腦缺血－再灌注相關(guān)細胞因子表達的TNF－α損傷機制及清開靈的作用

龐春紅 李澎濤 朱曉磊

(1中日友好醫(yī)院病理科，北京市朝陽區(qū)櫻花東路2號，100029;2北京中醫(yī)藥大學;3世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會)

通過對缺血－再灌注損傷血清TNF－α、血清P－selectin、血清sICAM－1含量的測定及對腦組織ICAM－1的免疫組化定位分析，探討在腦缺血－再灌注所致炎癥級聯(lián)反應(yīng)損傷過程中TNF－α對其他細胞因子所發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，以及清開靈的作用特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性Wistar大鼠，體重(200±20)g(維通利華公司實驗動物中心提供)。動物隨機分為9組，每組12只，9組為正常對照組、缺血再灌注24h模型組(模型24h組)、缺血再灌注72h模型組(模型72h組)、缺血再灌注24h TNF－α抗體組(抗體24h組)、缺血再灌注72h TNF－α抗體組(抗體72h組)、缺血再灌注24h清開靈給藥組(清開靈24h組)、缺血再灌注72h清開靈給藥組(清開靈72h組)、缺血再灌注24h TNF－α抗體與清開靈共用組(抗體加清開靈24h組)、缺血再灌注72h TNF－α抗體與清開靈共用組(抗體加清開靈72h組)。

1.2 動物模型制備 按照許沛虎［1］的方法，加以改良，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(按0.35mL/100g體重)麻醉，頸前術(shù)區(qū)脫毛、消毒。頸部正中切口長約3cm，逐層分離，暴露并分離雙側(cè)頸總動脈。注意勿損傷迷走神經(jīng)。在雙側(cè)頸總動脈下各置一段5cm長的絲線，用血管鉗鉗夾絲線兩端使兩動脈同時夾閉，30min后同時松開絲線，使血液重新灌流，術(shù)區(qū)局部使用青霉素粉少許，逐層縫合切口。應(yīng)用TNF－α抗體的各組，在松開絲線恢復再灌流的同時經(jīng)大鼠舌下靜脈注射TNF－α單克隆抗體溶液(用生理鹽水稀釋，10μg/100g體重)［2－3］。清開靈給藥組分別于造模前1h、造模后4h及以后每12h按照0.3mL/100g體重腹腔注射清開靈注射液。為減輕對腹腔的刺激，用2倍體積的生理鹽水進行稀釋，因此，實際給藥體積為0.9mL/100g體重。

1.3 取材處理 造模后分別于24h和72h兩個時間點取材。腹腔注射10%水合氯醛(按0.35mL/100g體重)麻醉后經(jīng)腹主動脈取全血6mL。其中4mL室溫靜置1h后，1500r/min離心10min，分離血清，－80℃保存待測。其余2mL加適量肝素抗凝后3000r/min離心10min，分離血漿，－80℃保存待測。

1.4 主要試劑 水合氯醛(北京化學試劑公司，批號:20030518);TNF－α單克隆抗體(R＆D Sestems，Inc.Lot Number:AYX063061);清開靈注射液(北京中醫(yī)藥大學藥廠，批號:411506A);大鼠ICAM－1 ELISA試劑盒(博士德生物工程有限公司，BSD050320);大鼠P－Selectin ELISA試劑盒(博士德生物工程有限公司，BSD041205)。

1.5 檢測指標及方法 血清TNF－α濃度:放射免疫方法(解放軍301醫(yī)院東亞放免技術(shù)研究所測定)。血清P－選擇素:雙抗夾心 ABC－酶聯(lián)免疫方法(ELISA)，按試劑盒說明操作。血清可溶性細胞間黏附分子(sICAM－1):雙抗夾心ABC－酶聯(lián)免疫方法，按試劑盒說明操作。腦組織細胞間黏附分子－1(ICAM －1):免疫組織化學法定位［4－5］。

1.6 統(tǒng)計學方法 腦組織ICAM－1采用Image Pro 5.1圖像分析軟件采集數(shù)據(jù)，每組4張切片，每張切片隨機選擇2個視野，計算陽性區(qū)域所占總面積，然后用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均以s表示。其余指標直接用SPSS11.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血清TNF－α含量(表1)與正常對照組比較，模型24h組和72h組血清TNF－α含量均出現(xiàn)明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，抗體組在再灌不同時間點血清TNF－α含量出現(xiàn)相反的變化。抗體24h組比模型24h組明顯升高(P＜0.01)，抗體72h組比模型72h組明顯降低(P＜0.01)。2組與正常對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。清開靈對缺血－再灌注后升高的血清TNF－α含量有降低的趨勢，但與模型組比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)?？贵w加清開靈治療在再灌不同時間點血清TNF－α含量也出現(xiàn)相反的變化?？贵w加清開靈24h組與模型24h組比較血清TNF－α含量繼續(xù)升高(P＜0.05)，而抗體加清開靈72h組比模型72h組出現(xiàn)明顯降低(P＜0.01)。

表1 腦缺血－再灌注大鼠血清TNF－α含量的變化(s)

表1 腦缺血－再灌注大鼠血清TNF－α含量的變化(s)

注:與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型24h比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型72h比較，▲▲P＜0.01。

模型組 9 1.6722±0.2536△△ 9 2.230±0.3240△△抗體組 9 2.380±0.0459△△＊＊ 9 1.4909±0.2926△△▲▲清開靈組 10 1.5710±0.1757△ 10 2.0390±0.4330△△抗體+清開靈組 8 2.0312±0.3066△△＊ 9 1.690±0.3638 72h正常對照組組別數(shù)(n)再灌注24h 動物數(shù)(n)再灌注血清TNF－α(ng/mL)動物△▲▲

2.2 血清P－selectin含量(表2)與正常對照組比較，模型24h組和72h組血清P－selectin含量均有明顯升高(P＜0.01)。應(yīng)用抗體、清開靈、以及抗體加清開靈治療均可顯著降低相應(yīng)時間點的缺血－再灌注后升高的血清P－selectin含量(P＜0.01)，但都未回復到正常水平，與正常對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。各72h組血清P－selectin含量均明顯低于相應(yīng)的24h組(P＜0.01)。

表2 腦缺血－再灌注大鼠血清P－selectin含量的變化(s)

表2 腦缺血－再灌注大鼠血清P－selectin含量的變化(s)

注:與正常對照組比較，△△P＜0.01;與模型24h比較，＊＊P＜0.01;與模型72h比較，▲▲P＜0.01。

正常對照組△△▲▲

2.3 血清sICAM－1含量(表3)與正常對照組比較，模型24h組和72h組血清sICAM－1含量均出現(xiàn)明顯升高(P＜0.01)。應(yīng)用抗體、清開靈、以及抗體加清開靈治療均可顯著降低相應(yīng)時間點的缺血－再灌注后升高的血清sICAM－1含量(P＜0.01)，但都未回復到正常水平，與正常對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表3 腦缺血－再灌注大鼠血清sICAM－1含量的變化(s)

表3 腦缺血－再灌注大鼠血清sICAM－1含量的變化(s)

注:與正常對照組比較，△△P＜0.01;與模型24h比較，＊＊P＜0.01;與模型72h比較，▲▲P＜0.01。

模型組 8 0.0598±0.0025△△ 0.0497±0.0024△△抗體組 8 0.0438±0.0031△△＊＊ 0.0430±0.0035△△▲▲清開靈組 8 0.0403±0.0042△△＊＊ 0.0446±0.0042△△▲▲抗體+清開靈組 8 0.0416±0.0024△△＊＊ 0.0418±0.0033 72h正常對照組組別 動物數(shù)(n)血清sICAM－1(OD值)再灌注24h 再灌注△△▲▲

表4 腦缺血－再灌注大鼠腦組織ICAM－1含量的變化(s)

表4 腦缺血－再灌注大鼠腦組織ICAM－1含量的變化(s)

注:與正常對照組比較，△△P＜0.01;與模型24h比較，＊＊P＜0.01，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01。

72h正常對照組組別 視野數(shù)腦組織ICAM－1表達量(%)(陽性區(qū)域面積百分比)再灌注24h 再灌注△△▲▲

2.4 腦組織ICAM－1含量(表4)與正常對照組比較，模型24h組和72h組腦組織ICAM－1含量均出現(xiàn)明顯升高(P＜0.01)。應(yīng)用抗體、清開靈、以及抗體加清開靈治療均可不同程度降低相應(yīng)時間點的缺血－再灌注后升高的腦組織ICAM－1含量，抗體72h組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但以上各組腦組織ICAM－1含量都未回復到正常水平，與正常對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。相比之下，抗體加清開靈組的療效最佳，其次為抗體組。各72h組腦組織ICAM－1含量也不同程度低于相應(yīng)的24h組。

3 討論

腦缺血－再灌注是一個復雜的、多因素的通過多種途徑產(chǎn)生損傷作用的病理過程。其中，多種細胞因子、黏附分子參與腦組織的損傷和修復［6－7］。全腦缺血－再灌注后，與再灌注有關(guān)的急性炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷中的作用日益受到重視［8］。

3.1 TNF－α TNF是一種多效細胞因子，在腦缺血過程中，TNF－α的大量表達促使白細胞在毛細血管及小血管中的聚集和黏附，而白細胞對血管內(nèi)皮的黏附是白細胞向壞死組織浸潤的初步階段。Lin等［9］的實驗表明TNF－α在腦缺血后引起的白細胞浸潤和組織損傷中起重要作用。TNF－α通過如下作用對缺血腦組織產(chǎn)生損傷［10－11］:1)與血管內(nèi)皮細胞相互作用改變其通透性;2)通過各種途徑增加白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附性，如TNF－α可通過上調(diào)ICAM－1(細胞間黏附分子－1)、CD11/CD18從而增強白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附作用;3)與內(nèi)皮細胞相互作用損傷內(nèi)皮啟發(fā)動凝血過程。

本實驗研究表明，腦缺血－再灌注損傷導致血清TNF－α含量明顯升高。清開靈對其有降低的趨勢。因我們所采用的TNF－α含量測定方法無法將血液中游離的TNF－α與結(jié)合了抗體的TNF－α相區(qū)別，結(jié)果顯示的是二者的總和。所以，抗體組及抗體加清開靈組在再灌不同時間點血清TNF－α含量出現(xiàn)的相反變化可能由以下原因造成:1)早期在血清中大量TNF－α被抗體中和以后，可能通過反饋調(diào)節(jié)導致更多TNF－α的產(chǎn)生，從而檢測結(jié)果有明顯升高;2)后期，TNF－α抗原抗體復合物逐漸被清除，從而檢測結(jié)果有明顯降低;3)使用TNF－α抗體可減輕該模型的血腦屏障損傷，使其通透性降低，從而神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元分泌的炎性介質(zhì)TNF－α漏出至外周血的數(shù)量減少。而這并非即時效應(yīng)，而是隨著時間延長而作用增強。

3.2 P－selectin P－selectin存在于血管內(nèi)皮細胞(CEC)的Weibel－Palade小體和血小板(PLT)的α－顆粒，是二者活化及血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)的標志，靜止的內(nèi)皮細胞和血小板不表達［12］。P－selectin主要通過激活中性粒細胞(PMN)在炎癥早期表達，通過鈣離子的參與來調(diào)節(jié)白細胞與內(nèi)皮細胞、血小板細胞黏附過程，介導PMN在活化內(nèi)皮細胞上的滾動，在炎癥晚期則同其他選擇素協(xié)同發(fā)揮作用。腦缺血－再灌注時，P－selectin可在幾分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)位于細胞表面，與中性白細胞表面的唾液酸化Lewisx作用，介導早期多形核白細胞在內(nèi)皮細胞上的低親和滾動。

本實驗結(jié)果表明，腦缺血－再灌注損傷時，P－selectin在炎癥早期表達，隨時間延長表達減弱。應(yīng)用抗體、清開靈、以及抗體加清開靈治療均可使相應(yīng)時間點的缺血－再灌注后升高的血清P－selectin含量顯著得以回復，但都未回復到正常水平。相比之下，抗體加清開靈組的療效最佳，其次為抗體組。由此我們懷疑是否應(yīng)用抗體對腦缺血－再灌注大鼠血清P－selectin有著較大的影響作用。應(yīng)用抗體各組的血清P－selectin無論24h還是72h均不同程度低于對應(yīng)的未應(yīng)用抗體的各組。因此，促進P－selectin表達可能是TNF－α在炎癥過程中發(fā)揮作用的途徑之一。

3.3 ICAM －1 近年來的研究結(jié)果表明［13－14］，在缺血性腦損傷的病理過程中存在著炎癥反應(yīng)。在缺血區(qū)腦組織，大量中性粒細胞和單核細胞聚集和浸潤，導致血腦屏障的破壞，引起腦組織水腫及神經(jīng)細胞的變性壞死。ICAM－1是表達于血腦屏障內(nèi)皮細胞的一種跨膜糖蛋白，它介導炎性細胞參與血腦屏障內(nèi)皮細胞損害的病理過程。但血腦屏障通透性改變與ICAM－1表達之間的關(guān)系尚未引起人們的重視。正常情況下，ICAM－1在腦組織微血管內(nèi)皮細胞僅有少量表達，在腦組織受損(如缺血、創(chuàng)傷及炎癥)時，在內(nèi)毒素及一些細胞因子如IL－1、TNF－α，γ－干擾素等的刺激下，其在血管內(nèi)皮的表達明顯升高［15］。

本實驗從血清含量和腦組織表達量兩個方面對ICAM－1進行了探討，結(jié)果如下:1)缺血－再灌注損傷后，血清sICAM－1含量明顯升高。應(yīng)用抗體、清開靈、以及抗體加清開靈治療均可顯著降低相應(yīng)時間點的缺血－再灌注后升高的血清sICAM－1含量，但都未回復到正常水平。從以上實驗結(jié)果可以看出，應(yīng)用抗體和清開靈均可通過降低腦組織微血管內(nèi)皮細胞ICAM－1的表達而抑制黏附分子所介導的炎性損傷作用。是否應(yīng)用抗體對腦缺血－再灌注大鼠血清sICAM－1含量有著一定的影響作用。由此驗證了TNF－α與ICAM－1具有一定的相關(guān)性。ICAM－1可能是在TNF－α的刺激下，在血管內(nèi)皮的表達出現(xiàn)升高。2)缺血－再灌注損傷后，腦組織ICAM－1含量明顯升高。應(yīng)用抗體、清開靈、以及抗體加清開靈治療均可不同程度降低相應(yīng)時間點的缺血－再灌注后升高的腦組織ICAM－1含量，除抗體72h組作用較顯著外，其余各組作用顯著。但以上各組腦組織ICAM－1含量都未回復到正常水平。相比之下，抗體加清開靈組的療效最佳，其次為抗體組。各72h組腦組織ICAM－1含量明顯低于相應(yīng)的24h組。是否應(yīng)用抗體對腦缺血－再灌注大鼠腦組織ICAM－1含量有著一定的影響作用。

應(yīng)用清開靈以及TNF－α單克隆抗體均能通過抑制TNF－α而影響ICAM－1和P－selectin的表達，從而阻抑它們進一步所介導的炎細胞黏附及內(nèi)皮損傷，減輕腦組織的炎性損傷。本實驗結(jié)果為清開靈的解毒通絡(luò)病機提供了實驗依據(jù)。

［1］許沛虎，涂晉文.愈風湯對大鼠腦缺血/再灌流后腦含水量及腦組織鉀鈉鈣含量的影響.中國實驗方劑學雜志，1997，3(2):18－20.

［2］劉清和，曾慶杏，余紹祖.抗腫瘤壞死因子－α單克隆抗體對缺血－再灌注大鼠腦損傷影響的實驗研究.中風與神經(jīng)疾病雜志，1999，16(4):208－210.

［3］李旦，孫桂蓮，史金陽.腫瘤壞死因子－α多克隆抗體對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用研究.臨床神經(jīng)病學雜志，1999，12(1):15－17.

［4］張貴斌，余紹祖，黃本友.黏附分子在腦缺血再灌注損傷中的作用.卒中與神經(jīng)疾病，2001，8(4):256 －258.

［5］田玉科，吳震.6%經(jīng)乙基淀粉血液稀釋對大鼠全腦缺血/再灌注后ICAM－1表達的影響.中華麻醉學雜志，2002，22(1):734－736.

［6］Williams AJ Bertir，Dave JR，et al.Delayed treatment of ischemia/reperfusion brain injury，Stroke，2004，35(5):1186 －1191.

［7］atriotomo I，Bowen KK，Vemuganti R.JAK 2 and STAT 3 activation contributes to neuronal damage following transient focal cerebral ischemia.J Neurochem，2006，98(5):1353 －1368.

［8］高劍峰，李建生，周友龍.腦脈通對老齡大鼠腦缺血再灌注炎癥級聯(lián)反應(yīng)的影響.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23(7):583－586.

［9］Lin HY，Huang CC，Chang KF，Lipopolysaccharide proconditioning reduces neuroinflammation against hypoxic ischemia and prorideslong－－term outcome of neuroprotection in neonatal rat.Pediatr Res，2009，66(3):254－259.

［10］張娜，朱曉磊，李澎濤.膽酸、梔子苷及配伍對大鼠缺血再灌注腦組織TNF－α、IL－1β和ICAM－1含量的影響.中國醫(yī)藥學報，2003，13(8):463－465.

［11］雷軍榮，秦軍，張晶.姜黃素對大鼠缺血性腦損傷炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的影響.中國藥理學通報，2010，26(1):120－12.

［12］高帆，聶亞雄.P－選擇素與缺血性腦卒中.神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2009，9(2):174 －177.

［13］Stammirovic D，Satoh K.Inflammatory mediators of cerebral endothelium:a role in ischemic brain inflammation.Brain Pathol，2000，10(1):113－126.

［14］丁麗君，董志.腦缺血－再灌注損傷中炎性反應(yīng)的研究進展.中國腦血管病雜志，2009，6(11):611 －616.

［15］Kanemoto Y，Nakase H.Akita N，et al.Effects of anti－ intercellular adhesion molecule－1 antibody on reperfusion injury induced by late reperfusion in the rat middle cerebral artery occlusion model.Neurosurgery，2002，51(4):1034 －1042.