮陰道黏膜

    楊瑜,張曉燕,2

    1 上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508

    2 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,上海 201508

    人體黏膜活組織模型在HIV-1性傳播途徑感染中的應(yīng)用

    楊瑜1,張曉燕1,2

    1 上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508

    2 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,上海 201508

    性傳播途徑已經(jīng)成為全球人免疫缺陷病毒1型 (Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1) 傳播的主要方式。對(duì)HIV-1黏膜感染機(jī)制的深入理解,將有助于研發(fā)新型有效的生物技術(shù)阻斷其感染和傳播。目前,HIV-1黏膜感染機(jī)制的研究主要依賴于體外細(xì)胞培養(yǎng)和靈長類動(dòng)物模型。近年來,一種新型黏膜活組織模型 (包括人體生殖道或腸道黏膜等組織) 的建立,可再現(xiàn)HIV-1突破黏膜屏障進(jìn)入基底側(cè)的生物學(xué)過程,適用于 HIV-1黏膜感染機(jī)制與黏膜局部感染阻斷生物技術(shù)的臨床前有效性評(píng)價(jià)研究。以下主要闡述了該模型的組織類型、技術(shù)特點(diǎn)以及在 HIV-1性途徑感染機(jī)制與阻斷技術(shù)研究中的進(jìn)展,并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室工作對(duì)其新的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

    人免疫缺陷病毒1型,性傳播,組織培養(yǎng),模型應(yīng)用

    Abstract:Sexual transmission has become the major route of acquiring human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) globally.Understanding the mechanism of HIV-1 mucosal infection will be helpful for development of new effective strategies to block HIV-1 mucosal transmission. Currently, study of the mechanism of HIV-1 mucosal infection majorly depends on in vitro cell culture systems and non-human primate animal models. Recently, a novel tissue explant model (including human vaginal-genital and colorectal tissue) was established, which could elucidate the biological process of HIV-1 mucosal infection from crossing over the membrane to reaching the basal. Therefore, the model can be applied to the study of mechanism, as well as the safety and efficacy evaluation in pre-clinical study of biomedical prevention strategies. In this review, we summarized the recent progress about human mucosal explants model including the sources of tissues, technical characteristics and their application to study the mechanism of HIV-1 sexual transmission and evaluation of prevention strategies. Based on our recent study results, we also provided our opinions aboutdevelopment of novel explant models and their application.

    Keywords:human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), sexual transmission, mucosal infection, explants culture model

    在全世界范圍內(nèi)有將近一半的 HIV-1感染者是婦女,她們大多通過異性性接觸而感染HIV-1[1];另一方面經(jīng)同性性接觸而感染 HIV-1的男男同性戀人群 (Men who have sex with men,MSM) 的比例近年來也在迅速地增長[2];總體來看,經(jīng)性接觸傳播已經(jīng)成為全球HIV-1疫情難以控制的主要原因。我國HIV-1新發(fā)感染上升的趨勢(shì)依然難以遏制。2007年新發(fā)感染者中56.9%為經(jīng)性途徑感染,2009年已經(jīng)上升為70%,性傳播已成為我國HIV-1感染與傳播的主要途徑,促使HIV-1從高危人群向一般人群擴(kuò)散[3]。

    黏膜感染 HIV-1過程中包括生殖道途徑和直腸途徑,研究表明病毒從生殖道部位侵襲到建立系統(tǒng)感染一般需要3~4 d的時(shí)間[4]。而相關(guān)的病毒侵入與感染黏膜的機(jī)制都存在很多不明之處:例如 HIV-1病毒是以游離病毒還是以細(xì)胞內(nèi)病毒的形式感染宿主黏膜細(xì)胞?病毒是如何穿越宿主的黏膜屏障進(jìn)入黏膜下組織?病毒在黏膜感染的初始靶細(xì)胞是什么?HIV-1進(jìn)入黏膜后,黏膜的早期免疫反應(yīng)是抑制病毒還是給病毒更多機(jī)會(huì)增殖?從HIV-1進(jìn)入生殖道或直腸到建立系統(tǒng)的全身感染,有哪些宿主的細(xì)胞以及因子與之相互作用?哪些時(shí)點(diǎn)和分子可以成為新的生物預(yù)防技術(shù)的靶點(diǎn)?上述疑惑嚴(yán)重制約了有效的 HIV-1黏膜生物預(yù)防技術(shù)包括疫苗和殺微生物劑的研究。

    早期的感染機(jī)制研究,多采用體外細(xì)胞培養(yǎng)和靈長類動(dòng)物模型研究。感染 SHIV嵌合病毒的非人靈長類動(dòng)物模型可很好再現(xiàn) HIV-1宿主感染的生物學(xué)過程,但是動(dòng)物的購買費(fèi)用昂貴且感染實(shí)驗(yàn)需在大動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展,難以廣泛應(yīng)用。在細(xì)胞水平,體外HIV-1感染多采用可永生傳代的細(xì)胞系 (Caco2、Jurkat細(xì)胞等),與正常人體細(xì)胞有較大差異;而人PBMC則需要外源激活劑 (PHA等)來維持HIV-1在其中的復(fù)制,也明顯改變了細(xì)胞表面分子的標(biāo)記,加之細(xì)胞種類單一,都不足以模擬正常黏膜中的靶細(xì)胞及其所處的微環(huán)境。因此,有關(guān)HIV-1黏膜感染的機(jī)制研究,以及對(duì)近年來應(yīng)用于局部阻斷或抑制HIV-1感染的殺微生物劑等預(yù)防手段的安全性和有效性評(píng)價(jià)一直缺乏經(jīng)濟(jì)有效的模型。

    為深入探索HIV-1黏膜侵入與感染的機(jī)制,研究人員近年來嘗試建立了一種新型的人體活組織體外培養(yǎng)模型。其組織來源可來自女性生殖道或者男性生殖器組織、口腔黏膜以及結(jié)直腸黏膜組織。本文將就上述活組織體外培養(yǎng)模型的特點(diǎn)以及在HIV-1性傳播途徑感染研究中的應(yīng)用加以綜述。

    1 活組織培養(yǎng)的起源

    組織培養(yǎng)是指組織在體外條件下的存活或生長。動(dòng)物組織培養(yǎng)的技術(shù)起源于19世紀(jì)所應(yīng)用的若干胚胎學(xué)技術(shù)。1907年美國胚胎學(xué)家Harrison的蛙胚神經(jīng)管組織實(shí)驗(yàn)成為組織培養(yǎng)真正開始的標(biāo)志[5]。20世紀(jì)50年代,隨著操作技術(shù)、培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基的改進(jìn),組織培養(yǎng)技術(shù)得到更快的發(fā)展。

    組織培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以在組織上和功能上保持一定程度的分化,這樣就為實(shí)驗(yàn)生物學(xué)提供了既處于一定的組織結(jié)構(gòu)之中又脫離了體內(nèi)種種復(fù)雜因素的細(xì)胞群體。但在經(jīng)典的組織培養(yǎng)技術(shù)中,由于細(xì)胞常常從培養(yǎng)物中向外遷移,因此培養(yǎng)物很快便失去了它們的組織分化特性。后來采用把組織放置在細(xì)胞難以粘附的表面上,減少支持物與組織的接觸面積,以及把組織包埋于瓊脂中等方法,大大減少了細(xì)胞遷移現(xiàn)象,從而達(dá)到限制生長,使器官專一細(xì)胞同它們的基質(zhì)細(xì)胞維持相對(duì)正常的結(jié)構(gòu)關(guān)系的目的。

    2 模型應(yīng)用的組織類型與來源

    HIV-1黏膜感染主要涉及的組織類型有子宮頸陰道[6]、包皮[7]和直腸乙狀結(jié)腸[8]等。按組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為單層柱狀上皮類 (結(jié)直腸、子宮頸內(nèi)膜等) 與復(fù)層鱗狀上皮類 (陰道、子宮頸外膜、包皮等),組織的不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了HIV-1進(jìn)入機(jī)制的差異,例如專屬于單層柱狀上皮細(xì)胞的胞轉(zhuǎn)作用等。

    子宮頸陰道組織多來自絕經(jīng)期前婦女的子宮切除術(shù)或陰道修補(bǔ)術(shù)后的標(biāo)本[9];子宮切除術(shù)常見于子宮多發(fā)性肌瘤,而陰道修補(bǔ)術(shù)因?qū)僬晤愂中g(shù),受地域、經(jīng)濟(jì)因素影響大,目前國內(nèi)開展較少。

    直腸乙狀結(jié)腸組織有幾種來源:活檢組織、腫瘤患者癌旁組織以及直腸脫垂患者組織?;顧z標(biāo)本可通過內(nèi)窺鏡直視,獲取特異部位的黏膜組織,但活檢機(jī)械手臂咬合組織時(shí)容易傷及黏膜表面,而且總量較少,一個(gè)患者最多可獲20塊活檢組織[10],相較而言腫瘤患者和直腸脫垂患者手術(shù)后獲得的黏膜組織面積大,可滿足較多需求,提高了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性,是目前較為常用的組織來源。

    包皮組織絕大多數(shù)是因包皮過長進(jìn)行的環(huán)切手術(shù)獲得,一般患者年齡偏低 (青少年),極少合并其他重大疾病,是上述各類組織來源中最接近體內(nèi)正常組織生理狀態(tài)的一種。

    3 HIV-1黏膜感染模型培養(yǎng)技術(shù)特點(diǎn)

    活組織培養(yǎng)的方式,有的是直接將組織標(biāo)本塊修剪,進(jìn)行培養(yǎng),其培養(yǎng)技術(shù)包括支撐筏 (Rafts)、Transwell等[10-11];也有的是用消散的細(xì)胞進(jìn)行組織重建,構(gòu)成黏膜的片層,再現(xiàn)上皮細(xì)胞的特征。

    3.1 活組織整體培養(yǎng)

    目前國際上有幾家實(shí)驗(yàn)室相繼開展了人體活組織培養(yǎng)在 HIV-1感染中的應(yīng)用研究。他們基于前人發(fā)展的組織培養(yǎng)技術(shù),結(jié)合HIV-1性途徑感染特點(diǎn),研究建立HIV-1感染相關(guān)的黏膜組織模型。1992年,F(xiàn)leming等為確認(rèn)HIV-1能否直接感染人腸道黏膜而不是腸道細(xì)胞系,將胎兒腸黏膜剪切成塊 (2 mm3)放入培養(yǎng)基進(jìn)行了培養(yǎng)及感染實(shí)驗(yàn),這是較為早期的涉及黏膜體外培養(yǎng)進(jìn)行HIV-1感染的嘗試[12]。

    3.1.1 支撐筏模型 (Rafts)

    Shattock等將宮頸活檢組織鉆取成3 mm或8 mm直徑大小,黏膜面向上置于24板內(nèi)的方形不銹鋼網(wǎng)支架上,加入培養(yǎng)基使其圍繞支架形成新月形的氣-液界面,讓黏膜表面暴露于空氣,而其底部則可透過不銹鋼網(wǎng)格孔與培養(yǎng)基接觸從而保證汲取營養(yǎng)。其后,人們?cè)囉酶鞣N材質(zhì)的支撐物對(duì)黏膜進(jìn)行培養(yǎng)[11],如濾紙、Millipore濾膜、吸收性明膠海綿等,最終認(rèn)為吸收性明膠海綿效果更有利于組織存活 (圖 1A)[10]。

    3.1.2 Transwell類模型

    該類模型依據(jù)Transwell小室建立,其外形為一個(gè)可放置在孔板里的小杯子,并采用通透性濾膜作杯底。Collins等[13]的模型中,將人宮頸復(fù)層鱗狀上皮組織黏膜面向上放入上室濾膜,用瓊脂糖凝膠灌注封閉黏膜四周,讓病毒只能接觸中心未封閉的黏膜表面 (圖1B)。Cummins等[14]發(fā)展的組織極化模型不同之處是將Transwell上室濾膜鉆孔,組織塊從孔中穿越,把黏膜層露在上室而基底部跨過濾膜浸入下室培養(yǎng)基中 (圖1C)。兩種模型異曲同工,都是只把黏膜面暴露于可接觸病毒的環(huán)境,近似的模擬生理狀態(tài)下HIV-1在女性生殖道內(nèi)感染的過程。但在實(shí)際操作中也暴露出一些問題,如本實(shí)驗(yàn)室曾用該類模型,發(fā)現(xiàn)在安全柜中操作時(shí)無法垂直注視小室,向其中灌注凝膠時(shí)用量較難把握:凝膠過多會(huì)將黏膜面一起封閉,少則封閉不嚴(yán)發(fā)生病毒泄漏;而Shen等[15]的模型則逆向思維,解決了這一問題 (圖1D):他們將黏膜組織切成1 cm2大小,放入鋪有尼龍濾網(wǎng)的上室中,在黏膜面上放置一個(gè)直徑0.6 cm、高1 cm的聚丙烯小桶作為感染用“上室”,然后用外科膠將小桶四周的黏膜面及暴露組織全部封閉,這樣可灌注足夠量的凝膠而不必?fù)?dān)心黏膜面被覆蓋。在感染實(shí)驗(yàn)中相比兩類方法可以看到,前者的黏膜用

    圖1 組織整體培養(yǎng)模型:Rafts模型 (A)[10]和Transwell模型 (B,C,D)[13-15]Fig. 1 The models of whole tissue culture: Rafts model (A) and Transwell models (B, C, D).

    量較小,但對(duì)凝膠封閉操作技術(shù)要求高,且封閉后各實(shí)驗(yàn)孔間暴露的黏膜面積難以保持均一,這有可能導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)孔的病毒因接觸的黏膜面積及靶細(xì)胞的數(shù)量不同而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生影響;后者應(yīng)用直徑統(tǒng)一的聚丙烯小桶作為上室,保證了黏膜與病毒的接觸面積相同,同時(shí)該做法使凝膠封閉也易于操作,不足之處是模型中每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔對(duì)完整的組織黏膜用量都提高了近2~3倍,在一定程度上限制了實(shí)驗(yàn)規(guī)模。

    3.2 活組織片層或細(xì)胞重建組織層培養(yǎng)

    黏膜感染 HIV-1后,上皮層內(nèi)的粒細(xì)胞和郎格罕氏細(xì)胞 (Langerhans cells,LCs) 短時(shí)即可遷移出來,檢測(cè)培養(yǎng)基中遷移細(xì)胞可以觀察HIV-1的感染率,但活組織的整體培養(yǎng)無法確認(rèn)細(xì)胞來源于上皮層還是基質(zhì)層?因此,McElrath教授的課題組采用一種體外器官活組織片層培養(yǎng)技術(shù)[9],利用真空負(fù)壓吸引或EDTA低溫處理過夜的方法較為溫和的分離上皮層與基質(zhì)層,能保持上皮層的完整結(jié)構(gòu)和活力。也有的采用消散的細(xì)胞或細(xì)胞系進(jìn)行組織重建,構(gòu)成黏膜的片層,再現(xiàn)上皮細(xì)胞的特征。如Bouschbacher等[16]即利用人原代成纖維細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞共同重構(gòu)陰道黏膜層,特異性觀察整合進(jìn)去的LCs在HIV-1感染中的作用,避免了T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的“干擾”。Nazli等[17]將原代女性生殖道上皮細(xì)胞等建成緊密的單細(xì)胞層,以此驗(yàn)證 HIV-1感染對(duì)黏膜屏障的損傷作用。此類模型雖然將組織微環(huán)境趨于簡(jiǎn)單化,與體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境有一定差異,卻更有利于觀察特定區(qū)域或特定細(xì)胞在HIV-1感染前后的變化。

    4 在機(jī)制研究和生物預(yù)防技術(shù)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

    4.1 黏膜感染機(jī)制研究

    HIV-1侵入完整黏膜的途徑包括:通過LCs、樹突狀細(xì)胞 (Dendritic cells,DCs)、M細(xì)胞 (Microfold cell) 等的捕捉式跨上皮運(yùn)輸方式[18-19],或經(jīng)與上皮細(xì)胞的半乳糖神經(jīng)酰胺 (Galactosyl ceramide) 等受體結(jié)合被轉(zhuǎn)運(yùn)穿越上皮細(xì)胞層[20]。穿越黏膜的病毒可直接感染固有層的 CD4+T細(xì)胞,或與表達(dá)DC-SIGN受體的DCs結(jié)合,通過順式感染或反式感染的方式進(jìn)行傳播:即一種方式是在DCs中建立感染進(jìn)行復(fù)制,并利用產(chǎn)生的子代病毒感染CD4+T等靶細(xì)胞;另一種方式則以DCs為載體被直接運(yùn)載去感染CD4+T細(xì)胞[21]。

    以上機(jī)制研究多采用動(dòng)物或細(xì)胞模型。與這些模型相比,組織模型的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可在HIV-1急性感染期進(jìn)行多點(diǎn)連續(xù)采樣進(jìn)行免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、電鏡等損傷性檢測(cè),對(duì)HIV-1進(jìn)入黏膜的生物學(xué)軌跡進(jìn)行跟蹤研究,同時(shí)又不失其在體內(nèi)復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)。對(duì)于病毒進(jìn)入的時(shí)間,采用人的宮頸陰道活組織培養(yǎng)體系觀察HIV-1初始感染期的研究顯示[22],HIV-1臨床分離病毒株接種3~4 d,在宮頸黏膜下層出現(xiàn)許多感染細(xì)胞,4~6 d后在組織檢測(cè)到感染的白細(xì)胞。而感染損傷的組織,則最早 3 d即可檢測(cè)到感染的白細(xì)胞。Gupta小組的研究則進(jìn)一步顯示宮頸組織感染后6 h黏膜下層即可檢測(cè)到HIV-1陽性細(xì)胞,并確認(rèn)為記憶性 CD4+T細(xì)胞;96 h后HIV-1陽性LCs與巨噬細(xì)胞才被檢測(cè)到[23]。

    在生殖道,通過活組織片層的感染研究發(fā)現(xiàn),HIV-1一旦接觸局部黏膜可迅速滲透上皮內(nèi)LCs 和CD4+T細(xì)胞。HIV-1進(jìn)入CD4+T細(xì)胞幾乎完全是由CD4和CCR5 受體介導(dǎo)的直接融合方式,無需LCs細(xì)胞傳遞病毒。而HIV-1進(jìn)入CD1a+ LCs 細(xì)胞則主要通過細(xì)胞內(nèi)吞 (Endocytosis) 作用,借助于多種受體[9]。在Saba等的宮頸陰道組織模型研究中,感染的T細(xì)胞均為表達(dá)CCR5的效應(yīng)記憶T細(xì)胞。盡管有廣泛表達(dá)CXCR4受體,但絕大多數(shù)組織仍只支持CCR5嗜性HIV-1病毒的復(fù)制[24],當(dāng)單獨(dú)阻斷CD4或同時(shí)阻斷CXCR4與CCR5受體時(shí)可局部抑制病毒的黏膜感染[25]。此外,支持 CXCR4嗜性病毒復(fù)制的組織擁有一個(gè)共同特征——富含 CD27+CD28+效應(yīng)記憶T細(xì)胞[24]。

    進(jìn)入黏膜后的病毒如欲進(jìn)一步傳播,離不開組織中細(xì)胞的遷移作用,同時(shí)阻斷 CD4與 DC-SIGN可抑制遷移細(xì)胞對(duì)HIV-1的攝取與傳播。流式分析與免疫染色遷移細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)兩群細(xì)胞:CD3+HLA-DR-和CD3-HLA-DR+細(xì)胞,后者顯著表達(dá)DC-SIGN。研究顯示這些HLA-DR+細(xì)胞90%與HIV傳播相關(guān)[25]。

    在對(duì)宮頸與包皮組織中免疫細(xì)胞進(jìn)行比較研究時(shí),Petterson等[26]發(fā)現(xiàn)成人包皮黏膜中 CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、郎罕氏細(xì)胞的比例分別達(dá) 22.4%、2.4%和11.5%,遠(yuǎn)高于兒童包皮組織 (4.9%、0.3%、6.2%) 和婦女的宮頸組織 (6.2%、1.4%、1.5%)。與宮頸黏膜或包皮的外表面組織相比,包皮內(nèi)側(cè)黏膜對(duì)HIV-1 BaL (R5嗜性) 有顯著的易感性。此外,外源的刺激可改變組織中細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)、TNF-α處理可將靜息LCs激活,這些都只發(fā)生在內(nèi)側(cè)包皮而非外側(cè)包皮[27],這部分解釋了為什么包皮環(huán)切術(shù)可以降低人群中HIV-1的感染率[28-29]。

    近年來,由于MSM人群HIV-1感染顯著上升,腸道黏膜在HIV-1傳播與病理中扮演的作用日益受到重視。但是關(guān)于腸道黏膜HIV-1感染的機(jī)制缺乏深入的研究。生殖道黏膜與腸道黏膜的生理結(jié)構(gòu)、組織細(xì)胞構(gòu)成以及微生態(tài)環(huán)境均存在很大的差異性。例如同樣的巨噬細(xì)胞在生殖道和腸道中對(duì)HIV-1感染易感性也存在很大的差異性。有報(bào)告稱陰道和腸道的巨噬細(xì)胞表達(dá)不同水平的免疫受體及 HIV-1受體CD4與輔助受體CCR5、CXCR4。病毒穿越黏膜上皮后,是陰道而不是腸道巨噬細(xì)胞允許 R5 HIV-1復(fù)制[30]。HIV-1腸道黏膜感染的機(jī)制包括首感細(xì)胞與遷徙軌跡則存在更多亟待探索的問題。

    4.2 評(píng)價(jià)生物預(yù)防技術(shù)的安全性與有效性

    評(píng)價(jià)殺微生物劑的安全性與有效性也是上述人體黏膜活組織模型最初建立的目的之一[10,13]。由于第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的抗HIV-1廣譜殺微生物劑——壬苯醇醚 (Nonoxynol-9,N-9),沒有顯示出預(yù)期的保護(hù)效果,通過兔子陰道模型人們發(fā)現(xiàn),臨床劑量的N-9對(duì)黏膜有較大的毒性損傷,破壞上皮屏障,誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生,從而導(dǎo)致HIV-1感染率不降反升[31]。因此在用組織模型進(jìn)行殺微生物劑評(píng)價(jià)之初,常用N-9作為對(duì)照,以觀測(cè)黏膜對(duì)藥物毒性的靈敏度。由于陰道與腸道組織的差異性,陰道用殺微生物劑能否安全有效的用于腸道需要重新進(jìn)行評(píng)估。在Fletcher等[10]的結(jié)直腸模型中,評(píng)價(jià)的6種殺微生物劑在1 mg/mL的最高劑量時(shí)均沒有顯示出對(duì)組織的毒性作用,與之形成鮮明對(duì)照的是,同樣濃度的N-9已讓組織活性降低至69%。其中第1代殺微生物劑(多聚陰離子聚合物) 中的 PRO2000與硫酸糊精(Dextrin sulphate) 分別在陰道用藥劑量的1/5 000和1/40時(shí)即可達(dá)到99%的保護(hù)。第2代殺微生物劑 (逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑) 中 PMPA (9-[2-(phosphonomethoxy)peopyl]adenine) 可有效抑制病毒的劑量也只有陰道制劑的 1%。同時(shí)在宮頸、包皮等組織上的驗(yàn)證,也顯示出PRO2000等殺微生物劑在安全劑量范圍內(nèi)具有病毒抑制效果[7,32-33]。

    由于組織模型感染無法像細(xì)胞模型那樣控制病毒的靶細(xì)胞數(shù)量,病毒在其中的復(fù)制生長受到組織類型、培養(yǎng)方式、病毒接種等眾多因素的影響,這將影響對(duì)殺微生物劑評(píng)價(jià)結(jié)果的可重復(fù)性與可信度,實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果也難以比較。為此,Richardson-Harman等[34]報(bào)道了一種較為客觀檢測(cè)病毒生長狀況及評(píng)價(jià)候選殺微生物劑的軟終點(diǎn)法 (Soft-endpoint)。病毒生長曲線可分為 4個(gè)階段:停滯期、指數(shù)增長期、穩(wěn)定期和衰退期。軟終點(diǎn)法是指無論病毒復(fù)制水平高低,都將其在組織內(nèi)生長的穩(wěn)定期作為時(shí)間截取點(diǎn)進(jìn)行 p24等檢測(cè)與統(tǒng)計(jì),這樣便于分析和比較不同實(shí)驗(yàn)室得到殺微生物劑臨床前比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,減少固有偏差。利用該方法判斷病毒在直腸組織模型中生長的變異性最大。同時(shí)在該方法中病毒原始株及其進(jìn)化分支是影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵參數(shù),雖然組織類型與模型差異也是影響病毒復(fù)制的非常重要的參數(shù),但若使用同一類型組織時(shí),實(shí)驗(yàn)室間仍可以用p24水平及IC50來進(jìn)行可靠的藥效比較。

    5 本實(shí)驗(yàn)室的活組織培養(yǎng)進(jìn)展

    本實(shí)驗(yàn)室已開展了包括結(jié)、直腸、包皮等組織來源的Rafts和Transwell培養(yǎng)模型。通過Rafts模型在對(duì)腸道黏膜的培養(yǎng)中,HE染色觀察第5天組織結(jié)構(gòu)依然良好,13 d時(shí)黏膜結(jié)構(gòu)依然可見。經(jīng)MTT法檢測(cè)培養(yǎng)10 d內(nèi)的組織活性,顯示培養(yǎng)4 d時(shí)組織活性高于80%,7 d的活性可保持在50%左右,包皮培養(yǎng)存活狀態(tài)優(yōu)于腸道黏膜,與其他實(shí)驗(yàn)室相比,本實(shí)驗(yàn)對(duì)腸道組織與包皮組織的培養(yǎng)無論組織結(jié)構(gòu)的完整性保持或高活性的培養(yǎng)時(shí)間均優(yōu)于已有的報(bào)道[7,10],建立的組織模型可以滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。

    藥物的臨床前安全性與有效性評(píng)價(jià)首先要求評(píng)價(jià)模型具有一定的敏感性,本實(shí)驗(yàn)室用10倍濃度梯度的N-9分別與結(jié)腸黏膜孵育,發(fā)現(xiàn)黏膜活性隨N-9濃度的升高而降低,即使將梯度差減小至3倍,黏膜依然可以靈敏地反映出藥物的毒性變化。此外,對(duì)臨床試驗(yàn)中證明安全的幾種抗HIV-1 藥物進(jìn)行平行觀察,對(duì)組織活性的影響較小,而對(duì)照N-9組活性明顯降低。

    6 展望

    人體組織培養(yǎng)模型中的組織塊是在脫離了機(jī)體的情況下獨(dú)立生存,因此得出的研究結(jié)果還不能與人體感染的真實(shí)情況完全等同,這點(diǎn)需要在數(shù)據(jù)分析中予以注意。同時(shí),組織培養(yǎng)模型還存在著一些爭(zhēng)議和需要解決的問題,例如,組織來源的背景資料、抗生素等對(duì)組織激素水平的影響、靶細(xì)胞數(shù)量、結(jié)果的分析等[35-37]。但不可否認(rèn)的是,組織培養(yǎng)模型,尤其是人體組織來源的模型在 HIV-1性途徑感染的研究中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。

    未來,模型的構(gòu)建和應(yīng)用仍有較大的拓展空間。首先,隨著研究目的不同,組織來源將不局限于現(xiàn)有類型。其次,現(xiàn)有組織培養(yǎng)技術(shù)可進(jìn)一步完善,如借鑒臨床外科的器官移植取材規(guī)范與體外保存技術(shù),以及對(duì)培養(yǎng)基成分的優(yōu)化調(diào)整,都將對(duì)改善組織存活狀態(tài)有較大幫助。從本實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)來看,使用器官移植保存液作為組織離體后的運(yùn)輸液能更好的保持黏膜狀態(tài);在機(jī)制研究中,可向模型中加入人體微環(huán)境存在的介質(zhì)或采用不同類型組織共同培養(yǎng)等方式以進(jìn)一步模擬真實(shí)感染環(huán)境;第三,新的應(yīng)用開發(fā)。將一些細(xì)胞或動(dòng)物模型上難以培養(yǎng)的病毒用人體組織模型進(jìn)行培養(yǎng) (例如丙肝病毒等),從艾滋病研究延伸到性傳播疾病等更廣泛的領(lǐng)域。在感染靶細(xì)胞間或受體間相互作用機(jī)制、局部免疫與炎癥等研究以及公共衛(wèi)生突發(fā)傳染病病原體的快速鑒定上進(jìn)行突破。組織水平的安全性與有效性評(píng)價(jià)范圍也可擴(kuò)展涵蓋至抗病毒藥物以外的更多的生物預(yù)防性策略 (如疫苗等),這些也將作為我們今后考慮的研究方向。

    REFERENCES

    [1] Quinn TC, Overbaugh J. HIV/AIDS in women: an expanding epidemic. Science, 2005, 308(5728):1582?1583.

    [2] Beyrer C. Global prevention of HIV infection for neglected populations: men who have sex with men. Clin Infect Dis, 2010, 50(Suppl 3): S108?113.

    [3] The Ministry of Health of the People's Republic of China,2009 Update on the HIV/AIDS Epidemic in China.2009-12-02. http://www.moh.gov.cn.

    [4] Miller CJ, Li Q, Abel K, et al. Propagation and dissemination of infection after vaginal transmission of simian immunodeficiency virus. J Virol, 2005, 79(14):9217?9227.

    [5] Harrison RG, Greenman MJ, Mall FP, et al. Observation on the living developing nerve fiber. Anat Rec, 1907, 1(5):116?128.

    [6] Wallace GS, Cheng-Mayer C, Schito ML, et al. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid inhibitors impede transinfection in cellular and explant models and protect nonhuman primates from infection. J Virol, 2009,83(18): 9175?9182.

    [7] Fischetti L, Barry SM, Hope TJ, et al. HIV-1 infection of human penile explant tissue and protection by candidate microbicides. Aids, 2009, 23(3): 319?328.

    [8] Herrera C, Cranage M, McGowan I, et al. Reverse transcriptase inhibitors as potential colorectal microbicides. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(5):1797?1807.

    [9] Hladik F, Sakchalathorn P, Ballweber L, et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity, 2007,26(2): 257?270.

    [10] Fletcher PS, Elliott J, Grivel JC, et al. Ex vivo culture of human colorectal tissue for the evaluation of candidate microbicides. AIDS, 2006, 20(9): 1237?1245.

    [11] Grivel JC, Margolis L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nat Protoc, 2009, 4(2):256?269.

    [12] Fleming SC, Kapembwa MS, MacDonald TT, et al. Direct in vitro infection of human intestine with HIV-1. AIDS,1992, 6(10): 1099?1104.

    [13] Collins KB, Patterson BK, Naus GJ, et al. Development of an in vitro organ culture model to study transmission of HIV-1 in the female genital tract. Nat Med, 2000, 6(4):475?479.

    [14] Cummins JE Jr, Guarner J, Flowers L, et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(5): 1770?1779.

    [15] Shen R, Drelichman ER, Bimczok D, et al. GP41-specific antibody blocks cell-free HIV type 1 transcytosis through human rectal mucosa and model colonic epithelium. J Immunol, 2010, 184(7): 3648?3655.

    [16] Bouschbacher M, Bomsel M, Verronese E, et al. Early events in HIV transmission through a human reconstructed vaginal mucosa. Aids, 2008, 22(11): 1257?1266.

    [17] Nazli A, Chan O, Dobson-Belaire WN, et al. Exposure to HIV-1 directly impairs mucosal epithelial barrier integrity allowing microbial translocation. PLoS Pathog, 2010,6(4): e1000852.

    [18] Sivard P, Berlier W, Picard B, et al. HIV-1 infection of Langerhans cells in a reconstructed vaginal mucosa. J Infect Dis, 2004, 190(2): 227?235.

    [19] Amerongen HM, Weltzin R, Farnet CM, et al.Transepithelial transport of HIV-1 by intestinal M cells: a mechanism for transmission of AIDS. J Acquir Immune Defic Syndr, 1991, 4(8): 760?765.

    [20] Sa?di H, Magri G, Nasreddine N, et al. R5- and X4-HIV-1 use differentially the endometrial epithelial cells HEC-1A to ensure their own spread: Implication for mechanisms of sexual transmission. Virology, 2007, 358(1): 55?68.

    [21] Kwon DS, Gregorio G, Bitton N, et al. DC-SIGN-mediated internalization of HIV is required for trans-enhancement of T cell infection. Immunity, 2002, 16(1): 135?144.

    [22] Maher D, Wu X, Schacker T, et al. HIV binding,penetration, and primary infection in human cervicovaginal tissue. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(32): 11504?11509.

    [23] Gupta P, Collins KB, Ratner D, et al. Memory CD4(+) T cells are the earliest detectable human immunodeficiencyvirus type 1 (HIV-1)-infected cells in the female genital mucosal tissue during HIV-1 transmission in an organ culture system. J Virol, 2002, 76(19): 9868?9876.

    [24] Saba E, Grivel JC, Vanpouille C, et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.Mucosal Immunol, 2010, 3(3): 280?290.

    [25] Hu Q, Frank I, Williams V, et al. Blockade of attachment and fusion receptors inhibits HIV-1 infection of human cervical tissue. J Exp Med, 2004, 199(8): 1065?1075.

    [26] Patterson BK, Landay A, Siegel JN, et al. Susceptibility to human immunodeficiency virus-1 infection of human foreskin and cervical tissue grown in explant culture. Am J Pathol, 2002, 161(3): 867?873.

    [27] Fahrbach KM, Barry SM, Anderson MR, et al. Enhanced cellular responses and environmental sampling within inner foreskin explants: implications for the foreskin's role in HIV transmission Mucosal Immunol, 2010, 3(4):410?418.

    [28] Bailey RC, Moses S, Parker CB, et al. Male circumcision for HIV prevention in young men in Kisumu, Kenya: a randomised controlled trial. Lancet, 2007, 369(9562):643?656.

    [29] Gray RH, Kigozi G, Serwadda D, et al. Male circumcision for HIV prevention in men in Rakai, Uganda: a randomised trial. Lancet, 2007, 369(9562): 657?666.

    [30] Shen R, Richter HE, Clements RH, Novak L, et al.Macrophages in vaginal but not intestinal mucosa are monocyte-like and permissive to human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol, 2009, 83(7): 3258?3267.

    [31] Hillier SL, Moench T, Shattock R, et al. In vitro and in vivo: the story of nonoxynol 9. J Acquir Immune Defic Syndr, 2005, 39(1): 1?8.

    [32] Rohan LC, Moncla BJ, Kunjara Na Ayudhya RP, et al. In vitro and ex vivo testing of tenofovir shows it is effective as an HIV-1 microbicide. PLoS One, 2010, 5(2): e9310.

    [33] Greenhead P, Hayes P, Watts PS, et al. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol,2000, 74(12): 5577?5586.

    [34] Richardson-Harman N, Lackman-Smith C, Fletcher PS, et al. Multisite comparison of anti-human immunodeficiency virus microbicide activity in explant assays using a novel endpoint analysis. J Clin Microbiol, 2009, 47(11):3530?3539.

    [35] Shattock RJ, Griffin GE. Gorodeski GI. In vitro models of mucosal HIV transmission. Nat Med, 2000, 6(6):607?608.

    [36] Gupta P, Collins K, Patterson B, et al. Reply to 'In vitro models of mucosal HIV transmission. Nat Med, 2000,6(6): 607?608.

    [37] Anderson DJ, Pudney J, Schust DJ. Caveats associated with the use of human cervical tissue for HIV and microbicide research. AIDS, 2010, 24(1): 1?4.

    [15] Khromykh AA, Sedlak PL, Westaway EG. Cis- and trans-acting elements in flavivirus RNA replication. J Virol, 2000, 74(7): 3253?3263.

    [16] Pijlman GP, Suhrbier A, Khromykh AA. Kunjin virus replicons: an RNA-based, non-cytopathic viral vector system for protein production, vaccine and gene therapy applications. Expert Opin Biol Ther, 2006, 6(2): 135?145.

    [17] Varnavski AN, Khromykh AA. Noncytopathic flavivirus replicon RNA-based system for expression and delivery of heterologous genes. Virology, 1999, 255(2): 366?375.

    [18] Anraku I, Harvey TJ, Linedale R, et al. Kunjin virus replicon vaccine vectors induce protective CD8+T-cell immunity. J Virol, 2002, 76(8): 3791?3799.

    [19] Harvey TJ, Anraku I, Linedale R, et al. Kunjin virus replicon vectors for human immunodeficiency virus vaccine development. J Virol, 2003, 77(14): 7796?7803.

    [20] Anraku I, Mokhonov VV, Rattanasena P, et al. Kunjin replicon-based simian immunodeficiency virus gag vaccines. Vaccine, 2008, 26(26): 3268?3276.

    [21] Kent SJ, Rose RD, Mokhonov VV, et al. Evaluation of recombinant Kunjin replicon SIV vaccines for protective efficacy in macaques. Virology, 2008, 374(2): 528?534.

    [22] Hoang LD, Anraku1 I, Wang XJ, et al. A Kunjun replicon vector encoding granulocyte macrophage colony-stimulating factor for intra-tumoral gene therapy. Gene Ther, 2009,16(2): 190?199.

    Application of human mucosal explants culture in the HIV-1 sexual transmission

    Yu Yang1, and Xiaoyan Zhang1,2
    1 Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China
    2 Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 201508, China

    Received: May 11, 2010; Accepted: June 25, 2010

    Supported by: Natural Science Foundation of Department of Education of Anhui Province (No. KJ2008A127), Start-up Foundation for Doctor. of Anhui University. (No. 02203105).

    Corresponding author: Honghua Ge. Tel: +86-551-5107224; Fax: +86-551-5107240; E-mail: hhge@ustc.edu

    安徽省教育廳自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. KJ2008A127),安徽大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目 (No. 02203105) 資助。

    猜你喜歡
    包皮陰道黏膜
    盆底儀在陰道分娩后尿潴留治療中的應(yīng)用
    Tiger17促進(jìn)口腔黏膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移
    男性包皮過長有什么影響
    健康博覽(2020年9期)2020-10-12 14:35:11
    包皮過長早“環(huán)切”
    內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)治療胃竇黏膜脫垂10 例臨床效果報(bào)道
    內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)在早期胃癌診療中的應(yīng)用
    婦產(chǎn)科陰道不規(guī)則出血治療探討
    粘膜下陰道緊縮術(shù)矯正陰道松弛的護(hù)理
    包莖合并包皮龜頭嚴(yán)重粘連的整形修復(fù)
    保留陰道黏膜的陰道緊縮術(shù)臨床體會(huì)
    国产精品日韩av在线免费观看 | 99国产极品粉嫩在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 一区二区三区激情视频| av中文乱码字幕在线| 妹子高潮喷水视频| 一区二区三区高清视频在线| 免费看十八禁软件| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲少妇的诱惑av| 在线观看免费午夜福利视频| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 首页视频小说图片口味搜索| 精品一品国产午夜福利视频| 日日夜夜操网爽| 免费高清在线观看日韩| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久国产成人免费| 国产av在哪里看| www.熟女人妻精品国产| 99在线人妻在线中文字幕| 韩国av一区二区三区四区| 国产高清有码在线观看视频 | 成人国产综合亚洲| 后天国语完整版免费观看| 搡老岳熟女国产| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产成人精品无人区| 黄色成人免费大全| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品久久久av美女十八| 国产99久久九九免费精品| cao死你这个sao货| 日韩成人在线观看一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产av一区在线观看免费| 大陆偷拍与自拍| 亚洲最大成人中文| 桃红色精品国产亚洲av| 日本欧美视频一区| 国产成人av激情在线播放| 久久久久久国产a免费观看| 搞女人的毛片| 久9热在线精品视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 韩国精品一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 日韩欧美在线二视频| 色播亚洲综合网| 美女免费视频网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 人妻久久中文字幕网| а√天堂www在线а√下载| 色在线成人网| 国产精品免费视频内射| 91老司机精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 男女之事视频高清在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一本大道久久a久久精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 夜夜爽天天搞| 亚洲男人天堂网一区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久 成人 亚洲| 久久草成人影院| 午夜福利在线观看吧| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 在线观看www视频免费| 最新美女视频免费是黄的| 午夜老司机福利片| 免费高清在线观看日韩| 久热这里只有精品99| 精品国产亚洲在线| 丝袜美足系列| 精品欧美一区二区三区在线| 免费看十八禁软件| or卡值多少钱| 久久亚洲精品不卡| 岛国在线观看网站| 久久影院123| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 一区福利在线观看| 老司机靠b影院| netflix在线观看网站| 正在播放国产对白刺激| 国产麻豆69| 大型av网站在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 好男人电影高清在线观看| 精品国产国语对白av| 大码成人一级视频| 高清毛片免费观看视频网站| 色综合站精品国产| 91成人精品电影| 9热在线视频观看99| 欧美一级a爱片免费观看看 | 不卡av一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| www国产在线视频色| 久久精品成人免费网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩精品青青久久久久久| 一本综合久久免费| 色av中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲五月色婷婷综合| 啦啦啦韩国在线观看视频| 99久久国产精品久久久| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲全国av大片| 国语自产精品视频在线第100页| 精品第一国产精品| 午夜老司机福利片| www.www免费av| av在线天堂中文字幕| 99热只有精品国产| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 午夜福利免费观看在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品久久久久久成人av| 禁无遮挡网站| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 中文字幕高清在线视频| 久久草成人影院| 亚洲免费av在线视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产熟女午夜一区二区三区| 好男人在线观看高清免费视频 | 美女 人体艺术 gogo| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲第一电影网av| 国产激情欧美一区二区| 9191精品国产免费久久| 成人永久免费在线观看视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美一区二区精品小视频在线| 最好的美女福利视频网| 亚洲片人在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 嫩草影院精品99| 久久久久久久精品吃奶| 国内精品久久久久久久电影| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲色图av天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 男人舔女人的私密视频| 国产又爽黄色视频| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品九九99| а√天堂www在线а√下载| 中国美女看黄片| 亚洲免费av在线视频| 国产激情久久老熟女| 黄片播放在线免费| 男男h啪啪无遮挡| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一区福利在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产一区二区三区综合在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲黑人精品在线| 国产国语露脸激情在线看| 国产单亲对白刺激| 国产精品永久免费网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 免费看美女性在线毛片视频| 高清毛片免费观看视频网站| 精品一区二区三区四区五区乱码| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91在线观看av| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一区二区三区高清视频在线| 精品人妻1区二区| 精品一品国产午夜福利视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线观看午夜福利视频| 在线观看免费午夜福利视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 日日夜夜操网爽| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品综合久久久久久久免费 | 久久亚洲真实| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩欧美在线二视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品国产美女av久久久久小说| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久九九精品影院| 性欧美人与动物交配| 成人欧美大片| 欧美激情久久久久久爽电影 | 精品熟女少妇八av免费久了| 国产成人啪精品午夜网站| 可以在线观看的亚洲视频| 人妻久久中文字幕网| 久久久久久久久中文| 亚洲精品国产区一区二| 99re在线观看精品视频| 久久久国产精品麻豆| 高清毛片免费观看视频网站| 日韩欧美在线二视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美久久黑人一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| ponron亚洲| 免费在线观看完整版高清| 欧美激情高清一区二区三区| 久久久久久大精品| 免费观看人在逋| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩国内少妇激情av| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品二区激情视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 桃色一区二区三区在线观看| 国产激情欧美一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 久久欧美精品欧美久久欧美| 宅男免费午夜| 男女下面插进去视频免费观看| 一区在线观看完整版| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜激情av网站| 免费看a级黄色片| 变态另类丝袜制服| 桃红色精品国产亚洲av| 国产片内射在线| 少妇 在线观看| avwww免费| 国产成人精品久久二区二区91| 国产单亲对白刺激| 中文字幕久久专区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美黑人欧美精品刺激| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 午夜福利,免费看| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜福利免费观看在线| 久久久国产精品麻豆| 最近最新免费中文字幕在线| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲五月色婷婷综合| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲少妇的诱惑av| 一级a爱片免费观看的视频| 在线观看免费视频网站a站| 欧美黑人精品巨大| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 俄罗斯特黄特色一大片| 人成视频在线观看免费观看| 久久影院123| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 成人免费观看视频高清| 久久久久九九精品影院| 亚洲精华国产精华精| 两性夫妻黄色片| 国产亚洲精品一区二区www| 国产又爽黄色视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 搞女人的毛片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| tocl精华| 男男h啪啪无遮挡| 一级a爱片免费观看的视频| 午夜福利在线观看吧| 窝窝影院91人妻| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美大码av| 自线自在国产av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲av美国av| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品国产乱码久久久久久男人| 色播在线永久视频| 村上凉子中文字幕在线| 91av网站免费观看| 色av中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 嫩草影院精品99| 日本在线视频免费播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久久久久久久久久久大奶| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美大码av| 亚洲专区中文字幕在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产xxxxx性猛交| 两性夫妻黄色片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久热这里只有精品99| 老司机午夜十八禁免费视频| 曰老女人黄片| www.999成人在线观看| 人妻久久中文字幕网| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲黑人精品在线| 久久 成人 亚洲| 91成人精品电影| 欧美成人性av电影在线观看| 伦理电影免费视频| 久久久久久人人人人人| 国产午夜精品久久久久久| 十分钟在线观看高清视频www| 超碰成人久久| 99re在线观看精品视频| www.www免费av| 亚洲第一青青草原| 亚洲成av人片免费观看| 麻豆一二三区av精品| 波多野结衣av一区二区av| 男女下面插进去视频免费观看| 中文字幕久久专区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 中国美女看黄片| 国产成人av激情在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 大陆偷拍与自拍| 日韩欧美在线二视频| 色哟哟哟哟哟哟| 久久人妻熟女aⅴ| 九色国产91popny在线| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 我的亚洲天堂| 精品人妻1区二区| 视频在线观看一区二区三区| 精品高清国产在线一区| av欧美777| 免费在线观看黄色视频的| 手机成人av网站| 亚洲熟妇熟女久久| 婷婷丁香在线五月| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品国产区一区二| 日本a在线网址| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 91字幕亚洲| 欧美在线一区亚洲| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 在线观看日韩欧美| 国产精品1区2区在线观看.| av有码第一页| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲 国产 在线| 日日干狠狠操夜夜爽| av天堂久久9| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久亚洲真实| 久久 成人 亚洲| 国产又爽黄色视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 极品人妻少妇av视频| 在线观看66精品国产| 视频区欧美日本亚洲| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲,欧美精品.| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 黑人操中国人逼视频| 成人三级黄色视频| 亚洲av熟女| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 999久久久国产精品视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 天堂影院成人在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 国产熟女午夜一区二区三区| av免费在线观看网站| 极品教师在线免费播放| 我的亚洲天堂| 国产av一区二区精品久久| 99久久精品国产亚洲精品| 岛国在线观看网站| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品在线美女| 免费观看人在逋| 可以在线观看毛片的网站| 午夜影院日韩av| 69av精品久久久久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| av中文乱码字幕在线| 亚洲五月天丁香| 成人欧美大片| 精品人妻在线不人妻| 99久久国产精品久久久| 麻豆成人av在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产成人av激情在线播放| 国产一卡二卡三卡精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美最黄视频在线播放免费| 日本 av在线| bbb黄色大片| 在线观看www视频免费| 亚洲黑人精品在线| 欧美性长视频在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产真人三级小视频在线观看| 香蕉国产在线看| 精品福利观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久精品成人免费网站| 香蕉久久夜色| 亚洲,欧美精品.| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 麻豆一二三区av精品| 国产精品二区激情视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲 国产 在线| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲av五月六月丁香网| 嫩草影院精品99| 久久久久久久久免费视频了| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲一区中文字幕在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 级片在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 青草久久国产| 女性被躁到高潮视频| 国产一区二区激情短视频| 久久久久国内视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产xxxxx性猛交| 操出白浆在线播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 高清在线国产一区| 村上凉子中文字幕在线| 99久久国产精品久久久| 12—13女人毛片做爰片一| 黄片大片在线免费观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 黑丝袜美女国产一区| 午夜久久久久精精品| 午夜影院日韩av| 免费在线观看黄色视频的| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久人妻熟女aⅴ| 丁香六月欧美| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜福利成人在线免费观看| 18禁观看日本| 久久久久国内视频| 99国产精品一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 我的亚洲天堂| 亚洲第一av免费看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 最好的美女福利视频网| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产男靠女视频免费网站| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲成人久久性| 69精品国产乱码久久久| 999久久久精品免费观看国产| 久久精品91无色码中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 好男人在线观看高清免费视频 | 岛国在线观看网站| 亚洲av熟女| 午夜激情av网站| 亚洲精华国产精华精| 9热在线视频观看99| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲色图av天堂| 久久久久久久久久久久大奶| 无限看片的www在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品日韩av在线免费观看 | 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲色图综合在线观看| 天堂√8在线中文| 我的亚洲天堂| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 午夜免费鲁丝| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲天堂国产精品一区在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 亚洲一区中文字幕在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品一区二区三区四区五区乱码| 一区二区三区高清视频在线| 一区二区三区精品91| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲av熟女| 老司机深夜福利视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 麻豆一二三区av精品| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲情色 制服丝袜| 18禁国产床啪视频网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 日本三级黄在线观看| av视频免费观看在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| av天堂在线播放| 久久午夜亚洲精品久久| 999精品在线视频| 制服诱惑二区| 亚洲成人久久性| 波多野结衣一区麻豆| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲成国产人片在线观看| av欧美777| 最新美女视频免费是黄的| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品 欧美亚洲| 两个人免费观看高清视频| 精品日产1卡2卡| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 成人国产一区最新在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 男女之事视频高清在线观看| 精品久久久精品久久久| 美女高潮到喷水免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 级片在线观看| 丰满的人妻完整版| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 婷婷丁香在线五月| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久人人97超碰香蕉20202| x7x7x7水蜜桃| 国产xxxxx性猛交| 两个人看的免费小视频| 国产精品九九99| 精品久久久精品久久久| 国产高清有码在线观看视频 | 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品一区二区免费欧美| 大陆偷拍与自拍| 亚洲最大成人中文| 这个男人来自地球电影免费观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 美女 人体艺术 gogo| 国产三级在线视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久热在线av| 露出奶头的视频| 亚洲色图av天堂| 麻豆国产av国片精品| 国产男靠女视频免费网站| 国产亚洲欧美精品永久| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 在线国产一区二区在线| 成人免费观看视频高清| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲av五月六月丁香网| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 丰满的人妻完整版|