抑癌基因PML在宮頸病變組織中的突變探討

何志暉,李清秀,王 莉,譚佩嬋

(廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東廣州,510120)

子宮頸癌的發(fā)病率占女性生殖道惡性腫瘤的首位。近代我國(guó)每年新發(fā)宮頸癌病例約為13.5萬(wàn),近幾年全球范圍宮頸癌的發(fā)病率有明顯升高,嚴(yán)重威脅婦女的健康和生命,全世界每年約有20萬(wàn)婦女死于該病[1]。因此,早期診斷宮頸癌、預(yù)防宮頸癌的發(fā)生,預(yù)測(cè)宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移能力,進(jìn)而提高婦女的生活質(zhì)量,是當(dāng)今許多相關(guān)學(xué)科所面臨的重要課題。宮頸癌的病因至今尚未完全明確,研究顯示人乳頭瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌關(guān)系密切[2-3],但單純HPV感染不足以引起癌變。宮頸癌的發(fā)生受宿主免疫功能、遺傳易感性、營(yíng)養(yǎng)狀況及行為等因素的影響,細(xì)胞癌變過(guò)程中有多種癌基因及抑癌基因的參與。細(xì)胞內(nèi)遺傳因素的改變對(duì)宮頸癌的發(fā)生起著非常重要的作用[4]。因此,確定宮頸癌相關(guān)基因,從分子水平上了解細(xì)胞癌變機(jī)制,為宮頸癌的早期診斷、預(yù)防、易感性預(yù)測(cè)及治療提供分子標(biāo)記具有十分重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因、抑癌基因相繼被分離克隆。

早幼粒細(xì)胞性白血病基因(PML)最先在早幼粒細(xì)胞性白血病患者中被發(fā)現(xiàn),與早幼粒細(xì)胞性白血病關(guān)系密切。該基因位于第15號(hào)染色體上,它編碼一系列生長(zhǎng)蛋白,這些蛋白中的一部分具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和穩(wěn)定基因組的作用[5]。PML在致癌性轉(zhuǎn)化和DNA損傷時(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制,這對(duì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)起著非常重要的作用[6]。PML是一種廣譜的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子。目前對(duì)PML與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的關(guān)系、PML與宮頸癌的細(xì)胞分級(jí)與臨床分期的關(guān)系、PML與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系尚不太清楚。

本研究的目的是研究宮頸癌和CIN組織中PML基因是否存在突變。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

隨機(jī)選取于2009年6月～2011年2月在本院因?qū)m頸病變行手術(shù)治療的病例新鮮組織樣本,包括CIN Ⅰ 30例、CIN Ⅱ 30例、CIN Ⅲ 30例、宮頸浸潤(rùn)鱗癌30例、以及因其他疾病切除子宮病理證實(shí)為慢性宮頸炎者30例。年齡25～80歲,平均年齡43.85歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取新鮮組織標(biāo)本5克,常規(guī)用氛-氯仿法提取基因組DNA。

對(duì)所有標(biāo)本DNA進(jìn)行9個(gè)外顯子及內(nèi)含子-外顯子交接區(qū)的DHPLC篩查。根據(jù)UCSC及文獻(xiàn)報(bào)道[7]的引物序列共合成11對(duì)引物,其中第3和9外顯子各含2對(duì)引物。引物序列及PCR條件、DHPLC篩查條件等見(jiàn)表1。

表1 PML基因引物序列及DHPLC篩查條件

各個(gè)片段的PCR反應(yīng)體系及條件,有些片段用Fermentas公司的酶擴(kuò)增效果不好,需用DBI酶(E-1)或Takara公司的酶(E-7)來(lái)擴(kuò)增:

PCR反應(yīng)體系(Fermentas)見(jiàn)表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系(DBI)見(jiàn)表3。

表3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系(Takara)見(jiàn)表4。

反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,引物特異退火溫度復(fù)性45 s,72℃延伸50 s,35次循環(huán);72℃延伸10 min。

擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè):選擇1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,溴乙啶或其無(wú)毒替代品染色,紫外燈下觀察擴(kuò)增效果。

表4 PCR反應(yīng)體系

DHPLC的操作:變性高效液相色譜WAVE核苷酸片段分析系統(tǒng)2100-B(美國(guó)Transgenomic公司)。將PCR產(chǎn)物96℃變性5 min,緩慢冷卻至室溫,以充分形成異源和同源雙鏈DNA分子混合物。將待分析的PCR樣品放入WAVE系統(tǒng)96孔反應(yīng)板,輸入被檢測(cè)片段的序列,確認(rèn)進(jìn)樣量。WAVE-Maker軟件自動(dòng)分析出序列的解鏈曲線,根據(jù)預(yù)測(cè)的熔解溫度,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得各片段的最適檢測(cè)溫度。依照程序指令,進(jìn)樣器自動(dòng)吸取8～12 μ L PCR產(chǎn)物,注入DNASep檢測(cè)柱內(nèi)。流動(dòng)相為緩沖液A(0.1 moL/L的TEAA)和緩沖液B(含0.1 moL/L的TEAA及25%的乙腈),在待測(cè)樣品部分變性和乙腈沖洗梯度線性增加的情況下,緩沖液以0.9 mL/min的流速將結(jié)合在檢測(cè)柱上的DNA分子洗脫下來(lái),在260 nm波長(zhǎng)處讀取吸光值,經(jīng)WAVE分析軟件處理形成DHPLC峰型圖供分析鑒定。

測(cè)序:對(duì)于DHPLC篩查后出現(xiàn)色譜峰型異常者,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向DNA測(cè)序加以驗(yàn)證,并進(jìn)行2次獨(dú)立的PCR產(chǎn)物測(cè)序,測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。應(yīng)用Chromas和CLustaLx軟件將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列資料進(jìn)行比對(duì)分析。對(duì)30例診斷為宮頸浸潤(rùn)鱗癌的患者除了行DHPLC篩查外,還隨機(jī)選取了10例行全部9個(gè)外顯子及內(nèi)含子-外顯子交接區(qū)的PCR產(chǎn)物測(cè)序。

2 結(jié) 果

DHPLC 在E-4、E-7、E-9-1和E-9-2的篩查中發(fā)現(xiàn)少數(shù)樣本呈現(xiàn)異常峰型,但對(duì)DHPLC色譜峰型異常者進(jìn)行雙向測(cè)序并未發(fā)現(xiàn)基因突變。隨機(jī)選取10例宮頸浸潤(rùn)鱗癌患者行PML基因9個(gè)外顯子及內(nèi)含子-外顯子交接區(qū)的PCR產(chǎn)物測(cè)序均未發(fā)現(xiàn)突變。

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外已有很多學(xué)者對(duì)與宮頸癌相關(guān)的抑癌基因和癌基因進(jìn)行了研究。他們證實(shí)了與宮頸癌相關(guān)的癌基因有 C-erbB-2、c-myc、cfos、bcL,抑癌基因有 p53 、p27、p16、FHIT 、Rb、nm23。1996年Gambacorta等[8]報(bào)道 PML蛋白在浸潤(rùn)性上皮性腫瘤中的表達(dá)下降。2003年Szendefi等[9]首先報(bào)道PML與宮頸癌病程嚴(yán)重程度密切相關(guān),從正常宮頸組織到CINⅠ和CINⅡ,PML的表達(dá)量增加;在CINⅢ和宮頸浸潤(rùn)鱗癌中,低分化者 PML的表達(dá)量降低。2004年CarmeLa Gurrieri等報(bào)道[7]PML在多種腫瘤(結(jié)腸腺癌、肺癌、前列腺腺癌、乳腺癌和生殖細(xì)胞腫瘤等)組織中表達(dá)缺失,并與腫瘤的分級(jí)和分期相關(guān);雖然在多種癌組織中PML的表達(dá)量減少,但作者發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量的減少由PML基因突變而引起的很少見(jiàn),雖然PML的mRNA表達(dá)有所改變,但其改變與蛋白表達(dá)沒(méi)有相關(guān)性。

[1]Vizcaino A P,M oreno V,Bosch F X,et aL.InternationaL trends incidence of cervicaL cancer:SquamousceLL carcinoma[J].Int J Cancer,2002(3),86:429.

[2]Einstein M H,GoLdberg G L.Human papiLLomavirus and cervicaL neopLasia[J].Cancer Invest,2002,20:1080.

[3]Munoz N,Bosch F X,DeSanjose S,et al.EpidemioLogic cLassification of human papiLLomavirus typesassociated with cervicaL cancer[J].N EngL J Med,2003,348:489.

[4]Lars C H,Georgios R.FamiLiaL cancer history in patients with carcinoma of the cervix uteri[J].Eur J Obstet GynoL Reprod BioL,2002,101:54.

[5]Zhong S,SaLomoni P,PamdoLfi P P.The transcriptionaL roLe of PML and the nucLear body[J].Nat CeLL BioL,2000,2:E85.

[6]SaLomoni P,PandoLfi P P.The roLe of PML in tumor suppression[J].CeLL,2002,108:165.

[7]Gurrieri C,Capodieci P,Bernardi R,et al.Loss of the tumor suppressor PM L in human cancers of muLtipLe histoLogic origins[J].J NatL Cancer Inst,2004,96(4):269.

[8]Gambacorta M,FLenghi L,FagioLi M,et al.Heterogeneous nucLear expression of the promyeLocyticLeukemia(PM L)protein in normaL and neopLastic human tissues[J].Am J PathoL,1996,149:2023.

[9]Szendefi M,WaLt H,Krasieva T B,et al.Association between promyeLocyte protein and smaLLubiquitin-Like modifier protein and the progression of cervicaL neopLasia[J].Obstet GynecoL,2003,102:1269.