昆津病毒復制子
——一種新型病毒載體

李世華，李曉峰，秦鄂德，秦成峰

軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

昆津病毒復制子
——一種新型病毒載體

李世華，李曉峰，秦鄂德，秦成峰

軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

病毒復制子 (Replicon) 是指來源于病毒基因組的能夠自主復制的 RNA分子，保留了病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因，而結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失或由外源基因替代。昆津病毒 (Kunjun virus) 為黃病毒科黃病毒屬成員，其復制子具有表達效率高、細胞毒性低、遺傳穩(wěn)定等特點，在病毒基因組復制調(diào)控機制、外源蛋白表達、新型疫苗和基因治療等領(lǐng)域得到了廣泛應用。以下就昆津病毒復制子系統(tǒng)的構(gòu)建、特性及應用方面的研究進展作一綜述。

昆津病毒，復制子，RNA病毒，病毒載體

Abstract:Viral replicon is a kind of self-replicating viral RNA sourced from viral genome, which contains viral non-structural genes that are critical for viral genome replication with structural proteins deleted or replaced by foreign genes. Kunjin virus is a member of the Flavivirida family, Flavivirus genus, and Kunjin virus replicon is the first and the clearly defined flavivirus replicon. Kunjun virus replicon has been regarded as an excellent viral vector on account of its high expression, lower cytotoxicity and genetic stability. These unique characteristics of kunjin virus replicons make them suitable for the study of viral genome replication, recombinant proteins production, vaccine development and gene therapy. In this article, recent progress in the development, properties and applications of kunjin virus replicon system was briefly reviewed.

Keywords:Kunjin virus, replicon, RNA virus, viral vector

復制子是一種基于 RNA病毒的能自主復制的RNA分子，在病毒學研究中有著廣泛的應用。RNA病毒復制子保留了病毒基因組復制所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白基因和非編碼區(qū)的關(guān)鍵順式作用元件，因而能夠在宿主細胞內(nèi)有效復制；但同時缺失其結(jié)構(gòu)蛋白基因，因此無法形成感染性的病毒顆粒，操作較為安全。目前，絕大多數(shù)單股正鏈RNA病毒的復制子已經(jīng)構(gòu)建成功，如甲病毒、黃病毒、冠狀病毒、小RNA病毒和副粘病毒等，其中最為成熟的是甲病毒復制子，如塞姆利基森林病毒 (Semliki Forest Virus，SFV) 復制子已成為一種商業(yè)化的真核表達載體，基于甲病毒復制子的HIV疫苗也已進入一期臨床研究[1]。黃病毒科黃病毒屬包括70多種病毒，其中超過一半與人類疾病相關(guān)，如登革病毒、蜱傳腦炎病毒、乙型腦炎病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒和墨累河谷腦炎病毒等。昆津病毒 (Kunjun Virus，KUNV)復制子是構(gòu)建成功的第一個黃病毒復制子，在基因組結(jié)構(gòu)與功能、外源蛋白表達、復制子疫苗及基因治療等方面得到廣泛的應用。本文就昆津病毒復制子的研究進展作一綜述。

1 昆津病毒復制子

昆津病毒僅見于澳大利亞北部，與西尼羅病毒同屬一個血清亞型。該病毒感染人類后一般不會致病，偶爾會引起輕微的腦炎。昆津病毒的基因組為全長11 022 nt的單股正鏈RNA，含有一個單一開放讀碼框，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白 (C、prM/M和E) 和7個非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)，5′端和 3′端為非編碼區(qū) (Untranslated region，UTR)。結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的組裝，非結(jié)構(gòu)蛋白和兩端的UTRs共同參與病毒的復制翻譯過程。

1996年，澳大利亞Khromykh等在昆津病毒感染性全長cDNA克隆的基礎上首次構(gòu)建獲得了昆津病毒復制子[2]。昆津病毒復制子保留了病毒RNA復制所需的NS1-NS5非結(jié)構(gòu)基因，以及兩端的UTRs，缺失了C、PrM和E蛋白基因 (圖1)。由于編碼昆津病毒C蛋白的基因中含有一段保守序列 (Cyclization sequence，CS)，該序列與3′ UTR的另一個CS參與基因組環(huán)化，與病毒RNA的復制和翻譯密切相關(guān)。因此，昆津病毒復制子保留了C蛋白氨基端的前20個氨基酸 (C20) 的編碼序列。同時，昆津病毒E蛋白羧基末端含有一段在NS1蛋白成熟過程中發(fā)揮重要作用的信號肽序列，所以在昆津病毒復制子的構(gòu)建過程中還保留了 E蛋白羧基末端 22個氨基酸(E22) 的編碼序列[3]。

圖1 昆津病毒復制子亞基因組結(jié)構(gòu)示意圖 (由Pijlman GP發(fā)表于2006年Biol Ther的文章修改而成[24])Fig. 1 Construction of Kunjin virus replicon genome. neo: neomycin phosphotransferase II gene; HG: Heterologous gene; Ub:Ubiquitin; HDVr: hepatitis delta virus ribozyme; PA: ployadenylation; IRES: Internal ribosome entry site.

為了在體外或者體內(nèi)啟動復制子的轉(zhuǎn)錄，復制子的5′ UTR上游必須含有SP6或者CMV啟動子。對于CMV啟動子而言，復制子3′ UTR下游還需引入HDVr (Hepatitis delta virus ribozyme) 的反義基因和多聚腺苷酸 (Ployadenylation，PA) 信號，從而保證獲得完整的病毒基因組 3′末端，有效地起始復制子的復制過程。為保證外源基因插入復制子后獲得正確的表達和加工，外源基因兩端一般還需融合一段具有自我切割功能的序列，如口蹄疫病毒自身水解酶2A序列 (FMDV-2A)[4]，或小鼠泛素 (Ubiquitin，Ub) 序列。此外，為了保證病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的正確翻譯，需在外源基因的 3′末端添加終止密碼子和內(nèi)部核糖體進入位點 (Internal ribozyme entry site，IRES) (圖1)。另外，昆津病毒復制子NS5蛋白終止密碼子與3′ UTR之間存在可變區(qū) (Variable region，VR)，亦可允許外源基因的插入。如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (Neomycin phosphotransferase II，neo) 基因被插入該區(qū)域以篩選穩(wěn)定表達昆津病毒復制子的細胞系 (Rep-cell)[2]。

昆津病毒復制子主要以 3種形式進入細胞：第一種是以體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA形式進入細胞，該方式能迅速增加細胞內(nèi)復制子RNA的含量，從而大幅提高外源蛋白的表達水平。第二種是將其置于CMV啟動子下游的復制子以質(zhì)粒DNA的形式轉(zhuǎn)染細胞，再借助細胞內(nèi)的 RNA聚合酶Ⅱ進行轉(zhuǎn)錄來獲得病毒 RNA[5]，該方式省去了體外轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，降低成本的同時也避免了RNA的降解。最后一種是以單輪感染型病毒樣顆粒 (Virus like particle，VLP) 的形式進入細胞。RNA復制子與其結(jié)構(gòu)蛋白仍能形成具有感染性的病毒樣顆粒，但再次侵入細胞后會因其RNA的缺陷而無法生成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，從而無法形成子代病毒樣顆粒，故被稱為單輪感染型 VLP。Khromykh等將昆津病毒復制子和表達其結(jié)構(gòu)蛋白的塞姆利基森林病毒復制子共轉(zhuǎn)染細胞，獲得了昆津病毒的VLP[6]。Harvey等進一步構(gòu)建了穩(wěn)定表達昆津病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細胞系，將復制子轉(zhuǎn)染至該細胞系后也獲得了昆津病毒的單輪感染型VLP[7]。

2 昆津病毒復制子的生物學特性

昆津病毒復制子具有RNA復制子的共有特征：一是復制效率高，可以持續(xù)的合成雙鏈RNA，可作為高效的表達載體；二是無整合至宿主基因組的危險；三是免疫效果良好，少量的DNA質(zhì)粒就能同時誘導粘膜免疫、抗體應答和CTL反應。

除上述特征外，昆津病毒復制子還具有優(yōu)于其他RNA復制子的特性。其一是細胞毒性低。甲病毒復制子雖是應用最廣泛的RNA復制子，但其細胞毒性強，在細胞內(nèi)僅能復制幾天即可致細胞凋亡，因此無法持續(xù)表達外源蛋白。昆津病毒復制子的細胞毒性則很弱，在細胞內(nèi)能持續(xù)復制數(shù)十天之久。其二是產(chǎn)生重組活病毒的概率極低。理論上講，RNA復制子可能與其結(jié)構(gòu)基因的同源序列發(fā)生重組，進而產(chǎn)生具有持續(xù)感染性的病毒顆粒。但研究顯示，昆津病毒復制子轉(zhuǎn)染至表達其結(jié)構(gòu)基因的細胞后，并未產(chǎn)生具有感染性的野生型病毒顆粒[8]。此外，研究也未發(fā)現(xiàn)其與其他黃病毒復制子間存在重組現(xiàn)象[9]。其三是昆津病毒RNA聚合酶的保真性高，即該病毒的 RNA序列在復制過程中能夠保持較高的穩(wěn)定性。因此，當昆津病毒復制子作為疫苗載體時，其免疫原性就能保持高度穩(wěn)定。其四是便于遺傳學操作。昆津病毒復制子的RNA僅為8 000 nt左右，易于對其序列進行改造。正是基于以上優(yōu)點，昆津病毒復制子已成為一種新型的病毒載體，在病毒復制機制、蛋白表達、新型疫苗及基因治療等方面顯示出巨大的應用潛力。

3 昆津病毒復制子的應用

3.1 黃病毒基因組復制調(diào)控機制的研究

由于復制子僅在細胞內(nèi)完成RNA的復制過程，而不涉及病毒的吸附、侵入、包裝和釋放等階段，因而能直觀地反映病毒基因組復制的特征以及靶細胞的生理變化情況。以昆津復制子為模型，不同學者先后發(fā)現(xiàn)了一系列重要的復制調(diào)控元件。Khromykh等對昆津病毒復制子5′ UTR和3′ UTR的不同環(huán)化序列、保守區(qū)和 3′末端的核苷酸進行了突變分析，結(jié)果表明這些區(qū)段是病毒RNA復制的關(guān)鍵序列[2]。這是首次在細胞水平上證明了黃病毒非編碼區(qū)在病毒復制中具有重要功能。此外，Liu和Leung等還先后借助昆津病毒復制子證實 NS3和NS2A分別在RNA復制和病毒組裝過程中具有重要作用[10-11]。本實驗室利用登革病毒的復制子系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)登革病毒 C蛋白編碼區(qū)發(fā)夾 (C-coding region hairpin，cHP) 結(jié)構(gòu)對病毒基因組的復制具有重要的調(diào)控作用[12]。

此外，昆津病毒復制子在復制機制研究中也有重要的應用。當非結(jié)構(gòu)蛋白缺陷型的全長克隆轉(zhuǎn)染至復制子細胞系后，復制子將提供具有完整功能活性的非結(jié)構(gòu)蛋白，進而協(xié)助缺陷型全長克隆完成復制，最終通過是否形成感染性的病毒顆粒來確定非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復制中的功能。利用上述反式互補系統(tǒng)，Khromykh等研究了非結(jié)構(gòu)蛋白 NS5的功能，在此基礎上提出了黃病毒 RNA復制復合體 (Replication complex，RC) 形成模型以及在其形成過程中 NS3和NS5的作用[13-14]。另外還發(fā)現(xiàn)了昆津病毒非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)中與復制復合體形成相關(guān)的一系列順式和反式作用元件，并研究了其相互作用[15]。上述研究不僅豐富了黃病毒基因組復制機理的相關(guān)內(nèi)容，也為進一步闡明黃病毒復制機制奠定了基礎。

3.2 外源蛋白表達

與其他病毒表達載體相比，昆津病毒復制子載體具有一系列優(yōu)勢。首先，其細胞毒性低的特點決定了其擁有更廣的宿主范圍；其次，昆津病毒復制子可以隨細胞分裂而分配到子代細胞中，繼續(xù)其復制周期，以此持續(xù)表達外源蛋白。此外，昆津病毒復制子能夠?qū)ν庠吹鞍走M行糖基化等翻譯后修飾，因此能獲得更接近天然活性的目的產(chǎn)物。目前，利用昆津病毒復制子載體已成功表達了報告基因、病毒類抗原、病毒糖類蛋白以及細胞因子等多達20多種外源蛋白[16]。如 Varnavski利用昆津病毒復制子表達系統(tǒng)先后成功表達了氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，綠色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶和丙型肝炎病毒NS3蛋白等[17]。除上述的瞬時表達形式外，建立昆津病毒復制子細胞系是另一種持續(xù)表達外源蛋白的途徑。含有抗性基因的昆津病毒復制子轉(zhuǎn)染細胞后，經(jīng)抗生素篩選后可獲得穩(wěn)定的復制子細胞系，如Varnavski等利用篩選獲得的 BHK-21細胞系可以穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶達17代以上。

3.3 復制子疫苗

復制子疫苗是近年來新興的疫苗形式。與傳統(tǒng)的疫苗相比，RNA復制子疫苗具有如下優(yōu)勢：第一，復制效率高，并且能同時誘導體液和細胞免疫反應；第二，只在細胞質(zhì)中復制，無整合至宿主細胞基因組的危險；第三，病毒樣顆粒形式的疫苗不僅免疫原性強，而且僅能完成單輪感染，安全性高。如前所述，昆津病毒復制子可持久的表達外源蛋白，因此能有效誘發(fā)機體產(chǎn)生相應的體液免疫反應。更重要的是，該復制子還能同時誘導CD8+型T細胞免疫反應。Anraku等發(fā)現(xiàn)，0.1 μg質(zhì)粒DNA形式的昆津病毒復制子誘發(fā)的T細胞免疫反應效力與100 μg傳統(tǒng)DNA疫苗的 T細胞免疫反應相當[18]，這表明昆津病毒復制子在誘導T細胞免疫方面具有明顯的優(yōu)勢。研究還發(fā)現(xiàn)，用含有HIV gag基因的昆津病毒復制子 VLP免疫小鼠后，可以誘發(fā)機體產(chǎn)生針對HIV的CD8+型T細胞免疫保護反應，并且持續(xù)6~10個月之久[19]。此外，基于該復制子VLP的SIV疫苗在不同的動物模型中進行了免疫保護能力的評價，并證實均具有較好的免疫保護性[20-21]。總之，正是由于昆津病毒復制子能同時誘導體液和細胞免疫，因此成為極具潛力的新型 RNA復制子疫苗候選載體。

3.4 基因治療

基因治療是指通過特定手段將基因類藥物導入病灶中的靶細胞，從而改善或治愈疾病的一種治療手段。昆津病毒復制子靶細胞范圍廣，可持續(xù)表達外源產(chǎn)物，而且還能有效誘導干擾素的產(chǎn)生，因此該復制子系統(tǒng)是基因治療領(lǐng)域中理想的遞送系統(tǒng)。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF能產(chǎn)生具有抗癌作用的 CD8+型 T細胞反應，Hoang-Le等將GM-CSF通過病毒樣顆粒形式的昆津病毒復制子系統(tǒng)導入腫瘤細胞內(nèi)，使其在宿主細胞內(nèi)表達，結(jié)果顯示其可以明顯抑制結(jié)腸癌細胞 CT26和黑色素瘤細胞B16的增殖[22]。該研究表明，昆津病毒復制子系統(tǒng)可作為理想的抗癌基因?qū)胼d體，并將在癌癥的基因治療領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

4 小結(jié)與展望

同其他RNA復制子一樣，昆津病毒復制子可高效表達外源蛋白。更重要的是，該復制子幾乎無細胞毒性，因此可建立能持續(xù)穩(wěn)定表達復制子的細胞系，進而獲得高產(chǎn)量的 VLP；同時，昆津病毒復制子以基因重組方式產(chǎn)生野生型病毒顆粒的概率極低，故其安全性也很高。正是基于上述優(yōu)點，昆津病毒復制子在外源蛋白表達、新型疫苗研制以及基因治療等領(lǐng)域得到廣泛應用。盡管目前的研究顯示，VLP是最為有效的復制子遞送方式，但其靶向性還有待進一步提高。此外，盡快研發(fā)能夠高效遞送RNA和 DNA形式復制子的技術(shù)也是今后亟待解決的問題。目前，澳大利亞的Replikun Biotech公司致力于昆津病毒復制子技術(shù)的商品化，并取得了一系列成果，如已成功開發(fā)了基于昆津病毒復制子的艾滋病疫苗和腫瘤的治療性疫苗，有些業(yè)已進入臨床應用階段?？傊S著相關(guān)研究的不斷深入，有理由相信昆津病毒復制子在更多領(lǐng)域會發(fā)揮更為重要的作用，真正為人類造福。

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Kunjin virus replicon——a novel viral vector

Shihua Li, Xiaofeng Li, E’de Qin, and Chengfeng Qin
State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Received: June 21, 2010; Accepted: August 6, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30701061), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA021501), Beijing Natural Science Foundation (No. 7082063), Doctoral Fund (New Teacher) of Ministry of Education of China (No. 20070023077).

Corresponding author: Jianqiang Kong. Tel: +86-10-63165169; Fax: +86-10-63017757; E-mail: jianqiangk@imm.ac.cn Ping Zhu. Tel: +86-10-63165197; Fax: +86-10-63017757; E-mail: Zhuping@imm.ac.cn

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