HPLC－ELSD法測(cè)定宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷的含量

張 偉 馬久太，2 王曉梅，2 單 娜，2 劉 峰，2 南景一，2

(1陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西咸陽(yáng)，712000;2陜西省中藥制藥工程技術(shù)研究中心)

宮瘀凈膠囊是在古方“當(dāng)歸補(bǔ)血湯”“人參黃芪湯”和“理氣散瘀湯”基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，精制而成的一種純中藥新產(chǎn)品，由黃芪、當(dāng)歸、三七等8味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血、祛瘀止血功能，對(duì)于藥物流產(chǎn)后導(dǎo)致的氣血兩虛、瘀血阻滯型陰道出血等病癥的治療，具有很好的療效。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用薄層色譜掃描法測(cè)定黃芪甲苷，存在靈敏度低、重現(xiàn)性差、操作繁瑣等缺點(diǎn)。為了保證產(chǎn)品質(zhì)量，提高分析方法的靈敏性、重現(xiàn)性及方便性，我們采用HPLC－ELSD對(duì)宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了研究，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

3400A型高效液相色譜儀;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;AR1140電子天平;KQ·250TB超聲波清洗器;ΜPT－1－10高純水機(jī)。黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110781－200613)，宮瘀凈膠囊(陜西步長(zhǎng)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)090411、090621、090814)，乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈－水(33∶67)為流動(dòng)相;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度為50℃，氣流量為1.5L/min，增益為4。理論板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，以甲醇溶解，制成每1mL含1.154mg的溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品10粒，精密稱(chēng)定，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，約取4g，精密稱(chēng)定，加硅藻土1g，拌勻，置索氏提取器中，加石油醚(60℃ ～90℃)回流提取至無(wú)色，石油醚棄去，取出濾紙筒，烘干，再置索氏提取器中，以甲醇回流提取5.5h，回收甲醇，蒸干，殘?jiān)?0mL熱水分次轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加正丁醇飽和的水20mL稀釋?zhuān)盟柡偷恼〈继崛?次，每次20mL，合并正丁醇液，用0.5%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次20mL，棄去堿液，繼用正丁醇飽和的水洗至中性，棄去水液，正丁醇液水浴蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，即得。

2.4 干擾性試驗(yàn) 依據(jù)處方制備不含黃芪的樣品，按照供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液，分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液與陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液色譜圖中，在黃芪甲苷對(duì)照品峰與供試品溶液色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間處未出色譜峰，基線(xiàn)分離良好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍 分別配制濃度為0.115mg/mL、0.288mg/mL、0.577mg/mL、0.866mg/mL、1.154mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取各10μL進(jìn)樣，按“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值(X)為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)數(shù)值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)，得回歸方程式:Y=1.732X+2.013，r=0.9999(n=5)。結(jié)果表明，黃芪甲苷在 1.154～11.540μg范圍與色譜峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.6 精密度試驗(yàn) 取宮瘀凈膠囊(批號(hào)090411)內(nèi)容物適量，按上述供試品溶液制備方法處理并按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄黃芪甲苷的峰面積，見(jiàn)表1，RSD=1.05%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取宮瘀凈膠囊(批號(hào)090411)內(nèi)容物適量，按上述供試品溶液制備方法制備6份供試液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄黃芪甲苷的峰面積，見(jiàn)表2，RSD為1.09%，說(shuō)明該方法重復(fù)性好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含量的宮瘀凈膠囊樣品內(nèi)容物(批號(hào)090411)適量，共5份，精密稱(chēng)定，分別加入對(duì)照品溶液1mL(1.154mg/mL)，按供試品溶液制備方法處理，測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。平均回收率為99.85%，RSD為1.90%。

表3 黃芪甲苷回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)090411)，分別于 0、1、2、4、8、12h 進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。其RSD為0.96%(n=6)，結(jié)果表明結(jié)供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測(cè)定 取宮瘀凈膠囊樣品(批號(hào)090411、090621、090814)適量，精密稱(chēng)定，按供試品溶液制備方法處理并按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄黃芪甲苷的峰面積并計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表5。采用薄層色譜法作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，測(cè)定宮瘀凈膠囊中的黃芪甲苷含量。先用二次展開(kāi)法將宮瘀凈膠囊中的黃芪甲苷與三七中的皂苷分離，然后采用薄層掃描色譜法測(cè)定膠囊中的黃芪甲苷含量，結(jié)果見(jiàn)表5。對(duì)3批宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷分別進(jìn)行t檢驗(yàn)，該方法與本實(shí)驗(yàn)中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，無(wú)顯著性差異。

表5 宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分，常作為指標(biāo)性成分應(yīng)用于黃芪藥材及其制劑的質(zhì)量控制。黃芪甲苷含量多采用薄層掃描法測(cè)定［1－2］，而薄層掃描法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性相對(duì)較差，且操作繁瑣。黃芪甲苷成分的紫外末端吸收較差(λmax=210nm)［3］，采用HPLC－UV吸收強(qiáng)度較弱，受溶劑影響很大，穩(wěn)定性以及準(zhǔn)確性均受到影響，使分析很難進(jìn)行。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為質(zhì)量型檢測(cè)器，不受樣品的光學(xué)特性、官能團(tuán)的影響［4－5］，分離效果很好，靈敏度及穩(wěn)定性高。本品為中藥復(fù)方制劑，所含成分復(fù)雜、干擾大，試驗(yàn)采用高效液相－蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法檢測(cè)宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷的含量，結(jié)果專(zhuān)屬性好、方法穩(wěn)定、可靠，可作為該制劑的質(zhì)量控制的方法。

［1］王寶，蘇健，魯靜.黃芪甲苷的檢測(cè)在中藥質(zhì)控中的應(yīng)用.中國(guó)中藥雜志，1996，21(3):161.

［2］劉艷，付超美，王世宇.薄層掃描法測(cè)定強(qiáng)骨顆粒中黃芪甲苷的含量.成都大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，18(2):125.

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［5］孔曉華，雷玉萍.復(fù)肝能片質(zhì)量控制方法的研究.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(10):109 －110.